Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway

WANG Zhengzhen; HUANG Junqing; YANG Bin; LI Lin; DONG Jiaan; YANG Shun

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230507

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Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway

更新时间：2023-07-18

- Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 29, Issue 16, Pages: 33-42(2023)
- 作者机构：
  
  1.河南中医药大学骨伤学院，郑州 450000
  2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，郑州 450000
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230507
  CLC： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- Published：20 August 2023，
  
  Published Online：15 February 2023，
  
  Received：01 November 2022，
- 稿件说明：
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王政臻,黄俊卿,杨彬等.基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):33-42.

WANG Zhengzhen,HUANG Junqing,YANG Bin,et al.Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):33-42.
王政臻,黄俊卿,杨彬等.基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):33-42. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230507.

WANG Zhengzhen,HUANG Junqing,YANG Bin,et al.Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):33-42. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230507.

摘要

目的

研究身痛逐瘀汤含药血清对膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨细胞氧化应激及凋亡的保护作用。

方法

50只雄性大鼠分别灌胃给予生理盐水、身痛逐瘀汤低、中、高剂量（1.73、3.46、6.92 g·kg

-1

）和硫酸氨基葡萄糖（0.3 g·kg

-1

），连续给药2周后收集血清。构建KOA模型，分离软骨细胞，随机分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组。软骨细胞培养过程中添加磷酸腺苷（AMP）依赖的蛋白激酶（AMPK）抑制剂Compound C（10 μmol·L

-1

），分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清组、Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色检测细胞增殖；原位末端标记法（TUNEL）测定凋亡；DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）水平；比色法测定谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、MMP-13、胶原酶Ⅱ型（Col Ⅱ）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Weatern blot）检测磷酸化（p）-AMPK及沉默信息调节因子1（Sirt1）蛋白表达。

结果

与正常组比较，模型组软骨细胞增殖率、GSH活性、Col Ⅱ与Aggrecan mRNA表达、p-AMPK和Sirt1蛋白水平显著降低（

0.01），而ROS水平、MDA含量、TUNEL阳性细胞率、MMP-3与MMP-13 mRNA表达显著升高（

0.01）。与模型组比较，身痛逐瘀汤含药血清能提高KOA大鼠软骨细胞中EdU阳性细胞数、GSH活性、Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表达水平、p-AMPK和Sirt1蛋白水平（

0.05，

0.01），而TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA表达水平则明显降低（

0.05，

0.01）。与身痛逐瘀汤含药血清组比较，Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组细胞p-AMPK和Sirt1蛋白表达、GSH活性、Col Ⅱ和Aggrecan mRNA水平明显降低（

0.01），TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA水平显著升高（

0.01）。

结论

身痛逐瘀汤含药血清能减弱KOA大鼠软骨细胞氧化损伤，降低细胞凋亡，其保护作用可能与激活AMPK/Sirt1信号通路有关。

Abstract

Objective

To investigate the protective effect of Shentong Zhuyutang-containing serum against oxidative stress and apoptosis in chondrocytes of rats with knee osteoarthritis （KOA）.

Method

Fifty male rats were orally administered with normal saline， low-， medium-， and high-dose Shentong Zhuyutang （1.73， 3.46， 6.92 g·kg

-1

）， and glucosamine sulfate （0.3 g·kg

-1

） for two weeks. Serum samples were collected after the treatment period. The KOA model was established， and chondrocytes were isolated and randomly divided into normal group， model group， low-， medium-， and high-dose Shentong Zhuyutang-containing serum groups， and glucosamine sulfate group. During the chondrocyte culture， adenosine monophosphate （AMP）-activated protein kinase （AMPK） inhibitor Compound C （10 μmol·L

-1

） was added， and the cells were divided into normal group， model group， Shentong Zhuyutang-containing serum group， and Compound C + Shentong Zhuyutang-containing serum group. Cell proliferation was detected using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EdU） staining. Apoptosis was determined using terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling （TUNEL）. Reactive oxygen species （ROS） levels were measured using DCFH-DA probe. Glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） levels were determined using the colorimetric method. Real-time polymerase chain reaction （PCR） was used to measure the mRNA expression levels of matrix metalloproteinase-3 （MMP-3）， MMP-13， type Ⅱ collagen （Col Ⅱ）， and Aggrecan. Western blot was performed to measure the protein expression of phosphorylated （p）-AMPK and silent information regulator factor 1 （Sirt1）.

Result

Compared with the normal group， the model group showed a significant decrease in chondrocyte proliferation rate， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA expression， p-AMPK and Sirt1 protein levels （

0.01）， and increased ROS levels， MDA content， TUNEL-positive cell rate， and MMP-3 and MMP-13 mRNA expression （

0.01）. Compared with the model group， Shentong Zhuyutang-containing serum increased the number of EdU-positive cells， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA expression， p-AMPK and Sirt1 protein levels in KOA rat chondrocytes （

0.05，

0.01）， and decreased the TUNEL-positive cell rate， ROS levels， MDA content， MMP-3 and MMP-13 mRNA expression （

0.05，

0.01）. Compared with the Shentong Zhuyutang-containing serum group， the Compound C + Shentong Zhuyutang-containing serum group showed significantly reduced p-AMPK and Sirt1 protein expression， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA levels （

0.01）， and increased TUNEL-positive cell rate， ROS levels， MDA content， MMP-3 and MMP-13 mRNA levels （

0.01）.

Conclusion

Shentong Zhuyutang-containing serum attenuates oxidative damage and reduces apoptosis in chondrocytes of rats with KOA， and its protective effect may be associated with the activation of the AMPK/Sirt1 signaling pathway.

关键词

身痛逐瘀汤膝骨关节炎氧化应激细胞凋亡AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）沉默信息调节因子1（Sirt1）

Keywords

Shentong Zhuyutangknee osteoarthritisoxidative stressapoptosisadenosine monophosphate （AMP）-dependent protein kinase （AMPK）silent information regulator factor 1 （Sirt1）

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