Protective Mechanism of Danggui Shaoyaosan on Podocytes of Nephrotic Syndrome Rats Based on AngⅡ-TRPC6 Pathway

Man-man LI; Fan XU; Shi-ping FU; Jing HOU; Ye FENG; Zai-ping XU; Liang-hou NI; Yun-lai WANG; Zi-hua XUAN

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20211936

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Protective Mechanism of Danggui Shaoyaosan on Podocytes of Nephrotic Syndrome Rats Based on AngⅡ-TRPC6 Pathway

更新时间：2021-09-07

- Protective Mechanism of Danggui Shaoyaosan on Podocytes of Nephrotic Syndrome Rats Based on AngⅡ-TRPC6 Pathway
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 27, Issue 19, Pages: 9-18(2021)
- 作者机构：
  
  1.安徽中医药大学药学院，合肥 230012
  2.中药复方安徽省重点实验室，合肥 230012
  3.上海市第八人民医院，上海 200235
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20211936
  CLC： R2-0;R692;R33
- Received：16 June 2021，
  
  Published Online：09 August 2021，
  
  Published：05 October 2021
- 稿件说明：
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李曼曼,许钒,付士平等.基于AngⅡ/TRPC6通路探讨当归芍药散对肾病综合征大鼠足细胞的保护机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(19):9-18.

LI Man-man,XU Fan,FU Shi-ping,et al.Protective Mechanism of Danggui Shaoyaosan on Podocytes of Nephrotic Syndrome Rats Based on AngⅡ-TRPC6 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(19):9-18.
李曼曼,许钒,付士平等.基于AngⅡ/TRPC6通路探讨当归芍药散对肾病综合征大鼠足细胞的保护机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(19):9-18. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211936.

LI Man-man,XU Fan,FU Shi-ping,et al.Protective Mechanism of Danggui Shaoyaosan on Podocytes of Nephrotic Syndrome Rats Based on AngⅡ-TRPC6 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(19):9-18. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211936.

摘要

目的

探究当归芍药散（DSS）对肾病综合征（NS）大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和瞬时受体电位阳离子通道6（TRPC6）通路的影响和保护作用。

方法

动物实验，160只SD大鼠通过2次尾静脉注射阿霉素（第1周4 mg·kg

-1

，第2周2 mg·kg

-1

）诱导NS模型，分为模型组（给予生理盐水），氯沙坦组（30 mg·kg

-1

·d

-1

），DSS低、中、高剂量组（4.3，8.6，17.2 g·kg

-1

·d

-1

），同时设置正常组。给药4周干预后，透射电镜观察肾脏超微病理改变，试剂盒检测24 h尿蛋白；同时用放射免疫法检测血浆中AngⅡ，钙调神经磷酸酶（CaN）含量的变化，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠肾皮质中TRPC6，血管紧张素Ⅱ 1型受体（AT1R），足细胞裂孔隔膜特异蛋白（Nephrin），天冬氨酸半胱氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）蛋白表达，免疫组化检测狭缝隔膜中TRPC6，AT1R的表达分布情况。细胞实验，通过AngⅡ刺激MPC5足细胞，随机分为正常组，AngⅡ组，AngⅡ+TRPC6特异性抑制剂SAR7334组，AngⅡ+5%DSS组，AngⅡ+10%DSS组，AngⅡ+15%DSS组，Western blot检测细胞TRPC6，AT1R，Nephrin，Caspase-3蛋白表达。

结果

与正常组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白含量显著升高（

0.01），血浆AngⅡ，CaN含量显著升高（

0.01），肾小球结构不完整，足突广泛融合，足突融合率显著增加（

0.01），肾皮质中AT1R，TRPC6表达分布增多，肾组织中AT1R，TRPC6，Caspase-3蛋白水平显著增高（

0.01），Nephrin蛋白水平显著降低（

0.01）；与模型组比较，氯沙坦组和DSS高剂量组24 h尿蛋白含量显著降低（

0.01），血浆AngⅡ，CaN含量显著降低（

0.01），肾小球结构改善，足突融合率显著降低（

0.01），TRPC6，AT1R在肾皮质中的表达分布减少，肾组织AT1R，TRPC6，Caspase-3蛋白水平显著降低（

0.01），Nephrin蛋白水平显著升高（

0.01）；同时与正常足细胞比较，AngⅡ刺激后足细胞AT1R，TRPC6，Caspase-3的蛋白表达水平显著增加（

0.01），Nephrin表达水平下降（

0.01）；而与AngⅡ组足细胞比较，SAR7334组足细胞AT1R，TRPC6，Caspase-3蛋白水平显著降低（

0.01），Nephrin蛋白水平升高（

0.01）。

结论

DSS可以改善NS病理特征，可能是通过抑制足细胞内AngⅡ与TRPC6的相互作用，进而改善足细胞结构完整性，修复肾小球分子屏障损伤，减缓NS蛋白尿的发展进程。

Abstract

Objective

To explore the protective effect and the mechanism of Danggui Shaoyaosan（DSS） on angiotensin Ⅱ （AngⅡ）/transient receptor potential cation channel 6 （TRPC6） pathway in nephrotic syndrome （NS） rats.

Method

In animal experiments， doxorubicin （4 mg·kg

-1

for the 1

week and 2 mg·kg

-1

for the 2

week） was injected twice to the tail vein of rats to induce NS model in 160 rats， which were then randomly divided into model group （normal saline）， losartan group （30 mg·kg

-1

·d

-1

）， and low-（4.3 g·kg

-1

·d

-1

）， medium-（8.6 g·kg

-1

·d

-1

）， and high-dose （17.2 g·kg

-1

·d

-1

） DSS groups. Besides， a normal group was also set. After intervention for four weeks， ultrastructure changes of the kidney were identified by transmission electron microscopy （TEM）. The 24-hour urine protein was detected by kits. Radioimmunoassay was used to detect the content of AngⅡ and Calcineurin （CaN） in plasma. Western blot was used to detect the protein expression of TRPC6， angiotensin Ⅱ type 1 receptor （AT1R）， podocyte slit diaphragm-specific protein （Nephrin）， and cysteine-aspartic acid protease-3 （Caspase-3） in the renal cortex. Immunohistochemistry was used to detect the expression of TRPC6 and AT1R in the slit diaphragm. In cell experiments， AngⅡ stimulated MPC5 podocytes. The cells were randomly divided into a normal group， an AngⅡ group， an AngⅡ+SAR7334 （TRPC6-specific inhibitor） group， an AngⅡ+5%DSS group， an AngⅡ+10%DSS group， and an AngⅡ+15%DSS group. Western blot was used to detect the protein expression of TRPC6， AT1R， Nephrin， and Caspase-3 in podocytes.

Result

Compared with the normal group， the model group showed increased 24-hour urine protein content （

0.01） and AngⅡ and CaN in plasma （

0.01）， incomplete glomerular structure， the extensive fusion of podocyte process with elevated fusion rate （

0.01）， increased expression distribution of AT1R and TRPC6 in the renal cortex， and up-regulated protein expression of AT1R， TRPC6， and Caspase-3 in renal tissues （

0.01）， and reduced Nephrin protein expression （

0.01）. Compared with model group， the losartan group and the high-dose DSS group exhibited decreased 24-hour urine protein content （

0.01） and the content of AngⅡ and CaN in plasma （

0.01）， improved glomerular structure， reduced fusion rate of podocyte process （

0.01）， diminished expression distribution of TRPC6 and AT1R in the renal cortex， declining protein expression of AT1R， TRPC6 and Caspase-3 in renal tissues （

0.01）， and elevated Nephrin protein expression （

0.01）. Additionally， compared with the normal podocytes， AngⅡ-stimulated podocytes showed increased protein expression of AT1R， TRPC6 and Caspase-3 （

0.01）， and decreased expression of Nephrin （

0.01）. Compared with the AngⅡ group， the AngⅡ+SAR7334 group displayed reduced protein expression of AT1R， TRPC6， and Caspase-3 （

0.01） and increased protein expression of Nephrin （

0.01）.

Conclusion

DSS can improve the pathological characteristics of NS presumedly by inhibiting the interaction between AngⅡ and TRPC6 in podocytes and improving the structural integrity of podocytes to repair the damage of glomerular molecular barrier and slow down the progression of NS-induced proteinuria.

关键词

Keywords

references

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