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L'acide néochlorogénique améliore la prolifération des cellules de formation de kératine psoriasique et l'inflammation en ciblant HSP90 pour réguler la voie de signalisation NF-κB/NLRP3

  • role： First author第一作者
  • Affiliation：

    Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100053， China

    Artemisinin Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

  • Email：434839638@qq.com
  • Introduction：江梦瑶，在读博士，执业医师，从事中医药防治皮肤病的机制研究，E-mail：434839638@qq.com
JIANG Mengyao12,  
  • Affiliation：

    Artemisinin Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

ZHANG Xinwei2,  
  • role： Corresponding author通信作者
  • Affiliation：

    Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100091， China

  • Email：bean5@126.com
  • Introduction：杨斌，硕士，副研究员，主要从事中药药理学研究，E-mail：bean5@126.com
YANG Bin3*,  
  • role： Corresponding author通信作者
  • Affiliation：

    Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100053， China

    Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100091， China

  • Email：songping@vip.126.com
  • Introduction：宋坪，博士，主任医师，从事中西医结合防治皮肤病研究，E-mail：songping@vip.126.com；
SONG Ping13*

résumé

objectif de l'étude les cibles protéiques et le mécanisme moléculaire de l'acide néochlorogénique (NA) lié directement et l'amélioration de la prolifération des cellules de formation de kératine psoriasique et la réaction inflammatoire. Méthodes Les cellules HaCaT induites par M5 ont été utilisées comme modèle de prolifération épidermique psoriasique et de cellules inflammatoires. Tout d'abord, une évaluation de la viabilité cellulaire a été réalisée à l'aide du kit de test de prolifération et d'activité cellulaire (CCK-8) pour évaluer l'efficacité de la sonde NA synthétique (NA-P) et du médicament NA d'origine sur la viabilité cellulaire. Dans la plage de concentration sûre, l'efficacité de l'NA et de l'NA-P a été évaluée, avec utilisation du CCK-8 pour tester l'effet de 0 à 100 μmol·L-1 d'NA et de la sonde sur la prolifération des cellules HaCaT induites par M5, et avec un dosage immunoenzymatique (ELISA) pour tester l'effet de 20, 40, 80 μmol·L-1 d'NA et de 80 μmol·L-1 d'NA-P sur l'expression de facteurs inflammatoires du TNF-α, de l'interleukine (IL)-1β, de l'IL-23, de l'IL-17A, et avec une RT-PCR en temps réel pour tester l'effet de l'NA sur l'expression de l'ARNm de Kératine 16 (K16), de la protéine de liaison au calcium S100A9 (S100A9), de la protéine de liaison au calcium S100A7 (S100A7), de l'IL-6, de l'IL-17A, et du ligand chimiokine 1 (CXCL1) dans les cellules HaCaT. Utilisation de la sonde NA-P pour le marquage fluorescent in vitro et des expériences de compétition, et utilisation de l'expérience de capture combinée à la spectrométrie de masse en phase liquide (Pull-down/LC-MS/MS) pour la pêche et l'analyse des protéines cibles. Utilisation d'expériences de capture combinée à immunomarquages protéiques (Pull down-WB), d'analyses de transferts thermiques cellulaires combinées à immunomarquages protéiques (CETSA-WB), de mécanismes de ligand de molécules pour une vérification des cibles. Enfin, à l'aide de RT-PCR en temps réel pour tester l'effet de 20, 40, 80 μmol·L-1 d'NA et de 80 μmol·L-1 d'NA-P sur l'expression de l'ARNm d'IL-1β, de la protéine 3 des récepteurs de type NOD à domaine de liaison aux oligomères (NLRP3), et de la caspase-1 associée à l'apoptose (Caspase-1) dans les cellules HaCaT; et d'immunomarquages protéiques (Western blot) pour tester l'expression de la phosphorylation de p65 (p-p65), de p65, de la phosphorylation d'alpha du facteur nucléaire kappa B inhibiteur (p-IκBα), de l'inhibiteur d'alpha du facteur nucléaire kappa B (IκBα), et de la protéine de choc thermique 90 (HSP90) dans les cellules. Résultats dans une concentration sûre de 200 μmol·L-1, comparé au groupe de contrôle, la prolifération des cellules HaCaT du groupe M5, l'expression des facteurs inflammatoires TNF-α, IL-1β, IL-23, IL-17A ont augmenté, l'expression des ARNm de K16, S100A9, S100A7, IL-6, IL-17A, CXCL1 a augmenté. Comparé au groupe M5, les cellules des groupes NA-L, NA-M, NA-H, NA-P-H avec 5~100 μmol·L-1 d'NA et NA-P ont été inhibées, l'expression des facteurs inflammatoires TNF-α, IL-1β, IL-23, IL-17A a diminué, l'expression des ARNm de K16, S100A9, S100A7, IL-6, IL-17A, CXCL1 a diminué (P<0.05). Une compétition entre 200 μmol·L-1 d'NA et 100 μmol·L-1 d'NA-P a sélectionné avec succès une protéine cible HSP90 à haute fiabilité par Pull-down/LC-MS/MS. Comparé au groupe de contrôle, l'expression des ARNm de NLRP3, de IL-1β, de ASC, de Caspase-1 des cellules HaCaT du groupe M5 ont augmenté, la phosphorylation p-p65/p65, p-IκBα/IκBα ont augmenté, l'expression de la protéine HSP90 a augmenté (P<0.05). Comparé au groupe M5, les cellules des groupes NA-L, NA-M, NA-H, NA-P-H ont diminué l'expression des ARNm de NLRP3, IL-1β, ASC, Caspase-1 (P<0.05); les groupes NA-M, NA-H ont diminué la phosphorylation p-p65/p65, p-IκBα/IκBα (P<0.05), le changement de la protéine HSP90 n'était pas évident. Pull down-WB a montré que l'NA peut directement cibler la protéine HSP90, et que la liaison de l'NA à la protéine HSP90 peut renforcer sa stabilité thermique, la liaison moléculaire à la protéine HSP90 familiale HSP90AA1, HSP90B1 et HSP90AB1 par l'analyse. Conclusion Na pourrait inhiber la prolifération des cellules de formation de kératine psoriasique et l'inflammation, son mécanisme pourrait être réalisé en régulant la voie de signalisation NF-κB/NLRP3 à travers la ciblage direct de HSP90.

mots-clés

acide néochlorogénique; protéine de choc thermique 90 (HSP90); voie de signalisation NF-κB/NLRP3; prolifération des cellules de formation de kératine psoriasique; inflammation

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