Mechanism of Linggui Zhugantang in Repairing Blood-brain Barrier Injury of Alzheimer's Disease

Zi-wei WANG; Xi-bin ZHOU; Ju DENG; Yun LING; Chun-xiang ZHOU

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20212404

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Mechanism of Linggui Zhugantang in Repairing Blood-brain Barrier Injury of Alzheimer's Disease

更新时间：2022-01-04

- Mechanism of Linggui Zhugantang in Repairing Blood-brain Barrier Injury of Alzheimer's Disease
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 1, Pages: 16-23(2022)
- 作者机构：
  
  南京中医药大学中医学院中西医结合学院，南京 210046
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20212404
  CLC： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- Received：19 July 2021，
  
  Published Online：26 October 2021，
  
  Published：05 January 2022
- 稿件说明：
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王紫薇,周西彬,邓菊等.苓桂术甘汤对阿尔茨海默病血脑屏障损伤的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(01):16-23.

WANG Zi-wei,ZHOU Xi-bin,DENG Ju,et al.Mechanism of Linggui Zhugantang in Repairing Blood-brain Barrier Injury of Alzheimer's Disease[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(01):16-23.
王紫薇,周西彬,邓菊等.苓桂术甘汤对阿尔茨海默病血脑屏障损伤的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(01):16-23. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212404.

WANG Zi-wei,ZHOU Xi-bin,DENG Ju,et al.Mechanism of Linggui Zhugantang in Repairing Blood-brain Barrier Injury of Alzheimer's Disease[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(01):16-23. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212404.

摘要

目的

通过观察苓桂术甘汤（LG）对体外阿尔茨海默病（AD）病理状态下血脑屏障模型的影响，探讨其对AD血脑屏障损伤后修复的具体机制。

方法

将50只雄性SPF级大鼠，随机分为5组，分别灌胃7 d，2次/d，LG高、中、低剂量组以4.8，2.4，1.2 g·kg

-1

，西药组以盐酸多奈哌齐0.5 mg·kg

-1

，正常组以等体积生理盐水灌胃，末次灌胃1 h后经腹主动脉取含药血清；以细胞共培养法构建AD体外血脑屏障损伤模型，实验分为正常组，模型组，LG高、中、低剂量组和盐酸多奈哌齐组，模型组加入

淀粉样蛋白1-42（A

1-42

）100 μL，终浓度为5 μmol·L

-1

，LG高、中、低剂量组以及盐酸多奈哌齐组在模型组基础上分别加入10%含药血清。通过噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞存活率；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定各组血脑屏障相关骨架蛋白跨膜密蛋白-5（Claudin-5），外周支架蛋白-1（ZO-1），闭合蛋白（Occludin），基质金属蛋白酶-2（MMP-2），基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测炎症因子白细胞介素-1

（IL-1

），IL-6，肿瘤坏死因子-

（TNF-

）的含量变化；采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和Western blot检测LG高、中、低剂量组血脑屏障不同时间点A

转运蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）表达。

结果

MTT结果分析显示，与正常组比较，模型组细胞存活率明显下降（

0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和LG高剂量组细胞存活率明显增强（

0.05）；Western blot结果分析显示，与正常组比较，模型组骨架蛋白显著下调，MMP-2，MMP-9蛋白明显上调（

0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和LG高剂量骨架蛋白含量明显上调（

0.05），MMP-2，9水平明显下降（

0.05）；与模型组比较，仅LG中剂量组Claudin-5蛋白水平明显上调（

0.05），MMP-2水平明显下调（

0.05）；ELISA结果分析显示，与正常组比较，模型组IL-1

，IL-6，TNF-

含量明显上调（

0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和LG高、中剂量组IL-1

，IL-6，TNF-

表达明显下调（

0.05）；PCR结果分析显示，与0 h比较，3 h时LRP-1表达明显上调，RAGE表达明显下调（

0.05），6，12，24，36 h后LRP-1，RAGE表达逐渐和缓；Western blot结果分析显示，3 h时，与正常组比较，模型组LRP-1含量明显下调，RAGE含量明显上调（

0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和LG高剂量组LRP-1含量显著上调，RAGE含量明显下调（

0.05）。

结论

LG对AD体外血脑屏障损伤具有修复作用，其机制可能与抑制炎症因子和MMP-2，MMP-9表达、促进骨架蛋白表达并调节转运蛋白平衡相关。

Abstract

Objective

To observe the effect of Linggui Zhugantang （LG） on the blood-brain barrier （BBB） model of Alzheimer's disease （AD）

in vitro

and to explore the mechanism of LG in repairing the BBB injury in AD.

Method

A total of 50 male SPF rats were randomized into five groups： high-dose （4.8 g·kg

-1

）， medium-dose （2.4 g·kg

-1

）， and low-dose （1.2 g·kg

-1

） LG groups， western medicine （0.5 g·kg

-1

donepezil hydrochloride） group， and normal group （normal saline of equivalent volume）. They received （

） corresponding drugs twice a day for 7 d. Drug-containing serum was respectively collected from the abdominal aorta 1 h after the last administration. The BBB injury of AD

in vitro

was induced with the cell co-culture method， and 6 groups were designed： normal group， model group， high-， medium-， and low-dose LG groups， and western medicine group. The model group was added with 100 μL amyloid

1-42

（A

1-42

， final concentration： 5 μmol·L

-1

）， and high-dose， medium-dose， and low-dose LG groups and the western medicine group were added with corresponding 10% drug-containing serum in addition to the 100 μL A

1-42

（final concentration： 5 μmol·L

-1

）. Cell survival rate was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay， expression of BBB-related skeleton proteins （claudin-5， ZO-1， occludin）， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）， and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） by Western blot， and content of inflammatory factors interleukin-1

（IL-1

）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-

（TNF-

） by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. BBB A

transporter low-density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP-1） and advanced glycation end product receptor （RAGE） at different time points in high-dose， medium-dose， and low-dose LG groups were determined by Real-time PCR and Western blot.

Result

Cell survival rate of the model group was lower than that of the normal group （

0.05） and the survival rates of the western medicine group and high-dose LG group was higher than that in the model group （

0.05）. The skeleton proteins were down-regulated and MMP-2 and MMP-9 were up-regulated in the model group compared with those in the normal group （

0.05）. The expression of skeleton proteins was higher （

0.05） and that of MMP-2 and MMP-9 was lower （

0.05） in the western medicine group and high-dose LG group than in the model group. Compared with the model group， only the medium-dose LG group showed the up-regulation （

0.05） of claudin-5 （

0.05） and the decrease （

0.05） of MMP-2. IL-1

， IL-6， and TNF-

in the model group were up-regulated （

0.05） compared with those in the normal group， and those inflammatory factors in the western medicine group and high-dose and medium-dose LG groups were lower （

0.05） than those in the model group. LRP-1 expression was up-regulated and RAGE expression was down-regulated at 3 h compared with those at 0 h （

0.05）， while the expression of the two became stable at 6， 12， 24， 36 h. At 3 h， LRP-1 expression was down-regulated and RAGE expression was up-regulated in model group compared with those in the normal group at 3 h （

0.05）. Moreover， the LRP-1 content was higher and RAGE content was lower in the western medicine group and high-dose LG group than in the model group.

Conclusion

LG can repair the BBB injury

in vitro

by inhibiting the expression of inflammatory factors and MMP-2， MMP-9， promoting the expression of skeletal proteins， and regulating the balance of transporters.

关键词

Keywords

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