Ziel: Der U6-Promotor ist ein Schlüsselelement, das die Expression von Leitfaden-RNA (sgRNA) im CRISPR/Cas9-Gen-Editierungssystem bei zweikeimblättrigen Pflanzen steuert und sich aus kurzen palindromischen Wiederholungssequenzen (CRISPR) zusammensetzt. Endogene U6-Promotoren innerhalb einer Spezies weisen in der Regel eine höhere Transkriptionsaktivität auf, was die Effizienz der Geneditierung erheblich steigert. Diese Studie zielt darauf ab, endogene U6-Promotoren in Beifuß (Artemisia annua) zu identifizieren, um dessen CRISPR/Cas9-System zu optimieren, was für die molekulare Züchtung von Beifuß von großer Bedeutung ist. Methoden: Basierend auf der hochkonservierten U6-snRNA-Sequenz von Arabidopsis wurden endogene U6-Promotorsequenzen aus dem vollständigen Genom von Beifuß ausgewählt. Anschließend wurden rekombinante Vektoren konstruiert, die das Luciferase-Gen (LUC) unter der Kontrolle der Kandidaten-U6-Promotoren exprimieren, welche transient in Tabak transformiert wurden. Die Transkriptionsaktivität der einzelnen Promotoren wurde mittels in-vivo-Bildgebung und einem doppelten Luciferase-Berichtssystem verglichen. Ergebnisse: Es wurden erfolgreich acht endogene U6-Promotoren aus Beifuß geklont. Die Sequenzanalyse zeigte, dass diese Promotoren konservierte cis-regulatorische Elemente USE und TATA-Box enthalten, welche ihre Transkriptionsaktivität beeinflussen. Die Doppel-Luciferase-Aktivitätsmessung ergab, dass die Transkriptionsaktivität von AaU6-3, AaU6-1 und AaU6-5 signifikant höher war als die von AtU6-26 in Arabidopsis, wobei AaU6-3 die höchste Aktivität aufwies. Fazit: Die Studie identifizierte drei endogene U6-Promotoren mit hoher Transkriptionsaktivität in Beifuß und liefert wichtige funktionelle Elemente für den Bau eines effizienten Geneditierungssystems, was die präzise molekulare Züchtung und Innovation hochwertiger genetischer Ressourcen von Beifuß fördert.

Beifuß;U6-Promotor;Transkriptionsaktivität