Effect and Mechanism of Xianlian Jiedu Prescription Against Proliferation of Colorectal Cancer Cells in Hypoxic Microenvironment

JIANG Rui-yang; XU Chang-liang; CHENG Hai-bo; SHEN Wei-xing; FAN Min-min; TAN Jia-ni; LAI Yue-yang; YU Cheng-tao; SUN Dong-dong; LI Liu

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20220422

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Effect and Mechanism of Xianlian Jiedu Prescription Against Proliferation of Colorectal Cancer Cells in Hypoxic Microenvironment

更新时间：2023-05-17

- Effect and Mechanism of Xianlian Jiedu Prescription Against Proliferation of Colorectal Cancer Cells in Hypoxic Microenvironment
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 8, Pages: 79-85(2022)
- 作者机构：
  
  1.南京中医药大学第一临床医学院，南京 210023
  2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，南京 210023
  3.南京中医药大学医学院·整合医学学院，南京 210023
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20220422
  CLC： R22;R242;R2-031;R285.5
- Received：05 September 2021，
  
  Published Online：12 December 2021，
  
  Published：20 April 2022
- 稿件说明：
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姜瑞阳,徐长亮,程海波等.缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(08):79-85.

JIANG Rui-yang,XU Chang-liang,CHENG Hai-bo,et al.Effect and Mechanism of Xianlian Jiedu Prescription Against Proliferation of Colorectal Cancer Cells in Hypoxic Microenvironment[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(08):79-85.
姜瑞阳,徐长亮,程海波等.缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(08):79-85. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220422.

JIANG Rui-yang,XU Chang-liang,CHENG Hai-bo,et al.Effect and Mechanism of Xianlian Jiedu Prescription Against Proliferation of Colorectal Cancer Cells in Hypoxic Microenvironment[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(08):79-85. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220422.

摘要

目的

观察缺氧微环境下仙连解毒方对含溴结构域蛋白4（Brd4）诱导的核转录因子-

B（NF-

B）信号通路激活的影响，探讨其抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的作用机制。

方法

于缺氧培养箱或常氧培养箱中培养人结直肠癌细胞HT-29，给予仙连解毒方（0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L

-1

）干预细胞48 h，采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力；采用线粒体膜电位荧光探针（JC-1）检测仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L

-1

）对细胞线粒体膜电位的影响，采用流式细胞术检测结直肠癌细胞HT-29凋亡情况；细胞克隆形成实验及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU）法检测结直肠癌细胞HT-29细胞增殖能力；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Brd4及其下游蛋白如c-核蛋白类基因（c-Myc）、六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1（HEXIM1）的表达水平，同时检测仙连解毒方对NF-

B信号通路相关蛋白的影响。

结果

与空白组比较，仙连解毒方（0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L

-1

）组均能抑制结直肠癌细胞HT-29细胞活力（

0.05，

0.01），且缺氧培养下细胞半数抑制浓度（IC

）

常氧培养组。与空白组比较，仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L

-1

）组细胞线粒体膜电位明显下降、细胞凋亡增多（

0.05，

0.01）。与空白组比较，仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L

-1

）组细胞克隆数减少，EDU阳性细胞数减少（

0.05，

0.01）。Western blot结果示，与空白组比较，仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L

-1

）组细胞内Brd4、c-Myc蛋白表达量均有不同程度的下降，HEXIM1表达升高（

0.05，

0.01）；磷酸化（p）-NF-

B p65、磷酸化NF-

B抑制蛋白

（p-I

）蛋白表达下调（

0.05，

0.01）。

结论

缺氧微环境下仙连解毒方可抑制Brd4调控的结直肠癌细胞HT-29增殖，抑制NF-

B信号通路的激活可能是其机制之一。

Abstract

Objective

To study the effect of Xianlian Jiedu prescription （XLJDP） on the activation of nuclear transcription factor-

B （NF-

B） signaling pathway induced by bromodomain-containing protein 4 （Brd4） in hypoxic microenvironment and to explore its mechanism in inhibiting the proliferation of colorectal cancer HT-29 cells.

Method

The human colorectal cancer HT-29 cells were cultured in a hypoxic incubator or normoxia incubator and treated with XLJDP at 0.8，1，1.2，1.6，3.2，6.4，and 12.8 g·L

-1

for 48 h， respectively. Following the detection of cell vitality using methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） colorimetry， the effects of XLJDP （1.25，2.5，and 5 g·L

-1

） on the cell mitochondrial membrane potential were determined using a fluorescent probe （JC-1）， and the apoptosis of colorectal cancer HT-29 cells was detected by flow cytometry. The cell colony formation assay and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EDU） staining were conducted to test the proliferation of colorectal cancer HT-29 cells. The Western blot was carried out to measure the expression levels of Brd4 and its downstream relevant proteins such as c-Myc and hexamethylene bisacetamide-inducible protein 1 （HEXIM1）， as well as the effects of XLJDP on related proteins in the NF-

B signaling pathway.

Result

Compared with the blank control group， XLJDP at 0.8，1，1.2，1.6，3.2，6.4，and 12.8 g·L

-1

inhibited the vitality of colorectal cancer HT-29 cells （

0.05 ，

0.01）， with the median inhibitory concentration （IC

） under the hypoxic condition higher than that under the normoxia condition. Compared with the blank control group， XLJDP at 1.25，2.5，and 5 g·L

-1

significantly decreased the mitochondria membrane potential， enhanced the apoptosis （

0.05，

0.01）， and lowered the number of cell colonies and also the EDU-positive cells （

0.05，

0.01）. The results of Western blot showed that compared with the blank control group， XLJDP at 1.25，2.5，and 5 g·L

-1

down-regulated Brd4， c-Myc， p-NF-

B p65， and p-I

protein expression to varying degrees and up-regulated the expression of HEXIM1 （

0.05，

0.01）.

Conclusion

In the hypoxic microenvironment， XLJDP inhibits the proliferation of colorectal cancer HT-29 cells regulated by Brd4， which may be related to its inhibition of the activation of NF-

B signaling pathway.

关键词

Keywords

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