Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway

Qiao-lan WU; Ting SONG; Ze-tao CHEN; Xiu-bao CHEN; Yi-chen ZHANG; Wei-da CHEN

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20212121

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Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway

更新时间：2021-10-21

- Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 27, Issue 22, Pages: 65-75(2021)
- 作者机构：
  
  1.山东中医药大学第一临床医学院，济南 250014
  2.山东中医药大学附属医院，济南 250014
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20212121
  CLC： R22;R242;R2-031;R285.5
- Received：27 July 2021，
  
  Published Online：02 September 2021，
  
  Published：20 November 2021
- 稿件说明：
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吴俏兰,宋婷,陈泽涛等.基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(22):65-75.

WU Qiao-lan,SONG Ting,CHEN Ze-tao,et al.Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(22):65-75.
吴俏兰,宋婷,陈泽涛等.基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(22):65-75. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212121.

WU Qiao-lan,SONG Ting,CHEN Ze-tao,et al.Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(22):65-75. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212121.

摘要

目的

探讨益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的作用及机制。

方法

制备益气扶正解毒汤含药血清干预A549肺癌细胞。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测A549细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3），自噬关键分子酵母Atg6同系物1（Beclin1），p62，p53蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），磷酸化AMPK（p-AMPK），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白的水平，免疫荧光（IF）检测微管相关蛋白1A/1B轻链3B（MAP1LC3B）蛋白水平，5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EDU）染色、侵袭实验（Transwell）和

-半乳糖苷酶染色分别检测含药血清对细胞增殖、侵袭、衰老情况的影响；设置自噬抑制剂甲基腺嘌呤（3-MA，5 mmol·L

-1

）干预组，即分为10%胎牛血清组（空白组），10%正常血清组（正常组），10%含药血清低、中、高剂量组，10%高剂量含药血清加3-MA（高剂量+3-MA）组，检测各组细胞增殖、侵袭、衰老水平；并设置p53抑制剂（PFT-

， 10 μmol·L

-1

）组，即分为正常组，PFT-

组，高剂量组，高剂量+PFT-

组，检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin1表达水平和MAP1LC3B免疫荧光强度及各组细胞增殖、侵袭、衰老的情况。

结果

与空白组、正常组比较，干预A549细胞48 h，益气扶正解毒汤中、高剂量组LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白水平呈剂量依赖性升高（

0.01）；益气扶正解毒汤低、中、高剂量组p62，p-mTOR/mTOR蛋白下降（

0.05，

0.01），p53，p-AMPK/AMPK蛋白表达升高（

0.01）；益气扶正解毒汤低、中、高剂量组A549细胞增殖、侵袭数量明显降低，细胞衰老数量显著增多（

0.01），同时MAP1LC3B免疫荧光强度增强，且益气扶正解毒汤高剂量组效果最佳；与益气扶正解毒汤高剂量组比较，益气扶正解毒汤高剂量+3-MA组、益气扶正解毒汤高剂量+PFT-

组发生增殖、侵袭的细胞数量均增加，而发生衰老的细胞数量明显减少（

0.05，

0.01），同时，高剂量+PFT-

组的MAP1LC3B免疫荧光强度减弱及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin1蛋白表达水平降低（

0.05，

0.01）。

结论

益气扶正解毒汤可经p53/AMPK信号通路上调A549细胞自噬水平，进而抑制A549细胞增殖、侵袭迁移，促进细胞衰老，在抑制肺癌进展中具有重要作用。

Abstract

Objective

To investigate the effect and mechanism of Yiqi Fuzheng Jiedu decoction （YQFZJDD） on autophagy and growth of A549 cells.

Method

A549 cells were intervened with YQFZJDD-containing serum prepared in advance. The levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， homologue of yeast autophagy-related gene 6 （Beclin1）， p62， p53， adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase （AMPK）， phosphorylated AMPK （p-AMPK）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， and phosphorylated mTOR （p-mTOR） were detected by Western blot assay， and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B （MAP1LC3B） by immunofluorescence （IF） assay. The proliferation， invasion， and senescence of A549 cells were separately measured by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EDU） staining， Transwell assay， and

-galactosidase staining. In the presence of autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA， 5 mmol·L

-1

）， the cells were divided into the 10% fetal bovine serum （blank） group， 10% control serum （control） group， low-， medium-， and high-dose 10% YQFZJDD-containing serum groups， and high-dose 10% YQFZJDD-containing serum + 3-MA group， followed by the measurement of A549 cell proliferation， invasion， and senescence. In the adoption of p53 inhibitor Pifithrin-

（PFT-

， 10 μmol·L

-1

）， the cells were divided into the control group， PFT-

group， high-dose YQFZJDD-containing serum group， and high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group. Then the LC3-Ⅱ and Beclin1 expression， MAP1LC3B fluorescence intensity， as well as A549 cell proliferation， invasion and senescence were determined.

Result

Compared with the blank group and control group， YQFZJDD-containing serum at the medium and high doses up-regulated the protein expression levels of LC3-Ⅱ and Beclin1 in A549 cells after 48-h intervention in a dose-dependent manner （

0.01）. Besides， YQFZJDD-containing serum at the low-， medium-， and high-doses down-regulated p62 and p-mTOR/mTOR expression （

0.05，

0.01）， elevated p53 and p-AMPK/AMPK （

0.01）， decreased the number of proliferative and invasive cells， increased the number of senescent cells （

0.01）， and enhanced the IF intensity of MAP1LC3B， with the optimal effect observed in the high-dose YQFZJDD-containing serum group （

0.01）. Compared with the high-dose YQFZJDD-containing serum group， the high-dose YQFZJDD-containing serum + 3-MA group and high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group exhibited significantly increased proliferative and invasive cells but decreased senescent cells （

0.05，

0.01）. Meanwhile， the IF intensity of MAP1LC3B in the high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group was weakened and the LC3-Ⅱ and Beclin1 protein expression levels declined （

0.05，

0.01）.

Conclusion

YQFZJDD promotes the autophagy of A549 cells through the p53/AMPK signaling pathway to inhibit their proliferation， invasion and migration but accelerate senescence， thus playing a crucial role in inhibiting the progression of lung cancer.

关键词

Keywords

references

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