黄芪具有增强机体免疫、强心降压、降血糖、利尿、抗疲劳等作用［1］。根据种植方式的不同，可分为仿野生黄芪和移栽黄芪［2］。因2种黄芪种植方式、生长环境、采挖方式、以及商品价格的不同，2018年课题组参与制定了中华中医药学会团体标准《中药材商品规格等级—黄芪》（T/CACM 1021.4—2018），该标准首次明确制定了黄芪药材分为仿野生黄芪和移栽黄芪2种规格，并通过外观性状差异区分了2种规格黄芪［2-4］，为黄芪药材的优质优价提供了依据。然而2种黄芪的药效及药效物质基础差异主要表现在哪些方面，哪些方面是黄芪药材的道地性特征？这些问题仍然是目前业界研究的重点和难点，阐明这些问题对于保障黄芪品质，促进优质黄芪资源的可持续发展具有重要意义。课题组前期研究表明，黄芪豆腥气和黄芪甜味成分的物质基础为正己醛和甜菜碱等，与移栽黄芪比较，仿野生黄芪豆腥气浓，甜味佳，质量优［5］。且正己醛的含量和黄芪甜味的大小与黄芪中质量指标毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷及总多糖的含量均具有显著正相关性［6］。此外，在黄芪单味药抗疲劳、抗心衰以及在黄芪复方药防治慢性萎缩性胃炎和补血效果方面，仿野生黄芪均优于移栽黄芪［7-10］，提示仿野生黄芪较移栽黄芪具有独特优势。在2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）中规定，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷这2个主要药效成分为黄芪的质量评价指标。研究显示，仿野生黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量高于移栽黄芪，但对于黄芪甲苷移栽黄芪的量却高于野生品和仿野生品［11-12］。这表明在目前的黄芪品质评价指标分析下，移栽黄芪的品质不亚于传统野生和仿野生黄芪。指标的评价与活性比较存在矛盾，说明目前的质量评价并不能够全面准确地评价黄芪品质。黄芪多糖是黄芪中主要活性成分之一，是黄芪发挥免疫调节作用的主要物质基础，其含量远高于黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷［13］。近年来发展出现的糖谱技术是基于糖类化合物的水解而发展形成具有专属性特征的指纹图谱技术，可用于多糖的定性、定量分析，还可用于药材的鉴别和质量评价［14］。本课题组前期系统表征了仿野生黄芪多糖分子量分布图谱，将分子量2 000 kDa多糖组分作为APS-Ⅰ，分子量为10 kDa的多糖组分为APS-Ⅱ［15-16］，通过对2种多糖组分进行免疫活性筛选发现APS-Ⅱ含量占比最大、免疫活性最强［17-18］。在此活性研究基础上，课题组认为APS-Ⅱ可作为黄芪质量控制与品质评价的指标之一。本文通过建立仿野生黄芪和移栽黄芪多糖特征图谱，使多糖组分可根据分子量分布进行系统表征，从整体上反映仿野生黄芪多糖分布特点，探究2种黄芪多糖糖谱差异。此外，本研究将2种黄芪APS-Ⅱ通过三氟乙酸（TFA）水解，比较2种规格黄芪寡糖和单糖特征图谱，找出了2种黄芪不同聚合度寡糖峰面积占比差异以及单糖组成差异。为深入阐明2种黄芪多糖类物质基础差异以及黄芪的品质评价提供参考依据。1 材料Milli-Q Gradient A10 型超纯水仪（密理博上海贸易有限公司），CPA225D型十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司），JHH-6型电热恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），P230型伊力特液相色谱仪（大连伊力特分析仪器有限公司），Neofuge13R型高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），RE-52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），ZX-LGJ-18型冷冻干燥机（上海知信仪器技术有限公司），GS-NF500型膜片式切向流膜分离系统、PES材质GS-10 wDa膜（海顾信生物科技有限公司），6000型蒸发光散射（ELSD）检测器（美国Waters公司），SC-3610型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），X-Amide酰胺HILIC液相色谱柱（华谱仪器科技有限公司，批号19110510515），Venusil XBP C18色谱柱（中国天津博纳艾杰尔科技有限公司，批号VX932505-2），TSK gel GMPWXL凝胶柱（日本东曹公司，批号LACE-08025）。木瓜蛋白酶（索莱宝生物科技有限公司，批号1224H022），D-半乳糖醛酸、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖（源叶生物科技有限公司，批号分别为1110A021、1110C021、909A021、914A022、1124A021、1118A021、2020B918，纯度均99%），麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖（上海惠诚生物科技有限公司，批号分别为2019-03、2019-04、2020-07、2020-09、2021-10、2021-09、2021-03、2021-06，纯度均98%），TFA（中国上海阿拉丁，批号20171126，纯度99%），三氯乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（上海江莱生物科技有限公司，批号分别为20200809、20190523），乙腈、甲醇为质谱级，其余试剂均为分析级。黄芪药材样本由课题组于2022年5月于山西浑源、应县、五寨、天镇及甘肃陇西等产地采集。18批仿野生黄芪生长年限为6年，编号为1~18。12批移栽黄芪生长年限为2年，编号为19~30。药材照片见图1。2种黄芪样品均由山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus var. mongholicus，样品用清水洗净，去除芦头，自然阴干后密封，置于冷库保存备用。10.13422/j.cnki.syfjx.20230663.F001图1仿野生黄芪与移栽黄芪药材外观Fig. 1Appearance of wild-simulated and transplanted Astragali Radix注：A.仿野生黄芪；B.移栽黄芪2 方法与结果2.1　黄芪多糖特征图谱差异分析2.1.1　黄芪多糖提取制备将干燥黄芪粉碎，过100目筛。取黄芪细粉约15 g，按料液比1∶20加入去离子水，搅拌均匀，在90 ℃下水浴静置提取4 h，每1 h搅拌1次，过滤，合并滤液并加入木瓜蛋白酶200 U，搅拌均匀，45 ℃下水浴6 h，再加热到90 ℃灭活5 min，离心（3 500 r·min-1，5 min，离心半径8.56 cm，下同）。取上清液100 mL加10%三氯乙酸水溶液至总体积200 mL，冰浴中手动搅拌15 min后静置30 min，离心，取上清液100 mL，加入无水乙醇900 mL，静置过夜，收集沉淀，冷冻干燥，即得。2.1.2　黄芪多糖供试品的制备取2组样本黄芪多糖，加去离子水配制成质量浓度为5 g·L-1的供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。2.1.3　检测条件色谱柱为TSK gel GMPWXL凝胶柱（7.8 mm×300 mm，13 μm），ELSD雾化管温度95 ℃，漂移管温度105 ℃，载气流速2.5 L·min-1。流动相为纯水，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量20 μL，运行时间15 min。2.1.4　黄芪多糖糖谱测定方法学考察按2.1.2项下方法制备仿野生黄芪多糖供试品溶液，按2.1.3项下检测条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录特征图谱，计算3个色谱峰（APS-Ⅰ组分中2个和APS-Ⅱ组分中1个色谱峰）保留时间（tR）和峰面积占比的相对标准偏差（RSD），3个色谱峰tR的RSD值分别为1.8%、1.4%、1.1%，峰面积占比的RSD值为分别为2.1%、2.7%、1.3%，表明本方法24 h内稳定性良好。按2.1.2项下方法制备仿野生黄芪多糖供试品溶液，按2.1.3项下检测条件连续测定6次，记录特征图谱，计算3个色谱峰tR和峰面积占比的RSD，3个色谱峰tR的RSD值分别为1.25%、1.20%、0.11%，峰面积占比的RSD值分别为2.9%、2.0%、1.0%，表明仪器精密度良好。按2.1.2项下方法制备仿野生黄芪多糖供试品溶液6份，按2.1.3项下检测条件测定，记录特征图谱，计算3个色谱峰tR的平均值分别为5.652、6.221、10.134，RSD值分别为1.9%、1.1%、1.5%，峰面积占比的平均值分别为2.35%、3.24%、94.41%，RSD值分别为2.3%、2.5%、1.7%，表明本方法重复性良好。2.1.5　数据处理与分析将2组黄芪多糖样本图谱文件导入2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件中，生成黄芪多糖特征图谱。运用Graphpad Prism 9软件对2种黄芪APS-Ⅱ峰面积占比进行独立样本t检验，P0.05表示差异具有统计学意义。2种黄芪多糖特征图谱结果见增强出版附加材料，相似度分析结果表明18批仿野生黄芪和12批移栽黄芪多糖糖谱相似度均高于0.99。仿野生黄芪APS-Ⅰ和APS-Ⅱ峰面积占比分别为2.83%~10.83%、89.17%~97.17%，移栽黄芪为6.31%~19.95%、80.14%~91.96%，仿野生黄芪APS-Ⅱ峰面积占比显著高于移栽黄芪（P0.01）。2.1.6　受试者工作特征（ROC）曲线确定差异多糖APS-Ⅱ峰面积占比临界值将仿野生黄芪和移栽黄芪APS-Ⅱ的峰面积比例导入Graphpad Prism 9软件中，采用Analyze中ROC curve进行分析，得ROC曲线下面积（AUC）为0.912，说明此结果可信度高，ROC曲线相关参数见表1、表2。灵敏度和特异度是用于寻找临界值的重要指标［19］。由表2可知，在峰面积比例为92.28%时，特异度和灵敏度最高，分别是84%和85.71%，说明该点是区分仿野生黄芪和移栽黄芪的最佳临界值。10.13422/j.cnki.syfjx.20230663.T001表1APS-Ⅱ峰面积比例ROC曲线参数Table 1ROC curve parameters of APS-Ⅱ peak area ratioROC曲线参数结果AUC0.912标准误差0.04395%置信区间0.833~1.001P值0.0110.13422/j.cnki.syfjx.20230663.T002表2APS-Ⅱ峰面积比例ROC曲线灵敏度、特异度分布Table 2Sensitivity and specificity distribution of ROC curve of APS-Ⅱ peak area ratioAPS-Ⅱ峰面积占比/%灵敏度/%特异度/%灵敏度+特异度/%87.0935.71100135.7187.6942.86100142.8687.9650.00100150.0088.6657.14100157.1490.0357.1496153.1490.9457.1492149.1491.0264.2992156.2991.1864.2988152.2991.5371.4388159.4391.8471.4384155.4391.9578.5784162.5792.2885.7184169.7192.7085.7180165.7193.0385.7176161.7193.2785.7172157.7193.3785.7168153.7193.5892.8668160.8693.78100.0068168.0094.35100.0064164.0094.86100.0060160.0095.07100.0056156.0095.39100.0052152.0095.59100.0048148.0095.71100.0044144.0095.76100.0040140.0095.91100.0036136.0096.10100.0032132.0096.28100.0028128.0096.55100.0020120.0096.80100.0016116.002.2　仿野生黄芪与移栽黄芪APS-Ⅱ寡糖糖谱差异分析2.2.1　黄芪寡糖溶液的制备依据文献［20］方法，用去离子水将APS配制成质量浓度为5 g·L-1溶液，通过分子截留量为10 kDa的超滤膜得到APS-Ⅱ溶液，冷冻干燥。精密称取不同批次黄芪APS-Ⅱ 100 mg溶于10 mL水中，分别取1 mL于10个水解管中，每管加入2 mol·L-1的三氟乙酸溶液1 mL，放入80 ℃烘箱中加热水解1 h，减压蒸发至干，加无水甲醇1 mL后减压蒸发至干，重复3次除去多余的酸，用1 mL超纯水复溶，即得黄芪寡糖溶液，将10管合并，浓缩，冷冻干燥，4 ℃冷冻保存备用。2.2.2　对照品溶液制备精密称取麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖和麦芽九糖（聚合度为2~9）5 mg置于同一量瓶中定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷冻保存备用。2.2.3　供试品溶液制备取黄芪寡糖溶液加去离子水配制成质量浓度为2 g·L-1寡糖溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷冻保存备用。2.2.4　检测条件采用X-Amide酰胺HILIC液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~55 min，85%~50%B），流速1 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量20 μL，ELSD检测器漂移管温度105 ℃，载气流速2.5 L·min-1。2.2.5　黄芪寡糖谱测定方法学考察按2.2.3项下方法制备仿野生黄芪寡糖供试品溶液，按2.2.4项下检测条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录特征图谱，计算聚合度2~9糖色谱峰tR的RSD分别为1.1%、1.4%、0.4%、1.0%、3.0%、2.7%、2.1%、1.2%，表明本方法24 h内供试品稳定性良好。按2.2.3项下方法制备仿野生黄芪寡糖供试品溶液，按2.2.4项下检测条件连续测定6次，记录特征图谱，计算聚合度2~9糖色谱峰tR的RSD分别为1.5%、1.9%、1.5%、1.2%、0.9%、0.9%、0.9%、0.6%，表明仪器精密度良好。按2.2.3项下方法制备2组黄芪寡糖供试品溶液各6份，按2.2.4项下条件检测，记录特征图谱，计算聚合度2~9糖色谱峰tR的平均值分别为12.385、16.802、20.376、24.152、26.932、29.257、31.258、33.214，RSD分别为1.2%、1.8%、1.8%、1.6%、2.9%、3.0%、1.9%、1.1%，表明本方法重复性良好2.2.6　数据处理与分析按照2.1.5项下黄芪多糖特征图谱绘制方法，采用2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件绘制2种黄芪寡糖特征图谱。SIMCA 13.0软件对2种黄芪不同聚合度寡糖峰面积占比进行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。本研究将麦芽糖至麦芽九糖进行色谱表征用于寡糖聚合度的确定，色谱图见增强出版附加材料。不同批次仿野生黄芪和移栽黄芪APS-Ⅱ组分通过TFA部分酸水解，HPLC-ELSD表征后，采用2012版中药色谱指纹图谱相似度评价软件对降解寡糖糖谱进行分析，结果见增强出版附加材料，相似度分别为0.99和0.89。通过分析，仿野生黄芪糖谱寡糖峰的个数明显多于移栽黄芪。对不同聚合度峰面积占比分析得出，仿野生黄芪寡糖聚合度为2至聚合度≥10的峰面积占比依次为10%、9%、9%、8%、8%、7%、6%、5%、15%；移栽黄芪依次为13%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%。仿野生黄芪APS-Ⅱ能够降解出更多聚合度≥10的糖链。2.2.7　黄芪寡糖峰面积占比多元统计分析为找出2种黄芪APS-Ⅱ在寡糖层面的差异，将2种黄芪寡糖峰面积占比进行多元统计分析。PCA结果显示，2种规格黄芪可明显区分，表明二者在寡糖峰面积占比层面存在差异，见增强出版附加材料。为筛选主要差异成分，运用有监督的OPLS-DA进行处理，结果模型的R2X（表示解释X矩阵信息的能力）为1，R2Y（表示解释Y矩阵信息的能力）为0.960，Q2（表示模型预测能力）为0.939，且R2-Q20.3，说明模型具有良好的拟合效果和预测能力。通过变量重要性投影（VIP）值分析得出，差异贡献最大的组分为聚合度≥10寡糖组分峰面积比之和。仿野生黄芪寡糖聚合度≥10的峰面积占比为11.835%~19.092%；移栽黄芪为2.778%~7.017%。VIP分析结果见增强出版附加材料。2.3　仿野生黄芪和移栽黄芪单糖糖谱差异分析2.3.1　黄芪单糖溶液的制备依据文献［20］方法，用去离子水将黄芪多糖配制成质量浓度为5 g·L-1溶液，并通过分子截留量为10 kDa的超滤膜得到APS-Ⅱ溶液，冷冻干燥。称取5 mg APS-Ⅱ样品置于10 mL水解管中，加入2 mol·L-1的TFA 3 mL溶解，密封，置于120 ℃烘箱中加热水解2 h。取出放冷至室温后，转移至圆底烧瓶中。加入甲醇2 mL，减压蒸发至干，重复3次，去除残余的TFA。将水解产物溶于1 mL纯水中，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷冻保存备用。2.3.2　黄芪单糖对照品溶液的制备及衍生化分别精密称取甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖对照品0.030 3、0.033 4、0.035 8、0.033 3、0.085 5、0.034 2、0.078 5 g，将各单糖对照品称至7个10 mL离心管中，加超纯水5 mL，溶解并混匀，即得单个对照品溶液。分别取上述单个对照品溶液0.2 mL混合即得最终的混合对照品溶液。取混合对照品溶液0.2 mL至离心管中，与含0.5 mol·L-1PMP的甲醇溶液0.24 mL及0.3 mol·L-1 NaOH水溶液0.2 mL混合，充分振摇，放至恒温金属浴中，70 ℃、300 r·min-1反应70 min。冷却至室温，加入0.3 mol·L-1 HCl水溶液0.24 mL进行中和，并加入三氯甲烷1 mL萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。2.3.3　黄芪单糖供试品的制备及衍生化精密吸取2.3.1项下的黄芪单糖溶液0.2 mL按照2.3.2项下方法衍生化处理后，即得。2.3.4　检测条件色谱柱为Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为NaH2PO4水溶液（pH 6.7，50 mmol·L-1），流动相B为乙腈，等度洗脱（0~40 min，18%B），流速为1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，检测波长250 nm，进样量20 μL。2.3.5　数据处理与分析采用2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件绘制2种黄芪APS-Ⅱ单糖特征图谱并计算相似度，见增强出版附加材料。采用SIMCA 13.0软件对2种规格黄芪不同单糖峰面积占比进行PCA及OPLS-DA。相似度分析显示2种黄芪单糖糖谱相似度均高于0.99，表明不同种植方式黄芪多糖的单糖组成相近，均由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6种单糖组成的。不同单糖的相对峰面积在2种规格黄芪中占比有所差异，仿野生黄芪和移栽黄芪甘露糖峰面积占比分别为0.1%~1.0%、0.4%~1.0%，鼠李糖为0.1%~2.0%、0.7%~4.3%，半乳糖醛酸为0.8%~4.0%、1.5%~2.0%，葡萄糖为87.2%~93.9%、74.3%~85.8%，半乳糖为1.3%~3.7%、3.1%~7.4%，阿拉伯糖为2.4%~5.8%、5.1%~10.8%。2.3.6　仿野生黄芪与移栽黄芪单糖峰面积占比多元统计分析为进一步分析2种黄芪单糖组成差异，对2组样本单糖峰面积占比进行多元统计分析。采用PCA对2种规格黄芪进行整体趋势分析，结果见增强出版附加材料。结果显示，2组样本有明显的区分趋势，表明2种规格黄芪单糖峰面积占比存在差异。采用有监督的OPLS-DA进行分析，模型的R2X（表示解释X矩阵信息的能力）为1，R2Y（表示解释Y矩阵信息的能力）为0.688，Q2（表示模型预测能力）为0.586，且R2-Q20.3，说明模型具有良好的拟合效果和预测能力。通过差异组分VIP值分析得出，差异贡献最大的组分为阿拉伯糖和葡萄糖。仿野生黄芪中阿拉伯糖和葡萄糖峰面积占比分别为85%~93.9%，2.7%~5.8%。移栽黄芪为74.3%~87.3%和5.3%~10.7%。VIP分析结果见增强出版附加材料。3 讨论仿野生黄芪种植主要采用人种天养模式（种子直播，根垂直生长），生长环境恶劣，土壤为风化的花岗岩或片麻岩颗粒，质地疏松且腐殖质含量高，根深可达1 m左右，通常生长6年以上。移栽黄芪则采用第一年人工育苗，第二年采用移苗平栽方式生长，人工施肥，生长环境好，由于根横向生长，生长长度受到限制，通常只生长1~2年［2-4］。土壤、光照、降水、气候、地形等生态因子的变化会对药材品质产生重要影响［21-23］。移栽黄芪相比于仿野生黄芪虽然种植规模大，易采收，产量高，但却改变了传统仿野生黄芪的种植环境。因此，如何全面评价2种黄芪品质是当下黄芪药材品质研究的重点。黄芪多糖是黄芪发挥免疫活性的物质基础 ［24-25］，但由于中药多糖分子量大，结构复杂，很难参与中药材的质量控制［26］。本研究采用糖谱法比较了仿野生黄芪和移栽黄芪的多糖糖谱，发现2种黄芪的多糖组成均是由APS-Ⅰ和APS-Ⅱ两部分组成，其中免疫活性组分APS-Ⅱ［13］的峰面积占比具有显著性差异，以活性多糖组分APS-Ⅱ含量占比作为质量控制指标，并采用ROC曲线确定了仿野生黄芪与移栽黄芪APS-Ⅱ组分峰面积占比的临界值为92.28%。除APS-Ⅱ含量积累不同，APS-Ⅰ也具有差异，结果显示仿野生黄芪和移栽黄芪APS-Ⅰ峰面积占比分别为2.83%~10.83%和6.31%~19.95%。分子量分布是影响多糖生物学活性的重要因素之一［27］，前期研究显示，分子量为10 kDa的APS-Ⅱ免疫促进活性优于分子量2 000 kDa的APS-Ⅰ，但是APS-Ⅰ抗炎活性优于APS-Ⅱ，推测是由于APS-Ⅰ较APS-Ⅱ具有更高的糖醛酸含量占比所致［28］。提示2种黄芪种植方不同会影响其不同分子量多糖组分的含量积累和多糖组成，进而影响其活性，该结果为2种黄芪在免疫调节、抗炎方面的临床分类应用提供了依据。进一步将2种黄芪APS-Ⅱ水解为寡糖与单糖，并表征了2种黄芪APS-Ⅱ的化学组成特征，发现二者聚合度≥10的寡糖、葡萄糖和阿拉伯糖的峰面积占比均有差异，提示2种黄芪APS-Ⅱ的结构可能有所不同。课题组前期研究中已证明聚合度≥10的糖链具有较高比例的分支结构［29］，而糖链具有较高的分支度和α-1，5-阿拉伯糖糖苷键及α-1，4-葡萄糖糖苷键且C-3，C-6位存在分支的糖链连接方式均被证明具有较高的生物学活性［29-30］，因此推测上述结构差异可导致2种黄芪APS-Ⅱ药理活性有所不同。本研究对比了2种种植方式黄芪之间的糖谱差异，结果显示2种黄芪在多糖的组成及多糖结构方面均存在差异，为黄芪品质划分及黄芪多糖药物的开发利用提供了新思路。但是2种黄芪在多糖和寡糖结构层面的差异尚未明确，后续将进一步选取不同糖苷水解酶探讨2种黄芪多糖结构特征差异。