Effect of Quercetin on LPS-induced Chondrocyte Matrix Metabolism and Inflammation by Activating Autophagy

Bin XU; Shenghua LI; Mingwang ZHOU; Xiaoping WANG; Lei WANG; Jiping ZHANG

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20221089

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Effect of Quercetin on LPS-induced Chondrocyte Matrix Metabolism and Inflammation by Activating Autophagy

更新时间：2022-09-01

- Effect of Quercetin on LPS-induced Chondrocyte Matrix Metabolism and Inflammation by Activating Autophagy
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 14, Pages: 92-98(2022)
- 作者机构：
  
  1.甘肃中医药大学，兰州 730000
  2.甘肃省中医院，兰州 730050
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221089
  CLC： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- Received：29 December 2021，
  
  Published Online：31 March 2022，
  
  Published：20 July 2022
- 稿件说明：
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徐斌,李盛华,周明旺等.槲皮素通过激活自噬对LPS诱导的软骨细胞基质代谢及炎症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(14):92-98.

XU Bin,LI Shenghua,ZHOU Mingwang,et al.Effect of Quercetin on LPS-induced Chondrocyte Matrix Metabolism and Inflammation by Activating Autophagy[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(14):92-98.
徐斌,李盛华,周明旺等.槲皮素通过激活自噬对LPS诱导的软骨细胞基质代谢及炎症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(14):92-98. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221089.

XU Bin,LI Shenghua,ZHOU Mingwang,et al.Effect of Quercetin on LPS-induced Chondrocyte Matrix Metabolism and Inflammation by Activating Autophagy[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(14):92-98. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221089.

摘要

目的

从细胞自噬角度探讨槲皮素调控膝骨关节炎（KOA）软骨细胞外基质代谢及炎症反应的作用机制。

方法

提取软骨细胞、传代培养，及用Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）免疫荧光染色鉴定原代细胞；将脂多糖（LPS）诱导的软骨细胞分为空白组（不做任何处理）、模型组（10 mg·L

-1

LPS处理48 h）、槲皮素低、中、高剂量组（10 mg·L

-1

LPS处理48 h+50、100、150 mmol·L

-1

槲皮素处理24 h）。细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测LPS（2.5、5、7.5、10、12.5 mg·L

-1

）对软骨细胞不同时间（24、48、72 h）增殖的抑制作用；槲皮素（50、100、150、200 mmol·L

-1

）对LPS诱导的软骨细胞不同时间（12、24、48 h）增殖的影响；蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）检测微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）和泛素结合蛋白p62（p62）蛋白表达。用3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预LPS诱导的软骨细胞，分为空白组（不做任何处理）、模型组（10 mg·L

-1

LPS）、槲皮素组（模型组+100 mmol·L

-1

槲皮素）、3-MA组（模型组+100 μmol·L

-1

3-MA）、3-MA+槲皮素组（模型组+100 μmol·L

-1

3-MA+100 mmol·L

-1

槲皮素），先用LPS处理48 h后，3-MA处理2 h，再用槲皮素干预24 h。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测白细胞介素-1

（IL-1

）、肿瘤坏死因子-

（TNF-

）含量；WB检测基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）蛋白表达。

结果

Collagen Ⅱ免疫荧光鉴定结果示，所提取的细胞符合软骨细胞特征；CCK-8法筛选LPS最佳造模质量浓度为10 mg·L

-1

、48 h，槲皮素最佳浓度为100 mmol·L

-1

、24 h；WB结果示，与空白组比较，模型组LC3Ⅱ表达显著降低（

0.01），p62表达显著升高（

0.01），与模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组LC3Ⅱ表达显著升高（

0.01），其槲皮素中剂量组最显著，p62表达显著降低（

0.01），其槲皮素中剂量组最显著；与空白组比较，模型组MMP-13表达明显升高（

0.05），TIMP1表达显著降低（

0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组MMP-13表达明显降低（

0.05，

0.01），其中槲皮素组最显著，TIMP1表达显著升高（

0.01），其中槲皮素组最显著。倒置显微镜下观察软骨细胞形态学改变结果示，槲皮素可恢复受损的软骨细胞形态；CCK-8检测各组细胞增殖结果示，与空白组比较，模型组软骨细胞增殖明显被抑制（

0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组软骨细胞增殖显著升高（

0.01），其中槲皮素组最显著；ELISA检测结果示，与空白组比较，模型组IL-1

、TNF-

含量显著升高（

0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组IL-1

、TNF-

含量明显降低（

0.05，

0.01），其中槲皮素组降低最显著。

结论

槲皮素可促进LPS诱导的软骨细胞增殖，调控软骨细胞外基质合成与代谢平衡，抑制炎症反应，恢复软骨细胞功能，其机制可能与槲皮素激活细胞自噬有关。

Abstract

Objective

To investigate the mechanism of quercetin in regulating chondrocyte extracellular matrix metabolism and inflammatory response in knee osteoarthritis （KOA） from the perspective of autophagy.

Method

Chondrocytes were extracted and cultured， and the primary cells were identified by immunofluorescence staining with collagen Ⅱ. The chondrocytes induced by lipopolysaccharide （LPS） were divided into a control group （without any treatment）， a model group （10 mg·L

-1

LPS treatment for 48 h）， and low-， medium-， and high-dose quercetin group （10 mg·L

-1

LPS treatment for 48 h combined with 50， 100， and 150 mmol·L

-1

quercetin for 24 h）. The inhibitory effects of LPS （2.5， 5， 7.5， 10， 12.5 mg·L

-1

） on the proliferation of chondrocytes for different periods （24， 48， 72 h） were detected by cell counting kit-8 （CCK-8）. The effects of quercetin （50， 100， 150， 200 mmol·L

-1

） on the LPS-induced proliferation of chondrocytes for different periods （12， 24， and 48 h） were investigated. The expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ （LC3Ⅱ） and ubiquitin-binding protein p62 was detected by Western blot. LPS-induced chondrocytes were treated with 3-methyladenine （3-MA）. The resultant cells were divided into a control group （without any treatment）， a model group （10 mg·L

-1

LPS）， a quercetin group （model group + 100 mmol·L

-1

quercetin）， a 3-MA group （model group + 100 μmol·L

-1

3-MA）， and a 3-MA + quercetin group （model group + 100 μmol·L

-1

3-MA + 100 mmol·L

-1

quercetin， specifically， LPS for 48 h， 3-MA for 2 h， and then quercetin for 24 h）. The content of interleukin （IL）-1

and tumor necrosis factor （TNF）-

was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The protein expression of matrix metalloproteinase 13 （MMP-13） and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 （TIMP1） was detected by Western blot.

Result

Collagen Ⅱ immunofluorescence staining showed that the extracted cells were consistent with the characteristics of chondrocytes. As revealed by CCK-8， the optimum concentration of LPS was 10 mg·L

-1

with an action time of 48 h， and the optimum concentration of quercetin was 100 mmol·L

-1

with an action time of 24 h. Western blot results showed that compared with the control group， the model group showed decreased expression of LC3Ⅱ （

0.01） and increased expression of p62 （

0.01）. The expression of LC3Ⅱ in the quercetin groups was higher than that in the control group （

0.01）， especially in the medium-dose quercetin group. The p62 expression in the quercetin groups was lower than that in the control group （

0.01）， especially in the medium-dose quercetin group. Compared with the control group， the model group showed increased expression of MMP-13 （

0.05） and decreased expression of TIMP1 （

0.01）. Compared with the model group， the quercetin groups and the 3-MA + quercetin group showed decreased expression of MMP-13 （

0.05，

0.01）， especially the quercetin groups， and increased expression of TIMP1 （

0.01）， especially the quercetin groups. Morphological changes in chondrocytes under the inverted microscope showed that quercetin could restore the morphology of damaged chondrocytes. CCK-8 showed that compared with the control group， the model group showed inhibited chondrocyte proliferation （

0.01）， and compared with the model group， the quercetin groups and the 3-MA + quercetin group showed promoted chondrocyte proliferation （

0.01）， especially the quercetin groups. ELISA results showed that IL-1

and TNF-

levels in the model group were higher than those in the control group （

0.01）， and the levels of IL-1

and TNF-

in the quercetin groups and the 3-MA + quercetin group were lower than those in the model group （

0.05，

0.01）， and the decrease in the quercetin groups was the most significant.

Conclusion

Quercetin can promote LPS-induced chondrocyte proliferation， regulate chondrocyte extracellular matrix synthesis and metabolic balance， inhibit the inflammatory response， and restore chondrocyte function. The mechanism may be related to the activation of autophagy by quercetin.

关键词

Keywords

references

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