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Phillygenin Mitigates LPS/ATP-induced L02 Cell Inflammation by Regulating P2X7R/NF-
κ B/NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 14, Pages: 61-69(2022)
- 作者机构：
成都中医药大学 药学院 西南中药资源国家重点实验室，成都 611137
- 作者简介：
- 基金信息：
DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20220808
CLC： R2-0;R22;R285.5;R289;R33Received：11 November 2021，
Published Online：28 February 2022，
Published：20 July 2022
- 稿件说明：
移动端阅览
邓英,赵兴桃,周梦婷等.连翘脂素通过调控P2X7R/NF-κB/NLRP3炎性小体信号通路缓解LPS/ATP诱导的L02细胞炎症[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(14):61-69.
DENG Ying,ZHAO Xingtao,ZHOU Mengting,et al.Phillygenin Mitigates LPS/ATP-induced L02 Cell Inflammation by Regulating P2X7R/NF-κB/NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(14):61-69.
邓英,赵兴桃,周梦婷等.连翘脂素通过调控P2X7R/NF-κB/NLRP3炎性小体信号通路缓解LPS/ATP诱导的L02细胞炎症[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(14):61-69. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220808.
DENG Ying,ZHAO Xingtao,ZHOU Mengting,et al.Phillygenin Mitigates LPS/ATP-induced L02 Cell Inflammation by Regulating P2X7R/NF-κB/NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(14):61-69. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220808.
摘要
目的
2
为研究连翘脂素（Phillygenin，PHI）对脂多糖（LPS）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）联合诱导L02细胞中的抗炎药效和对P2X7受体（P2X7R），NOD样蛋白结构域受体3（NLRP3）和核转录因子-
κ
B（NF-
κ
B）表达的影响。
方法
2
本研究采用先给予100 μg
·
L
-1
LPS处理24 h后，再使用5 mmoL·L
-1
ATP 5 h建立L02细胞炎症模型。给药组在给予LPS处理的同时给予不同浓度PHI（100、50、25 mg·L
-1
）培养6 h，随后换液，继续用LPS处理18 h，ATP处理5 h后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测L02细胞中白细胞介素-1
β
（IL-1
β
）、白细胞介素-18（IL-18）、P2X7R、NLRP3、胱天蛋白酶-1前体（pro-Caspase-1）、裂解胱天蛋白酶-1（cleaved Caspase-1）、NF-
κ
B、NF-
κ
B抑制蛋白
α
（I
κ
B
α
） mRNA和蛋白表达。通过分子对接实验预测P2X7R与PHI能否结合，以及DCFH-DA活性氧（ROS）荧光探针检测细胞中ROS的累积。采用小干扰核糖核酸（siRNA）沉默P2X7R，并随后通过Real-time PCR检测IL-1
β
、IL-18、P2X7R、NLRP3、Caspase-1、NF-
κ
B、I
κ
B
α
mRNA表达情况。
结果
2
Real-time PCR和Western blot分析显示，与空白组比较，模型组IL-1
β
、IL-18的表达均有所升高（
P
<
0.05）；与模型组比较，给药组明显下调了IL-1
β
、IL-18 mRNA和蛋白的表达（
P
<
0.05）。分子对接结果显示PHI与P2X7R有较好的结合作用。Real-time PCR和Western blot分析显示，与空白组比较，模型组P2X7R的表达明显上调（
P
<
0.05）；与模型组比较，给药组下调了P2X7R mRNA和蛋白表达（
P
<
0.05）。ROS荧光探针分析显示，与空白组比较，ROS的含量明显升高（
P
<
0.05）；与模型组比较，给药组明显降低了ROS的积累（
P
<
0.05）。Real-time PCR和Western blot分析显示，与空白组比较，模型组NLRP3炎性小体，NF-
κ
B的表达明显升高（
P
<
0.05）；与模型组比较，给药组明显降低NLRP3、cleaved-Caspase-1和上调NF-
κ
B、I
κ
B
α
mRNA及蛋白表达（
P
<
0.05）。Real-time PCR分析显示，与模型组比较，siRNA沉默P2X7R后，IL-1
β
、IL-18、P2X7R、NLRP3、Caspase-1、NF-
κ
B、I
κ
B
α
mRNA表达明显降低（
P
<
0.05），PHI具有同样的作用，二者合用后，基因表达进一步下降。
结论
2
P2X7R为NF-
κ
B/NLRP3信号通路的上游，PHI可能是通过下调P2X7R从而抑制NF-
κ
B/NLRP3信号通路的表达从而缓解LPS/ATP诱导的L02细胞炎症，提示P2X7R可能是PHI发挥抗炎作用的靶标。
Abstract
Objective
2
To explore the effects of phillygenin （PHI） on the inflammation in L02 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） and adenosine triphosphate （ATP） and the expression of purinergic 2X7 receptor （P2X7R）， NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 （NLRP3）， and nuclear factor kappa B （NF-
κ
B） expression.
Method
2
In this study， the inflammation model was induced in L02 cells by 100 μg·L
-1
LPS treatment for 24 h and 5 mmoL·L
-1
ATP treatment for 5 h. The cells in the PHI groups were cultured with PHI （100， 50， 25 mg·L
-1
） for 6 h in the LPS treatment period， followed by LPS treatment for another 18 h. After ATP treatment for 5 h， the mRNA and protein expression of interleukin-1
β
（IL-1
β
）， interleukin-18 （IL-18）， P2X7R， NLRP3， Caspase-1 precursor （pro-Caspase-1）， cleaved Caspase-1， NF-
κ
B， and NF-
κ
B inhibitor protein
α
（I
κ
B
α
） in L02 cells was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR） and Western blot， respectively. Molecular docking was used to predict whether P2X7R could bind to PHI， and DCFH-DA was employed to detect the accumulation of reactive oxygen species （ROS） in cells. P2X7R was silenced by small interfering ribonucleic acid （siRNA）， and then the mRNA expression of IL-1
β
， IL-18， P2X7R， NLRP3， Caspase-1， NF-
κ
B， and I
κ
B
α
was detected by Real-time PCR.
Result
2
Real-time PCR and Western blot showed that compared with the normal group， the model group showed increased expression of IL-1
β
and IL-18 （
P
<
0.05）， and compared with the model group， the PHI groups showed down-regulated IL-1
β
， IL-18 mRNA and protein expression （
P
<
0.05）. Molecular docking suggested a good binding effect of PHI to P2X7R. Real-time PCR and Western blot analysis showed that the expression of P2X7R in the model group was significantly up-regulated compared with that in the normal group （
P
<
0.05）， and compared with the model group， the PHI groups showed down-regulated mRNA and protein expression of P2X7R （
P
<
0.05）. DCFH-DA results showed that compared with the normal group， the model group showed increased content of ROS （
P
<
0.05）， and compared with the model group， the PHI groups decreased the accumulation of ROS （
P
<
0.05）. As demonstrated by Real-time PCR and Western blot， compared with the normal group， the model group showed increased expression of NLRP3 inflammasome and NF-
κ
B （
P
<
0.05）， and compared with the model group， the PHI groups significantly decreased the mRNA and protein expression of NLRP3 and cleaved Caspase-1， and up-regulated the mRNA and protein expression of NF-
κ
B and I
κ
B
α
（
P
<
0.05）. Real-time PCR analysis showed that compared with the results in the model group， after silencing P2X7R by siRNA， the mRNA expression of IL-1
β
， IL-18， P2X7R， NLRP3， Caspase-1， NF-
κ
B， and I
κ
B
α
was decreased （
P
<
0.05）. PHI exerted the same effect， and the mRNA expression was further reduced after the combination of them.
Conclusion
2
PHI is presumed to suppress the expression of the NLRP3/NF-
κ
B signaling pathway by down-regulating upstream P2X7R to alleviate the LPS/ATP-induced inflammation in L02 cells， suggesting that P2X7R may be the target of PHI against inflammation.
关键词
Keywords
references
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