中国每年约有200万新发脑卒中病例，其致残率、病死率高，给社会、家庭带来沉重经济负担，通过有效的治疗实现卒中后功能恢复，具有重要的社会意义与研究价值［1］。缺血性脑卒中（脑梗死）在所有卒中类型中比例最高，缺血发生时，脑微血管内皮细胞紧密连接受损，脑血管形态发生改变，血脑屏障完整性受到破坏，继而出现脑水肿、活性氧自由基生成、胶质细胞活化并释放大量炎症因子等，造成神经细胞进一步受损［2］。近年来研究表明，微血管生成与重构能改善脑微血管形态，通过建立侧支循环，对神经细胞起到保护与促修复作用，有利于缺血后神经功能的康复［3-4］。银杏蜜环口服溶液由银杏叶提取物和蜜环粉组成，具有缓解心、脑缺血症状及改善微循环障碍的作用。课题组在体外实验中，已证实银杏蜜环口服溶液可促进心、脑微血管内皮细胞血管新生［5-6］，但在动物实验方面的证据较少。本研究旨在建立稳定的化学光栓塞型局灶性脑缺血小鼠模型，通过检测行为学、毛细血管密度、脑组织病理形态及微血管生成与重构相关蛋白表达，探讨其通过微血管生成与重构方面治疗缺血性脑卒中作用机制。1 材料1.1　动物SPF级C57BL/6J小鼠50只，雄性，体质量（23±1）g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0002。动物购入后饲养于IVC屏障环境，自由饮水摄食，12 h昼夜循环，室温控制在（25±1）℃，相对湿度控制在50%~60%。本实验符合北京实验动物福利伦理审查指南，并经中国中医科学院西苑医院实验动物伦理委员会批准（批件号2022XLC048-2）。1.2　药物与试剂银杏蜜环口服溶液，10 mL/支（邛崃天银制药有限公司，批号190721），实验前用蒸馏水将药物稀释至相应浓度的溶液；银杏叶提取物片（金纳多），40 mg/片（德国威玛舒培博士药厂，批号8411015），实验前片剂经研磨后以蒸馏水配制成相应浓度的混悬液；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号020402）；虎红钠盐（玫瑰红，北京索莱宝生物科技有限公司，批号425D042）；异硫氰酸荧光素葡聚糖（FITC-dextran，中国西格玛奥德里奇，批号SLBW1874）；组织冰冻切片OCT樱花包埋剂（美国Sakura Finetek公司，批号0149-00）；CD31兔多克隆抗体（英国Abcam公司，批号ab124432）；血管性血友病因子（vWF）、血管生成素（ANG）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）兔多克隆抗体（武汉三鹰生物科技有限公司，批号分别为11778-1-AP、18302-1-AP、20960-1-AP）；血管内皮生长因子（VEGF）兔多克隆抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号A3098），β-肌动蛋白（β-actin）兔多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-0061R）。1.3　仪器EAR2130型电子天平（美国Adventure公司）；HW520AD12-16GD型520 nm 12 mW点状冷光激光发射器（深圳市红外线激光科技有限公司）；ZP-5N型数显式小鼠抓力测定仪（艾固仪器有限公司）；CM1950型全自动冰冻切片机（德国Leica公司）；510 LSM META型激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；SYNERGYTM 4型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；Mini Trans-Blot转移电泳槽、Powerpac Universal型电泳仪、Chem DocTM XRS+型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　动物分组与给药实验分为假手术组、模型组、银杏叶提取物组（12.5 mg·kg-1）、银杏蜜环口服溶液低剂量组（银蜜低剂量组，412 mg·kg-1）和银杏蜜环口服溶液高剂量组（银蜜高剂量组，824 mg·kg-1）。假手术组与模型组按10 mL·kg-1灌胃蒸馏水，其余各给药组分别按10 mL·kg-1灌胃相应药物，小鼠脑梗死模型术后第2天开始，每天给药1次，连续给药14 d，末次给药2 h后进行行为学检测，随后麻醉取脑组织。2.2　模型制备参照文献方法并稍改良建立化学光栓塞型局灶性脑缺血小鼠模型［7］：采用0.5%戊巴比妥钠腹腔注射10 mL·kg-1麻醉小鼠，虎红钠盐用生理盐水配成10 g·L-1溶液，经尾静脉注射该溶液0.2 mL/只，5 min后沿颅顶中线切开小鼠皮肤，随后将其固定于立体定位仪上，使用冷光激光发射器（波长520 nm，12 W）对小鼠颅骨部位进行垂直激光照射，照射部位中点距前囱右侧2.0 mm、后侧2.0 mm，激光头距离小鼠颅骨2.0 cm，圆形光斑直径4 mm，激光照射时间7 min，随后关闭激光发射器并缝合颅顶皮肤。整个实验过程采用加热垫维持小鼠体温于（37.0±0.5） ℃。假手术组只注射虎红钠盐溶液，但不进行激光照射。2.3　改良神经损伤严重程度评分（mNSS）参照文献［8］方法并稍改良，于给药后14 d进行mNSS评价，分值越高则神经功能缺损程度越重。具体评分细则为偏瘫（0~3分）；自由行走（0~3分）；平衡木测试（0~6分）；反射缺失（0~2分）；总分14分小鼠死亡。2.4　前肢抓力测定末次给药2 h后行抓力测定。垂直固定抓力仪，使小鼠处于平静状态，抓取小鼠尾部，使其前肢慢慢靠近抓力仪检测网格，待小鼠前爪抓住网格时垂直向下轻用力，使其测到动物的最大抓力，读取抓力值。每只小鼠测3次取平均值。2.5　FITC-dextran毛细血管密度测定参照文献方法［9-10］，给药14 d行为学指标检测后，麻醉小鼠，尾静脉注射FITC-dextran 0.1 mL，药物作用10 min后断头取脑，置于装有4%多聚甲醛的小瓶中，避光保存，4 ℃固定24 h，OCT包埋，采用冰冻切片机行冠状切片，留取含缺血梗死区及周边区的切片，片厚20 μm。选取缺血周边区域（IBZ）皮层5个不同视野，使用Zeiss 510 LSM META激光扫描共聚焦显微镜观察，拍摄所有照片时，参数固定不变。运用Imaris X64 7.4.2软件将所获得的图像进行三维重建，观察血管形态，并通过图像叠加和像素计算的方式测定绿色荧光像素值，反映毛细血管密度，将假手术组设定为1（100%），其余各组数据为与假手术组比较的倍率值。2.6　缺血灶周围区域组织病理形态变化麻醉小鼠后，断头取出全脑，置小鼠脑切片模具中，选取缺血灶部位，切取冠状切片（3 mm），随后将脑片置于10%中性甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（HE）染色后观察缺血灶周围区域组织病理形态变化。2.7　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠缺血灶周边脑组织VEGF、CD31、ANG、HIF-1α、vWF蛋白表达麻醉小鼠后，断头取全脑，分离缺血部位脑组织，RIPA蛋白裂解液提取后，12 000 r·min-1离心15 min（4 ℃、离心半径8.4 cm）取上清，Bradford法进行蛋白含量测定，调整蛋白浓度至同一水平，与等体积上样缓冲液（×5）混合，95 ℃加热5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法进行转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入相应一抗（CD31 1∶1 000，vWF 1∶1 000，ANG 1∶1 000，HIF-1α 1∶1 000，VEGF 1∶2 000），于4 ℃冰箱孵育过夜，次日加入相应二抗（1∶5 000），室温孵育60 min，增强化学发光法显色，Image J软件分析相应条带灰度值。2.8　统计学分析用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，计量资料数据以x¯±s表示，方差齐且符合正态分布者，指标采用单因素方差分析（One-way ANOVA），并进一步采用Dunnett C法进行组间两两比较，P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对脑缺血小鼠mNSS评分与前肢抓力的影响假手术组无神经功能损伤。与假手术组比较，模型组小鼠mNSS评分显著升高，抓力显著减弱（P0.01）；给药14 d后，与模型组比较，银蜜低剂量组抓力显著增加，银蜜高剂量组神经功能评分显著降低，抓力显著升高（P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20222237.T001表1银杏蜜环口服溶液对小鼠mNSS评分与前肢抓力的影响（x¯±s，n=10）Table 1Effect of Yinxing Mihuan oral solution on mNSS and forelimb grasping force in mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1mNSS评分/分抓力/g假手术组-111.19±2.66模型组9.83±1.641）94.07±2.421）银杏叶提取物组12.57.73±1.622）99.19±2.36银蜜低剂量组4128.92±1.32104.60±2.153）银蜜高剂量组8246.23±2.013）113.14±1.823）注：与假手术组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01（表2和表3同）3.2　对脑缺血小鼠缺血灶周边脑组织毛细血管密度的影响采用FITC-Dextran染色法测定小鼠缺血灶周边脑组织毛细血管密度。假手术组毛细血管稀疏、管径较细，模型组缺血灶周围组织区域毛细血管分布较为密集且充盈状态良好。与假手术组比较，模型组毛细血管密度显著增加（P0.01）；与模型组比较，银蜜高剂量组能进一步增加毛细血管密度（P0.05），提示其能增加缺血灶周围组织区域新生毛细血管。见图1、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20222237.F001图1银杏蜜环口服溶液对小鼠FITC-Dextran染色法毛细血管三维成像的影响 （FITC-Dextran，×100）Fig. 13D imaging of capillary by FITC-Dextran method in each group （FITC-Dextran，×100）注：A.假手术组；B.模型组；C.银杏叶提取物组；D.银蜜低剂量组；E.银蜜高剂量组（图2和图3同）10.13422/j.cnki.syfjx.20222237.T002表2银杏蜜环口服溶液对小鼠FITC-Dextran染色毛细血管密度的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of Yinxing Mihuan oral solution on capillary density in mice brain （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1毛细血管密度/%假手术组100.00±4.74模型组155.85±7.231）银杏叶提取物组12.5173.37±8.41银蜜低剂量组412155.08±6.21银蜜高剂量组824185.89±11.312）3.3　对脑缺血小鼠脑组织病理形态的影响假手术组神经元细胞排列整齐、有序，细胞核大，淡染，染色质分布较均匀，核仁清晰，未见变性、坏死等病变；与假手术组比较，模型组神经元细胞排列无序、密度降低，细胞核浓缩，梗死交界带明显变宽，大量胶质细胞增生；与模型组比较，各给药组神经元细胞排列较模型有不同程度恢复，部分细胞变性，中等量胶质细胞增生，梗死交界带轻度增宽或增宽不明显。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20222237.F002图2各组小鼠脑组织结构和病理变化观察 （HE）Fig. 2Structure and pathological changes of brain ineach group （HE）3.4　对脑缺血小鼠缺血灶周边脑组织VEGF、CD31、ANG、HIF-1α、vWF蛋白表达给药14 d后，与假手术组比较，模型组VEGF、CD31、ANG表达有所上调，但差异无统计学意义；给药物后，与模型组比较，各给药组血管新生相关的蛋白表达均有不同程度的上调，其中阳性药银杏叶提取物可明显上调VEGF表达（P0.05），银蜜低剂量组可明显上调HIF-1α、vWF蛋白表达（P0.05），银蜜高剂量组可明显上调CD31、HIF-1α及vWF、ANG蛋白表达（P0.05，P0.01）。见表3、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20222237.T003表3银杏蜜环口服溶液对小鼠缺血侧脑组织VEGF、CD31、HIF-1α、vWF及ANG蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Yinxing Mihuan oral solution on expression of VEGF， CD31， HIF-1α， vWF and ANG on lateral brain tissue in mice （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1VEGF/β-actinCD31/β-actinHIF-1α/β-actinvWF/β-actinANG/β-actin假手术组1.00±0.061.00±0.061.00±0.171.00±0.171.00±0.12模型组1.36±0.121.54±0.171.00±0.131.19±0.092.11±0.38银杏叶提取物组12.51.91±0.212）1.61±0.181.52±0.161.60±0.251.54±0.33银蜜低剂量组4121.58±0.121.80±0.212.77±0.442）2.90±0.512）2.97±0.542）银蜜高剂量组8241.56±0.132.31±0.382）4.28±1.003）3.56±0.733）2.73±0.5010.13422/j.cnki.syfjx.20222237.F003图3各组小鼠缺血侧脑组织VEGF、CD31、HIF-1α、vWF、ANG蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of protein expression of VEGF， CD31， HIF-1α， vWF and ANG on lateral brain tissue of mice in each group4 讨论脑卒中是世界范围内致死致残的主要疾病之一，而缺血性脑卒中是最常见的卒中类型。缺血发生时，血流供应中断，脑微血管内皮细胞完整性受到破坏，紧密连接受损，继而血管形态发生改变［11］。恢复缺血脑组织的血液供应，则有助于缺血性脑卒中后的功能恢复。广义的血管生成，既包括血管形成，又包括血管新生，前者主要由内皮细胞祖细胞从骨髓迁移到缺血区域，参与损伤内皮细胞的修复，后者主要由组织中既存的成熟血管内皮细胞发生增殖、游走，形成小的血管［12-13］。血管重构包括细胞增生、细胞迁移及细胞外基质的产生和降解等过程，并有血管结构、形态等的改变［4，14］，如微血管直径（扩张、狭窄、变细，甚至消失）或密度（增加、减少）的变化。通过药物促进微血管生成与重构，是改善缺血脑组织血供、恢复神经功能的有效治疗策略之一［15-16］。微血管生成与重构的病理生理机制较为复杂，与多种生长因子、血管活性物质及血流动力学等因素及相互作用密切相关。VEGF是促进血管生成经典的、特异性的细胞因子，既发生在转录水平，也发生在转录后水平，同时还在缺血后的神经发生中起到关键性的作用［17］。HIF-1是α、β-异型二聚体，在机体对低氧浓度或缺氧应答中至关重要，能通过调节氧水平影响血管新生相关的基因的表达，在缺血性脑卒中转归方面起到关键性作用［18］。vWF是由血管内皮细胞合成释放一种大的多聚糖蛋白，在止血、血栓形成和炎症细胞募集中起重要作用［14］；CD31是内皮前体细胞的特异性标志物，是免疫球蛋白超家族的成员之一，二者常作为血管内皮细胞标记物，用来检测血管新生［19］。ANG属于特异性血管新生作用因子，能够抵抗血管渗漏，并具有促进血管新生作用［20］。通过药物调节此类生长因子、血管活性物质，能诱导受损脑组织的血管生成与重构，代偿缺血区血供不足的功能，缓解脑缺血后神经功能障碍。银杏蜜环口服溶液是临床上市药物，在治疗缺血性心脑血管病及微循环障碍方面疗效显著，其作用机制涉及抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等，但其是否具有促血管新生作用方面机制研究较少。课题组前期体外实验证实了其可通过诱导血管新生途径保护心、脑微血管内皮细胞缺血缺氧损伤。基于此，本研究采用化学光栓塞型局灶性脑缺血小鼠模型为研究对象，在整体动物水平观察银杏蜜环口服溶液在微血管生成与重构方面的作用机制。研究结果显示，银杏蜜环口服溶液可显著改善缺血性脑卒中模型小鼠神经功能缺损症状（降低神经功能损伤评分），改善其肢体功能障碍（增加前肢抓力），增加缺血灶周围组织区域（IBZ）新生毛细血管密度，病理形态学观察发现该区域神经元坏死、胶质细胞增生等损伤明显减轻，缺血灶周边脑组织血管生成与重构相关蛋白VEGF、CD31、ANG、HIF-1α、vWF等的蛋白表达不同程度上调，以上结果均提示银杏蜜环口服溶液治疗缺血性脑卒中作用机制可能与促进缺血灶周围区域微血管生成与重构有关，同时也为该药临床治疗缺血性脑血管病提供实验依据。