Relationship Between Inhibition of High Glucose-induced Macrophage Damage and Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathways by Puerariae Lobatae Radix

RONG Ziling; LIU Yuhui; ZHU Hongyang; LI Yuting; LIU Ronghua

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20221702

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Relationship Between Inhibition of High Glucose-induced Macrophage Damage and Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathways by Puerariae Lobatae Radix

更新时间：2022-11-17

- Relationship Between Inhibition of High Glucose-induced Macrophage Damage and Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathways by Puerariae Lobatae Radix
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 28, Issue 24, Pages: 58-64(2022)
- 作者机构：
  
  江西中医药大学药学院，南昌 300004
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221702
  CLC： R2-0;R22;R285.5;R33
- Received：03 June 2022，
  
  Published Online：31 August 2022，
  
  Published：20 December 2022
- 稿件说明：
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容子玲,刘玉晖,朱洪杨等.葛根抑制高糖诱导巨噬细胞损伤与调控内质网应激信号通路的关系探讨[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(24):58-64.

RONG Ziling,LIU Yuhui,ZHU Hongyang,et al.Relationship Between Inhibition of High Glucose-induced Macrophage Damage and Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathways by Puerariae Lobatae Radix[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(24):58-64.
容子玲,刘玉晖,朱洪杨等.葛根抑制高糖诱导巨噬细胞损伤与调控内质网应激信号通路的关系探讨[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(24):58-64. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221702.

RONG Ziling,LIU Yuhui,ZHU Hongyang,et al.Relationship Between Inhibition of High Glucose-induced Macrophage Damage and Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathways by Puerariae Lobatae Radix[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(24):58-64. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221702.

摘要

目的

观察葛根含药血清对高糖诱导的重度内质网应激（ERS）模型中肿瘤坏死因子-

（TNF-

）、内质网应激信号通路蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、活化转录因子4（ATF4）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、真核翻译起始因子2

（eIF2

）的作用，观察葛根对高糖诱导巨噬细胞炎症损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。

方法

采用血清药理学方法，制备空白血清和葛根含药血清，体外培养RAW264.7巨噬细胞，采过62.5 mmol·L

-1

葡萄糖诱导巨噬细胞建立体外重度ERS模型，使用不同体积分数的葛根含药血清及内质网应激抑制剂（4-PBA）干预细胞。通过细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测不同葡萄糖浓度（22.5、23.5、25.0、27.5、32.5、47.5、72.5、122.5 mmol·L

-1

）及不同体积分数葛根含药血清（0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%）对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响；在CCK-8法检测葡萄糖浓度对巨噬细胞存活率影响结果基础上采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测不同葡萄糖浓度浓度（22.5、32.5、42.5、52.5、62.5、72.5 mmol·L

-1

）及不同时间段下（6、12、24、36、48 h） ERS的标志性蛋白GRP78的表达量，筛选出建立重度ERS模型最适造模浓度和时间，基于上述实验结果将细胞分为分别将细胞分为空白组、62.5 mmol·L

-1

葡萄糖模型组、2 mmol·L

-1

4-PBA组、高、中、低（15%、10%、5%）葛根含药血清组开展后续实验，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测重度ERS模型中RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-

的表达，Western blot检测重度ERS模型中相关通路蛋白表达情况。

结果

CCK-8法检测发现，在葡萄糖浓度为27.5 mmol·L

-1

刺激下巨噬细胞存活率达到最高（

0.01）、而在葡萄糖浓度22.5~27.5 mmol·L

-1

刺激下，巨噬细胞存活率随浓度增加而呈上升趋势，葡萄糖浓度在25.0 mmol·L

-1

时差异有统计学意义（

0.01），在葡萄糖浓度37.5~122.5 mmol·L

-1

刺激下，则出现了下降趋势，葛根含药血清在1%~15%皆差异有统计学意义（

0.05，

0.01），Western blot法检测不同葡萄糖浓度和不同时间段下的GRP78蛋白表达量发现，在24 h时，GRP78蛋白表达显著性最强（

0.01），葡萄糖浓度为62.5 mmol·L

-1

时，GRP78蛋白表达量最强（

0.01）；由此可知葡萄糖浓度为62.5 mmol·L

-1

可作为诱导重度ERS模型的最适浓度。与空白组相比较，模型组中TNF-

、GRP78、ATF4蛋白表达水平，磷酸化（p）-PERK/PERK、p-eIF2

/eIF2

明显升高（

0.05，

0.01），而与模型组比较，各给药组的TNF-

、GRP78、ATF4蛋白表达水平，p-PERK/PERK、p-eIF2

/eIF2

明显降低（

0.05，

0.01）。

结论

在体外实验结果表明，葛根在一定程度上可缓解高糖诱导巨噬细胞所出现的炎症损伤及通过抑制ERS信号通路中GRP78、ATF4、PERK、eIF2

的表达，以此来恢复细胞稳态。

Abstract

Objective

To observe the effect of the serum containing Puerariae Lobatae Radix on tumor necrosis factor-

（TNF-

）， endoplasmic reticulum stress signaling pathway protein endoplasmic reticulum stress protein glucose-regulated protein 78 （GRP78）， activated transcription factor 4 （ATF4）， protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase （PERK）， and eukaryotic translation initiation factors （eIF2

） and on inflammatory injury of macrophages induced by high glucose， and explore its possible mechanism.

Method

The control serum and serum containing Puerariae Lobatae Radix were prepared by serum pharmacology. The RAW264.7 macrophages were cultured

in vitro

， and 62.5 mmol·L

-1

glucose was used to induce macrophages to establish a model of severe endoplasmic reticulum （ER） stress （ERS）

in vitro

. Different volume fractions of serum containing Puerariae Lobatae Radix and ERS inhibitor （4-PBA） were used to interfere with the cells. Different glucose concentrations （22.5， 23.5， 25.0， 27.5， 32.5， 47.5，

72.5， 122.5 mmol·L

-1

） and the effect of different volume fractions of serum containing Puerariae Lobatae Radix （0%， 2.5%， 5%， 7.5%， 10%， 15%， 20%） on the survival rate of RAW264.7 macrophages were detected by cell proliferation and cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Based on the results of the effect of glucose concentrations on macrophage survival rate by CCK-8， Western blot （WB） was used to determine the protein expression levels of GRP78， the signature protein of ERS， by different concentrations of glucose （22.5， 32.5， 42.5， 52.5， 62.5， 72.5 mmol·L

-1

） at different time periods （6， 12， 24， 36， 48 h）， and the optimal concentration and time for establishing the model of severe ERS were screened out. Based on the above experimental results， the cells were divided into blank group， 62.5 mmol·L

-1

glucose model group， 2 mmol·L

-1

4-PBA group， and high， medium， and low-dose （15%， 10%， 5%） serum containing Puerariae Lobatae Radix groups for subsequent experiments. The expression of TNF-

in the supernatant of RAW264.7 macrophages in the model of severe ERS was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expressions of related pathway proteins in the model of severe ERS were determined by WB.

Result

The results of CCK-8 assay showed that the survival rate of macrophages reached the highest under the stimulation of glucose concentration of 27.5 mmol·L

-1

（

0.01）， while the survival rate of macrophages increased with the concentration increasing from 22.5 mmol·L

-1

to 27.5 mmol·L

-1

. When the glucose concentration was 25.0 mmol·L

-1

， there was a significant difference （

0.01）， and when the glucose concentration was 37.5 mmol·L

-1

to 122.5 mmol·L

-1

， there was a downward trend. The serum containing Puerariae Lobatae Radix showed significant differences in the volume of 1% to 15% （

0.05，

0.01）. The results of WB found that the GRP78 protein expression was the most significant at 24 h （

0.01）， and the GRP78 protein expression was the most significant when the glucose concentration was 62.5 mmol·L

-1

（

0.01）. Therefore， 62.5 mmol·L

-1

of glucose was the optimal concentration to induce the model of severe ERS. As compared with the blank group， the protein expression levels of TNF-

， GRP78， ATF4， phosphorylation（p）-PERK/PERK， p-eIF2

/eIF2

in the model group were significantly increased （

0.05，

0.01）， and as compared with the model group， the protein expression levels of TNF-

， GRP78， ATF4， p-PERK/PERK， p-eIF2

/eIF2

in each administration group were significantly decreased （

0.05，

0.01）.

Conclusion

The results of

in vitro

experiments show that Puerariae Lobatae Radix can alleviate the inflammatory injury of macrophages induced by high glucose to a certain extent and restore cell homeostasis by inhibiting the expression of GRP78， ATF4， PERK， and eIF2

in the ERS signaling pathway.

关键词

Keywords

references

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