Mechanism of Xiao Qinglongtang Regulating Lung Water Transport-related Proteins Based on Theory of Lung Controlling Water Movement

ZHANG Di; ZHANG Dong-mei; LU Rui-min; JI Jing; XU Zong-ying; WANG Xu; CHEN Meng

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20220736

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Mechanism of Xiao Qinglongtang Regulating Lung Water Transport-related Proteins Based on Theory of Lung Controlling Water Movement

更新时间：2023-05-17

- Mechanism of Xiao Qinglongtang Regulating Lung Water Transport-related Proteins Based on Theory of Lung Controlling Water Movement
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 8, Pages: 1-11(2022)
- 作者机构：
  
  1.北京中医药大学中医学院，北京 100029
  2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20220736
  CLC： R2-0;R33;R289;R318.13
- Received：30 September 2021，
  
  Published Online：09 February 2022，
  
  Published：20 April 2022
- 稿件说明：
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张迪,张冬梅,陆瑞敏等.基于“肺主行水”理论探究小青龙汤调节肺水转运蛋白的作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(08):1-11.

ZHANG Di,ZHANG Dong-mei,LU Rui-min,et al.Mechanism of Xiao Qinglongtang Regulating Lung Water Transport-related Proteins Based on Theory of Lung Controlling Water Movement[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(08):1-11.
张迪,张冬梅,陆瑞敏等.基于“肺主行水”理论探究小青龙汤调节肺水转运蛋白的作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(08):1-11. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220736.

ZHANG Di,ZHANG Dong-mei,LU Rui-min,et al.Mechanism of Xiao Qinglongtang Regulating Lung Water Transport-related Proteins Based on Theory of Lung Controlling Water Movement[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(08):1-11. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220736.

摘要

目的

观察小青龙汤及其方元对于肺水转运蛋白的调节作用，初步阐释“肺主行水”的生物学内涵，并从该角度探索其作用机制。

方法

根据经方的组方规律，将小青龙汤（11.22 g·kg

-1

）拆分为桂枝甘草（2.70 g·kg

-1

）、芍药甘草（2.70 g·kg

-1

）、姜辛味（3.90 g·kg

-1

）、半夏麻黄（3.27 g·kg

-1

） 4个方元。通过“形寒+饮冷+冷水浴”法建立寒饮蕴肺证大鼠病理模型，给予小青龙汤及其方元进行干预。肺功能分析系统测定大鼠用力肺活量（FVC）、功能残气量（FRC）、平均呼气中期流量（MMEF）、吸气时间（tI）和呼气时间（tE）等参数；苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肺组织病理形态学改变；免疫组化法（IHC）检测大鼠肺组织中水通道蛋白（AQP）1、AQP5、上皮细胞钠通道

亚单位（

-ENaC）和钠钾泵（Na

-K

-ATPase）表达；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肺组织中肿瘤坏死因子-

（TNF-

）含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肺组织中环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）mRNA分子表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织中cAMP、PKA、CREB和磷酸化（p）-CREB蛋白表达。

结果

与正常组比较，模型组大鼠FVC、FRC和MMEF功能显著下降（

0.01），tI与tE时间明显延长（

0.05，

0.01）；肺组织中TNF-

含量显著升高（

0.01）；肺组织中cAMP、PKA、CREB mRNA及蛋白表达显著降低（

0.01）；肺组织中AQP5及

-ENaC表达明显减少；大鼠肺泡腔内充满水肿液，周围组织充血，炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮黏连。与模型组比较，小青龙汤及其方元组可以明显增强模型大鼠FVC、FRC与MMEF功能（

0.05，

0.01），部分方元组可缩短tI与tE时间（

0.05，

0.01）；小青龙汤组、桂枝甘草组及半夏麻黄组肺组织TNF-

的含量显著下调（

0.01）；小青龙汤组cAMP、PKA和CREB的mRNA的表达显著上调（

0.01），桂枝甘草组、姜辛味组及半夏麻黄组显著上调cAMP和PKA的mRNA表达（

0.01）；小青龙汤组、桂枝甘草组、姜辛味组及半夏麻黄组显著上调cAMP、PKA和CREB的蛋白表达（

0.01），芍药甘草组明显上调CREB蛋白的表达（

0.05）；小青龙汤可以上调AQP5和

-ENaC的阳性表达，桂枝甘草组可以上调

-ENaC的阳性表达；小青龙汤及其方元各组可以减少模型大鼠肺组织水肿，炎性细胞浸润明显减少，支气管黏膜黏连程度减轻。

结论

小青龙汤及其方元可以通过提高肺水转运相关蛋白AQP1、AQP5和

-ENaC的表达，减轻寒饮蕴肺证大鼠病理模型中肺水肿，抑制肺部炎症状态，改善大鼠肺功能，从而恢复肺脏的生理功能，cAMP/PKA信号通路可能参与了该过程，Na

-K

-ATPase在肺水转运调节中可能发挥了辅助作用，从肺水转运相关蛋白角度初步阐释“肺主行水”的内涵具有一定的客观依据。

Abstract

Objective

To observe the regulatory effect of Xiao Qinglongtang and its ingredients on lung water transport-related proteins， and to explain the biological connotation of lung governing water movement， based on which the regulatory mechanism of Xiao Qinglongtang will be explored.

Method

According to the composition rules of classical formula， Xiao Qinglongtang （11.22 g·kg

-1

）， Guizhi Gancao （2.70 g·kg

-1

）， Shaoyao Gancao （2.70 g·kg

-1

）， Jiangxinwei （3.90 g·kg

-1

）and Banxia Muahuang （0.032 7 g·kg

-1

） were prepared. The pathological model of syndrome of cold fluid accumulated in lung of rats was established by the "coldness of body + drinking cold + cold bath" method， and Xiao Qinglongtang and its ingredients were administrated to intervene with the model rats. Lung function parameters of forced vital capacity （FVC）， functional residual capacity （FRC）， mean mid-expiratory flow （MMEF）， inspiratory time （tI）， and inspiratory time （tE） were determined by lung function analyzer. Hematoxylin and eosin （HE） staining was used to observe the changes in pathological morphology. The expression of aquaporin （AQP）1， AQP5， epithelial sodium channel

subunit（

-ENaC） and Na

-K

-ATPase in lung tissues of rats， the content of tumor necrosis factor -

（TNF-

）， the mRNA expression of cyclic adenosine monophosphate （cAMP）， protein kinase A （PKA） and cAMP-response element binding protein （CREB）， and the protein expression of cAMP， PKA， CREB， and phosphorylated-CREB （p-CREB） were detected by immunohistochemistry （IHC）， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR）， and Western blot， respectively.

Result

Compared with normal group， functions of FVC， FRC and MMEF in model group were significantly decreased (

0.01)， and the time of tI and tE was significantly prolonged （

0.05，

0.01）. The content of TNF-

in lung tissue was significantly increased （

0.01）. The mRNA and protein expressions of cAMP， PKA and CREB in lung tissue were significantly decreased （

0.01）. The expression of AQP5 and

-ENAC in lung tissue decreased significantly. The alveolar cavity of rats was filled with edema fluid， surrounding tissue hyperemia， inflammatory cell infiltration

bronchial mucosa epithelial adhesion. Compared with model group， Xiao Qinglongtang and its fangyuan group could significantly enhance the FVC

FRC and MMEF functions of model rats （

0.05，

0.01）， and tI and tE time were shortened （

0.05，

0.01）. The content of TNF-

in lung tissues of Xiao Qinglongtang group， Guizhi Gancao group and Banxia Mahuang group was significantly decreased （

0.01）. The mRNA expressions of cAMP， PKA and CREB in Xiao Qinglongtang group were significantly up-regulated （

0.01）， and the mRNA expressions of cAMP and PKA in Guizhi Gancao， Jiangxinwei and Banxia Mahuang groups were significantly up-regulated （

0.01）. The protein expressions of cAMP， PKA and CREB in Xiao Qinglongtang group， Guizhi Gancao group， Jiangxinwei group and Banxia Mahuang group were significantly up-regulated （

0.01）， and the protein expression of CREB in Shaoyao Gancao group was significantly up-regulated（

0.05）. Xiao Qinglongtang could up-regulate the positive expression of AQP5 and

-ENAC， and Guizhi Gancao group could up-regulate the positive expression of

-ENAC. Xiao Qinglongtang and its fangyuan can reduce the lung edema， inflammatory cell infiltration and bronchial mucosal adhesion of model rats.

Conclusion

Xiao Qinglongtang and its ingredients can reduce lung edema and inhibit inflammation by improving the expression of lung water transport-related proteins AQP1， AQP5， and

-ENaC through cAMP/PKA pathway， thereby restoring the lung functions in rats with syndrome of cold fluid accumulated in lung. Na

-K

-ATPase may play an auxiliary role in the regulation of lung water transport. This provides a certain objective basis for preliminarily elucidating the connotation of lung governing water movement from the perspective of lung water transport-related proteins.

关键词

Keywords

references

STAUB N C . Pulmonary edema ［J］. Physiol Rev ， 1974 ， 54 （ 3 ）： 678 - 811 .

居越昆 . Starling力与压力性肺水肿［J］. 生理科学， 1988 （ 1 ）： 36 - 38，35 .

KRAINER G ， SCHENKEL M ， HARTMANN A ， et al . CFTR transmembrane segments are impaired in their conformational adaptability by a pathogenic loop mutation and dynamically stabilized by Lumacaftor ［J］. J Biol Chem ， 2020 ， 295 （ 7 ）： 1985 - 1991 .

MATTHAY M A ， FOLKESSON H G ， CLERICI C . Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema ［J］. Physiol Rev ， 2002 ， 82 （ 3 ）： 569 - 600 .

张伯臾 . 中医内科学［M］. 上海：上海科学技术出版社， 1985 ： 87 .

陈萌，王庆国 . 浅谈经方方元的研究思路［J］. 中国中医药信息杂志， 2003 ， 10 （ 6 ）： 5 - 7 .

张迪，王文雅，许宗颖，等 . 从经方方元解读小青龙汤的组方内涵［J］. 吉林中医药， 2021 ， 41 （ 8 ）： 1094 - 1097 .

李宇航 . 《伤寒论》方药剂量与配伍比例研究［M］. 北京：人民卫生出版社， 2015 ： 64 - 65 .

陈林知，戴天木 . 寒饮蕴肺证大鼠病理模型的建立［J］. 湖北中医杂志， 2007 ， 29 （ 12 ）： 13 - 14 .

张迪 . 小青龙汤散寒蠲饮的组方规律研究［D］. 北京：北京中医药大学， 2021 ： 48 - 49 .

徐洪，杨方，袁媛，等 . 免疫组织化学Image Pro Plus图像半定量分析的参数选择［J］. 解剖学杂志， 2012 ， 35 （ 1 ）： 37 - 41 .

HERRERA M ， GARVIN J L . Aquaporins as gas channels ［J］. Pflugers Arch ， 2011 ， 462 （ 4 ）： 623 - 630 .

KALDENHOFF R ， KAI L ， UEHLEIN N . Aquaporins and membrane diffusion of CO 2 in living organisms ［J］. Biochim Biophys Acta ， 2014 ， 1840 （ 5 ）： 1592 - 1595 .

MAUREL C ， BOURSIAC Y ， LUU D T ， et al . Aquaporins in plants ［J］. Physiol Rev ， 2015 ， 95 （ 4 ）： 1321 - 1358 .

BIENERT G P ， CHAUMONT F . Aquaporin-facilitated transmembrane diffusion of hydrogen peroxide ［J］. Biochim Biophys Acta ， 2014 ， 1840 （ 5 ）： 1596 - 1604 .

GARNEAU A P ， CARPENTIER G A ， MARCOUX A A ， et al . Aquaporins mediate silicon transport in humans ［J］. PLoS One ， 2015 ， 10 （ 8 ）： e0136149 .

ISHIBASHI K ， HARA S ， KONDO S . Aquaporin water channels in mammals ［J］. Clin Exp Nephrol ， 2009 ， 13 （ 2 ）： 107 - 117 .

ABIR-AWAN M ， KITCHEN P ， SALMAN M M ， et al . Inhibitors of mammalian aquaporin water channels ［J］. Int J Mol Sci ， 2019 ， 20 （ 7 ）： 1589 .

SONG Y ， JAYARAMAN S ， YANG B ， et al . Role of aquaporin water channels in airway fluid transport， humidification， and surface liquid hydration ［J］. J Gen Physiol ， 2001 ， 117 （ 6 ）： 573 - 582 .

WITTEKINDT O H ， DIETL P . Aquaporins in the lung ［J］. Pflugers Arch ， 2019 ， 471 （ 4 ）： 519 - 532 .

BOROK Z ， VERKMAN A S . Lung edema clearance：20 years of progress：Invited review：Role of aquaporin water channels in fluid transport in lung and airways ［J］. J Appl Physiol （ 1985 ）， 2002 ， 93 （ 6 ）： 2199 - 2206 .

KING L S ， NIELSEN S ， AGRE P ， et al . Decreased pulmonary vascular permeability in aquaporin-1-null humans ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A ， 2002 ， 99 （ 2 ）： 1059 - 1063 .

SU X ， SONG Y ， JIANG J ， et al . The role of aquaporin-1 （AQP1） expression in a murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury ［J］. Respir Physiol Neurobiol ， 2004 ， 142 （ 1 ）： 1 - 11 .

MA T ， FUKUDA N ， SONG Y ， et al . Lung fluid transport in aquaporin-5 knockout mice ［J］. J Clin Invest ， 2000 ， 105 （ 1 ）： 93 - 100 .

GAO J ， ZHOU L ， GE Y ， et al . Effects of different resuscitation fluids on pulmonary expression of aquaporin1 and aquaporin-5 in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection ［J］. PLoS One ， 2013 ， 8 （ 5 ）： e64390 .

FABREGAT G ， GARCÍA-DE-LA-ASUNCIÓN J ， SARRIÁ B ， et al . Expression of aquaporins 1 and 5 in a model of ventilator-induced lung injury and its relation to tidal volume ［J］. Exp Physiol ， 2016 ， 101 （ 11 ）： 1418 - 1431 .

TAN J ， GAO C ， WANG C ， et al . Expression of aquaporin-1 and aquaporin-5 in a rat model of high-altitude pulmonary edema and the effect of hyperbaric oxygen exposure ［J］. Dose Response ， 2020 ， 18 （ 4 ）： 1559325820970821 .

WU Y ， PAN C Y ， GUO C Z ， et al . Expression of aquaporin 1 and 4 in rats with acute hypoxic lung injury and its significance ［J］. Genet Mol Res ， 2015 ， 14 （ 4 ）： 12756 - 12764 .

MA C ， DONG L ， LI M ， et al . Qidonghuoxue decoction ameliorates pulmonary edema in acute lung injury mice through the upregulation of epithelial sodium channel and aquaporin-1 ［J］. Evid Based Complement Alternat Med ， 2020 ， doi： 10.1155/2020/2492304 http://dx.doi.org/10.1155/2020/2492304 .

WANG K ， FENG Y L ， WEN F Q ， et al . Decreased expression of human aquaporin-5 correlated with mucus overproduction in airways of chronic obstructive pulmonary disease ［J］. Acta Pharmacol Sin ， 2007 ， 28 （ 8 ）： 1166 - 1174 .

IJAZ B ， SHABBIR A ， SHAHZAD M ， et al . Amelioration of airway inflammation and pulmonary edema by Teucrium stocksianum via attenuation of pro-inflammatory cytokines and up-regulation of AQP1 and AQP5 ［J］. Respir Physiol Neurobiol ， 2021 ， 284 ： 103569 .

SHAHID H ， SHAHZAD M ， SHABBIR A ， et al . Immunomodulatory and anti-inflammatory potential of curcumin for the treatment of allergic asthma：Effects on expression levels of pro-inflammatory cytokines and aquaporins ［J］. Inflammation ， 2019 ， 42 （ 6 ）： 2037 - 2047 .

RANA S ， SHAHZAD M ， SHABBIR A . Pistacia integerrima ameliorates airway inflammation by attenuation of TNF- α ， IL-4， and IL-5 expression levels， and pulmonary edema by elevation of AQP1 and AQP5 expression levels in mouse model of ovalbumin-induced allergic asthma ［J］. Phytomedicine ， 2016 ， 23 （ 8 ）： 838 - 845 .

TAKEI Y . Comparative physiology of body fluid regulation in vertebrates with special reference to thirst regulation ［J］. Jpn J Physiol ， 2000 ， 50 （ 2 ）： 171 - 186 .

HANUKOGLU I ， HANUKOGLU A . Epithelial sodium channel （ENaC） family： Phylogeny， structure-function， tissue distribution， and associated inherited diseases ［J］. Gene ， 2016 ， 579 （ 2 ）： 95 - 132 .

CANESSA C M ， SCHILD L ， BUELL G ， et al . Amiloride-sensitive epithelial Na + channel is made of three homologous subunits ［J］. Nature ， 1994 ， 367 （ 6462 ）： 463 - 467 .

DENG J ， WANG D X ， DENG W ， et al . Regulation of alveolar fluid clearance and ENaC expression in lung by exogenous angiotensin Ⅱ ［J］. Respir Physiol Neurobiol ， 2012 ， 181 （ 1 ）： 53 - 61 .

ABDEL HAMEID R ， CORMET-BOYAKA E ， KUEBLER W M ， et al . SARS-CoV-2 may hijack GPCR signaling pathways to dysregulate lung ion and fluid transport ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol ， 2021 ， 320 （ 3 ）： L430 - L435 .

FEI X ， ZIQIAN Y ， BINGWU Y ， et al . Aldosterone alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by regulating epithelial sodium channel through PI3K/Akt/SGK1 signaling pathway ［J］. Mol Cell Probes ， 2021 ， 57 ： 101709 .

RIDGE K M ， OLIVERA W G ， SALDIAS F ， et al . Alveolar type 1 cells express the alpha2 Na，K-ATPase， which contributes to lung liquid clearance ［J］. Circ Res ， 2003 ， 92 （ 4 ）： 453 - 460 .

MUTLU G M ， SZNAJDER J I . Mechanisms of pulmonary edema clearance ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol ， 2005 ， 289 （ 5 ）： L685 - L695 .

SKOU J C . Nobel lecture. The identification of the sodium pump ［J］. Biosci Rep ， 1998 ， 18 （ 4 ）： 155 - 169 .

CHINIGARZADEH A ， MUNIANDY S ， SALLEH N.Estrogen ， progesterone ， and genistein differentially regulate levels of expression of α- ， β- ， and γ-epithelial sodium channel （ENaC） and α-sodium potassium pump （Na⁺/K⁺-ATPase） in the uteri of sex steroid-deficient rats ［J］. Theriogenology ， 2015 ， 84 （ 6 ）： 911 - 926 .

MATTHAY M A ， FOLKESSON H G ， CLERICI C . Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema ［J］. Physiol Rev ， 2002 ， 82 （ 3 ）： 569 - 600 .

OTIS J S ， MITCHELL P O ， KERSHAW C D ， et al . Na，K-ATPase expression is increased in the lungs of alcohol-fed rats ［J］. Alcohol Clin Exp Res ， 2008 ， 32 （ 4 ）： 699 - 705 .

INGBAR D H ， WEEKS C B ， GILMORE-HEBERT M ， et al . Developmental regulation of Na， K-ATPase in rat lung ［J］. Am J Physiol ， 1996 ， 270 （ 4 Pt 1 ）： L619 - 629 .

SALDÍAS F ， LECUONA E ， FRIEDMAN E ， et al . Modulation of lung liquid clearance by isoproterenol in rat lungs ［J］. Am J Physiol ， 1998 ， 274 （ 5 ）： L694 - L701 .

CLERICI C ， MATTHAY M A . Hypoxia regulates gene expression of alveolar epithelial transport proteins ［J］. J Appl Physiol （ 1985 ）， 2000 ， 88 （ 5 ）： 1890 - 1896 .

WAHLANG B ， MCCLAIN C ， BARVE S ， et al . Role of cAMP and phosphodiesterase signaling in liver health and disease ［J］. Cell Signal ， 2018 ， 49 ： 105 - 115 .

SKROBLIN P ， GROSSMANN S ， SCHÄFER G ， et al . Mechanisms of protein kinase A anchoring ［J］. Int Rev Cell Mol Biol ， 2010 ， 283 ： 235 - 330 .

KRANE C M ， TOWNE J E ， MENON A G . Cloning and characterization of murine AQP5：Evidence for a conserved aquaporin gene cluster ［J］. Mamm Genome ， 1999 ， 10 （ 5 ）： 498 - 505 .

WANG W ， ZHENG M . Role of cAMP-PKA/CREB pathway in regulation of AQP 5 production in rat nasal epithelium ［J］. Rhinology ， 2011 ， 49 （ 4 ）： 464 - 469 .

张景熙，李强，刘忠令 . AQP5的结构功能及其调节［J］. 国外医学：生理、病理科学与临床分册， 2003 ， 23 （ 6 ）： 599 - 601 .

李岩 . 苓甘五味姜辛汤对寒饮伏肺型哮喘大鼠cAMP-PKA通路相关分子表达的影响［D］. 兰州：甘肃中医药大学， 2016 .

MUSTAFA S B ， CASTRO R ， FALCK A J ， et al . Protein kinase A and mitogen-activated protein kinase pathways mediate cAMP induction of alpha-epithelial Na + channels （alpha-ENaC）［J］. J Cell Physiol ， 2008 ， 215 （ 1 ）： 101 - 110 .

HAN J ， LI H ， BHANDARI S ， et al . Maresin conjugates in tissue regeneration 1 improves alveolar fluid clearance by up-regulating alveolar ENaC，Na，K-ATPase in lipopolysaccharide-induced acute lung injury ［J］. J Cell Mol Med ， 2020 ， 24 （ 8 ）： 4736 - 4747 .

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