膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，其发病率在泌尿生殖系统恶性肿瘤中居第2位。根据美国癌症学会发布的全球癌症统计表明，2020年膀胱癌全球新发病例约为59.7万例；且大多数地区膀胱癌发病率有明显性别差异，以东亚地区为例，男性膀胱癌发病率约为女性发病率的4倍［1］。膀胱癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素，其中吸烟和职业接触芳香胺类化学物质是较为明确的两大致病危险因素［2］。膀胱癌常规治疗手段有经尿道肿瘤电切、膀胱部分切除/全切、放化疗、靶向治疗等，但是由于膀胱癌具有多灶性、种植性、尿源性等特点，导致膀胱癌术后容易复发，治疗效果不理想［2］。石斛是生长在我国黔、桂、浙等地的有名的一类中药材，传统中医药中石斛常用于滋阴补益，现代药理学研究表明石斛具有扩张血管、抗衰老、增强人体免疫力等作用［3］。毛兰素C18H22O5，2-甲氧基-5-［2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-乙基］-苯酚是从石斛提取物中分离得到的一种低分子量联苄类化合物，相对分子质量为318.36，是鼓槌石斛、金钗石斛［4］发挥药用价值的重要生物活性成分。毛兰素具有抗菌［5］、抗病毒［6］及抗血管生成等活性，近年来研究显示，毛兰素及其衍生物在抗肿瘤临床治疗方面应用潜力巨大［7］。洪卫等［8］研究表明，毛兰素可抑制胃癌细胞SGC-7901端粒酶活性，使端粒无法维持稳定长度，端粒随肿瘤细胞的分化而缩短，最终致细胞衰老死亡；苏鹏等［9］研究也表明，毛兰素可通过抑制蛋白激酶B（Akt）活性，下调髓细胞白血病-1（Mcl-1）蛋白表达及激活DNA修复酶（PARP），阻滞其细胞周期于DNA合成后期/DNA分裂期（G2/M期），从而对人肝癌细胞Huh7起到增殖抑制作用；GONG等［10］研究表明，毛兰素可下调人脐静脉内皮细胞乳酸产量，葡萄糖消耗和细胞内腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平，抑制内皮细胞代谢的效用提示了毛兰素的抗血管生成作用。本课题组前期实验发现毛兰素能够抑制膀胱癌细胞T24增殖活性，并下调Akt表达水平。本实验以膀胱癌细胞5637为研究对象，进一步验证毛兰素对膀胱癌细胞Akt表达水平的影响，并通过慢病毒载体建立5637细胞Akt稳定过表达株，探讨Akt在毛兰素介导的膀胱癌细胞5637增殖活性抑制及糖酵解调控中的意义，为毛兰素抗肿瘤提供新的理论依据。1 材料1.1　细胞膀胱癌5637细胞株（已传40代）购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。Akt稳定过表达5637细胞株（已传10代）由上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室郭维杰博士赠送。1.2　药品及试剂毛兰素（上海源叶生物科技有限公司，批号B20844，纯度≥98%），采用二甲基亚砜（DMSO）试剂（美国Sigma-Aldrich公司，批号D2438）作溶剂溶解毛兰素，过滤除菌后，室温避光存放备用。DMEM高糖培养基（美国Sigma-Aldrich公司，批号D2438）；胎牛血清（FBS，美国Corille公司，批号C1015-05）；细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂（上海同仁化学研究所，批号CK04）；p21单克隆抗体，p27单克隆抗体，Akt单克隆抗体，磷酸化（p）-Akt单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗和鼠抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为2947S，2552S，C67E7，S473，7074P2，7076P2）；β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（美国Proteintech公司，批号66009-1-Ig）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司，批号23327）；细胞周期检测试剂盒，Annexin-V-FITC/碘化丙啶（PI）双染色法流式细胞检测试剂盒（美国Invitrogen公司，批号分别为F10797，V13241）；葡萄糖摄取检测试剂盒，乳酸含量检测试剂盒（美国Promega公司，批号分别为J1341，J5021）；结晶紫染液（中国上海碧云天生物技术有限公司，批号C0121）。1.3　仪器Elix3+30L+3YNERGY型超纯水系统（美国Millipore公司）；311型气套式CO2培养箱（美国Thermo公司）；Infinite M200 pro Nano Quant型光栅型连续波长酶标仪（瑞士Tecan公司）；Allegra X-22R型冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国BD公司）；Mini-PROTEAN Tetra System型电泳仪和转膜仪，ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；GloMax® Discover Microplate Reader型微孔板检测仪（美国Progema公司）。2 方法2.1　细胞培养将5637细胞接种于DMEM培养基中，培养于37 ℃，5%CO2培养箱中，胰蛋白酶常规消化传代，选择处于对数生长期的细胞进行实验。2.2　细胞增殖实验检测过表达Akt后毛兰素对5637细胞增殖的影响胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2 000个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置3个复孔，培养于37 ℃，5%CO2培养箱中，细胞贴壁24 h，加入毛兰素进行干预，其终质量浓度为62.5 μg·L-1。培养细胞2 h，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，空白组给予等体积DMSO（即0 μg·L-1毛兰素处理组）。检测时，每孔加入CCK-8溶液20 μL，继续培养2 h，使用酶标仪检测450 nm波长处各组吸光度A，并计算各组细胞存活率。细胞存活率=A实验组/A空白组×100%。2.3　克隆形成实验检测过表达Akt后毛兰素对5637细胞克隆形成的影响胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2 000个细胞的密度接种于6孔板中，继续培养于恒温培养箱中。培养6 d后加毛兰素，使其终质量浓度为62.5 μg·L-1，以等体积DMSO代替毛兰素作为空白组，同一浓度设置3个复孔，再继续培养6 d后弃去上层培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）洗板2次，细胞用4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，结晶紫溶液染色15 min，清水反复浸洗，室温晾干，采集图像保存后，每孔加入10%的冰乙酸溶液2 mL溶解结晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中，使用酶标仪检测各孔560 nm波长处A，并计算各组细胞存活率。细胞存活率=A实验组/A空白组×100%。2.4　流式细胞仪检测5637细胞周期分布将5637细胞于室温消化后，以每皿1×106个的密度接种于6 cm培养皿，每皿加入培养基5 mL。培养24 h后加入毛兰素进行干预，其终质量浓度为62.5 μg·L-1。24 h后胰酶消化法收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，再以预冷PBS重悬成单细胞悬液，缓慢滴加预冷乙醇，轻轻吹打混匀后，4 ℃固定过夜。染色前取出细胞以预冷PBS洗涤2次，PBS重悬细胞，加入RNase A溶液，37 ℃水浴30 min；加入PI染色液重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min。上机检测激发波长为488 nm，采用FlowJo软件分析各组细胞周期分布。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达细胞培养及加药同2.4项。加等体积DMSO作为空白组，作用48 h后收集细胞，采用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，在蛋白样品中加入上样缓冲液混匀，95 ℃水浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20 ℃冰箱备用。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白样品，转移至NC膜上，5%脱脂奶粉（TBST配制）室温摇床封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜（p21，p27，p-Akt，Akt 1∶500；β-actin 1∶5 000），洗膜，室温孵育二抗1.5 h（兔源性二抗1∶800，鼠源性二抗1∶1 000），洗膜，与ECL发光液反应2~3 min，X射线片曝光，显影，定影，采用Gel-Pro Analyzer图像分析系统计算分析X射线片A。2.6　葡萄糖摄取量测定胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，按1×105个/孔接种于24孔板中，培养于37 ℃，5%CO2培养箱中，细胞贴壁生长24 h，加入毛兰素进行干预，其终质量浓度为62.5 μg·L-1，以等体积DMSO作为空白组，同一浓度设置3个复孔，培养1 d，按照葡萄糖检测试剂盒说明书将预混样品转移至96孔板中，检测前每孔加入2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）检测液100 μL，室温孵育30 min，在发光波长560 nm处检测记录各组细胞荧光素酶荧光强度，即相对发光单位（RLU），评价葡萄糖摄取情况。葡萄糖摄取抑制率=（1-药物组RLU/空白组RLU）×100%。2.7　乳酸生成量的测定细胞培养及加药同2.6项，按照乳酸检测说明书，将样品转移至96孔板，每孔加入预混乳酸检测工作液50 μL，室温孵育1 h，在发光波长560 nm处检测记录各组细胞RLU，评价乳酸含量。乳酸生成抑制率=（1-药物组RLU/空白组RLU）×100%。2.8　统计学分析以上实验均重复3次，所有数据均采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据均以x¯±s表示，多个样本间的均数比较采用单因素ANOVA分析，P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　过表达Akt对毛兰素介导的膀胱癌细胞5637增殖活性抑制的影响与空白组比较，毛兰素组膀胱癌细胞5637 A450 nm明显降低，且随着药物浓度增加，毛兰素组膀胱癌细胞存活率逐渐下降（P0.05），提示毛兰素可抑制膀胱癌细胞5637增殖活性。半数抑制浓度（IC50）为（129.1±0.07）μg·L-1。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T001表1毛兰素对膀胱癌细胞5637存活率的影响 （x¯±s，n=3）Table1Effect of different concentrations of Erianin on survival rate in 5637 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1A450 nm存活率/%空白0.707±0.013100.000±0.000毛兰素3.910.557±0.0161）76.842±4.3581）空白0.719±0.016100.000±0.000毛兰素7.810.493±0.0031）67.275±1.3821）空白0.714±0.014100.000±0.000毛兰素15.620.435±0.0051）59.899±0.6301）空白0.735±0.006100.000±0.000毛兰素31.250.410±0.0101）56.990±1.3391）空白0.733±0.011100.000±0.000毛兰素62.50.381±0.0091）53.146±1.2191）空白0.735±0.023100.000±0.000毛兰素1250.366±0.0051）50.588±0.7781）空白0.702±0.009100.000±0.000毛兰素2500.335±0.0061）45.774±2.1721）空白0.750±0.003100.000±0.000毛兰素5000.313±0.0021）43.763±1.2891）注：与空白组比较1）P0.05。与空白组比较，从1 d开始，Akt组细胞在A450 nm明显升高，且细胞活性明显升高（P0.05）；从1 d开始，空载体加药组细胞在A450 nm明显降低，细胞存活率明显下降（P0.05），表明毛兰素能够抑制膀胱癌细胞5637增殖活性。与空载体加药组比较，Akt加药组细胞A450 nm明显升高，且细胞存活率上升（P0.05），表明过表达Akt能够削弱毛兰素对5637细胞增殖的抑制作用，部分恢复细胞活力。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T002表2过表达Akt对5637细胞存活率的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of overexpression of Akt on survival rate in 5637 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1时间A450 nm存活率/%空白2 h0.276±0.007100.000±0.000Akt0.271±0.00198.036±2.222空载体加药62.50.268±0.00297.050±2.081Akt加药62.50.277±0.001100.063±2.470空白1 d0.568±0.009100.000±0.000Akt0.637±0.0121）112.185±1.8171）空载体加药62.50.340±0.0051）59.909±0.4171）Akt加药62.50.393±0.0152）69.202±2.8902）空白2 d0.843±0.025100.000±0.000Akt空载体加药1.106±0.0721）131.454±8.9531）62.50.508±0.0071）60.412±1.1251）Akt加药62.50.663±0.0112）78.843±2.3122）空白3 d1.537±0.023100.000±0.000Akt2.087±0.0261）135.903±3.5851）空载体加药62.50.598±0.0191）38.931±1.1091）Akt加药62.50.872±0.0162）56.780±1.8112）空白4 d2.137±0.089100.000±0.000Akt2.813±0.0511）132.230±7.3261）空载体加药62.50.702±0.0231）32.928±1.2851）Akt加药62.51.128±0.0082）52.983±2.2722）空白5 d2.792±0.014100.000±0.000Akt3.449±0.1491）123.520±5.4671）空载体加药62.50.817±0.0061）29.248±0.1061）Akt加药62.51.535±0.0222）54.996±0.9992）注：与空白组比较1）P0.05，与空载体加药组比较2）P0.05（表3~6同）。3.2　过表达Akt对毛兰素介导的膀胱癌细胞5637克隆形成抑制的影响与空白组比较，Akt组膀胱癌细胞5637结晶紫染色图像A560 nm明显升高，细胞活性明显增加（P0.05）；空载体加药组膀胱癌细胞5637结晶紫染色图像A560 nm明显降低，克隆形成受到抑制（P0.05），表明毛兰素能够抑制膀胱癌细胞5637克隆形成。与空载体加药组比较，Akt加药组膀胱癌细胞5637结晶紫染色图像A560 nm升高，细胞活性增加（P0.05），结果表明过表达Akt能逆转毛兰素对5637细胞克隆形成的抑制作用。见图1，表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.F001图1过表达Akt对膀胱癌细胞5637克隆形成的影响（结晶紫）Fig.1Effect of overexpression of Akt on clone formation in 5637 cells （crystal violet ）A.空白组；B.Akt组；C.空载体加药组；D.Akt加药组10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T003表3过表达Akt对膀胱癌细胞5637克隆形成的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of overexpression of Akt on clone formation in 5637 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1A560 nm存活率/%空白1.270±0.047100.000±0.00Akt1.630±0.0281）129.552±4.6501）空载体加药62.50.161±0.0031）12.854±0.5881）Akt加药62.50.364±0.0062）28.888±0.8152）3.3　过表达Akt对毛兰素介导的膀胱癌细胞5637周期阻滞的影响与空白组比较，Akt组细胞DNA合成前期（G1期）数目减少，DNA合成期（S期）及DNA合成后期（G2期）细胞数增多（P0.05）空载体加药组5637细胞G1期的细胞比例明显升高，S期和G2期的细胞比例明显减少（P0.05），表明毛兰素能够诱导膀胱癌5637细胞G1期阻滞。与空载体加药组比较，Akt加药组细胞G1期细胞数减少，S期和G2期的细胞比例明显增多（P0.05），结果表明过表达Akt能够逆转毛兰素对膀胱癌细胞5637的周期阻滞作用。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T004表4过表达Akt对膀胱癌细胞5637周期分布的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of overexpression of Akt on cycle distribution in 5637 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1G1期S期G2期空白43.667±0.69042.322±0.67814.010±0.070Akt36.433±0.3791）49.223±0.4101）14.343±0.2961）空载体加药62.580.510±0.2271）18.120±0.3021）1.370±0.2431）Akt加药62.555.960±1.3682）28.173±0.7622）15.870±0.6222）%3.4　过表达Akt对细胞周期相关蛋白的影响与空白组比较，Akt组5637细胞中p21蛋白表达下降，p-Akt水平升高（P0.05）；空载体加药组细胞周期相关蛋白p21的表达上调，p-Akt蛋白表达下调（P0.05）。与空载体加药组比较，Akt加药组5637细胞p21蛋白表达下降，p-Akt水平升高（P0.05）。表明毛兰素能够上调5637细胞p21蛋白表达，过表达Akt能够逆转毛兰素对5637细胞p21蛋白的调控作用。见表5，图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T005表5过表达Akt对膀胱癌细胞5637 p21，p-Akt蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of overexpression of Akt on p21，p-Akt protein expression （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1p21/β-actinp-Akt/β-actinAkt/β-actin空白0.645±0.0020.486±0.0040.513±0.003Akt0.626±0.0011）0.749±0.0031）0.868±0.0011）空载体加药62.50.825±0.0011）0.135±0.0011）0.443±0.0011）Akt加药62.50.695±0.0022）0.172±0.0022）0.298±0.0021）10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.F002图2细胞周期相关蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of cell cycle associated protein expressionA.空白组；B.空载体加药组；C.Akt组；D.Akt加药组3.5　过表达Akt对毛兰素介导的5637细胞糖酵解抑制作用的影响与空白组比较，Akt组细胞葡萄糖摄取明显增加，细胞乳酸生成明显增加，差异有统计学意义（P0.05）；空载体加药组葡萄糖摄取和乳酸生成明显受到抑制，差异有统计学意义（P0.05）；与空载体加药组比较，Akt加药组细胞葡萄糖摄取和乳酸生成明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。表明毛兰素能够抑制膀胱癌细胞5637葡萄糖摄取及乳酸生成，过表达Akt能够逆转毛兰素对葡萄糖摄取和乳酸生成的抑制作用。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20220124.T006表6过表达Akt对葡萄糖摄取和乳酸生成RLU的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of overexpression of Akt on RLU of glucose uptake and lactate production in 5637 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/μg·L-1葡萄糖乳酸空白145 868.667±4 399.886221 660.333±7 481.861Akt214 614.333±3 504.5691）307 677.333±5 422.5681）空载体加药62.569 030.667±848.7851）102 009.000±3 530.4991）Akt加药62.5105 424.000±3 396.0182）149 547.617±4 040.8792）4 讨论癌症中的许多细胞过程归因于激酶信号网络。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路是已被确定为癌症发生的3种主要信号传导途径之一［11］，其中Akt在该信号通路中起主要作用［12］。Akt由PI3K或3-磷酸肌醇依赖性激酶（PDK）及生长因子，炎症和DNA损伤激活，其激活位点为丝氨酸（Ser473）和苏氨酸（Thr308）磷酸化，活化的Akt能够磷酸化下游效应物如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mTORC），糖原合成酶激酶3β（GSK3β），调节细胞存活，增殖，生长，凋亡和糖原代谢等［13］。在包括卵巢癌、肺癌和胰腺癌在内的许多癌症中都观察到Akt的异常过表达或激活，并且与癌细胞增殖和存活增加相关［12］。因此，Akt可为癌症的预防和治疗提供重要途径。近年来，中药有效成分在肿瘤治疗方面具有显著疗效，且具有不良反应较小等优点，具有较强的应用前景。研究表明，黄芪-白花蛇舌草能够抑制肺癌A549细胞增殖［14］；黄酮类（槲皮素），生物碱类（苦参碱），萜类（双氢青蒿素、霞草苷Ⅱ）等化合物，能够通过PI3K/Akt信号通路对前列腺癌起到一定的治疗保护作用［15］；另有研究表明，中药消癌解毒方提取物能够抑制乳腺癌细胞增殖活力、调节细胞周期蛋白表达，且该作用与抑制PI3K/Akt有关［16］。人类通过对肿瘤的长期研究认识到能量代谢的重编程是肿瘤的固有特征。Otto Warburg首先观察到癌细胞即便在有氧环境中也优先选择供能效率极低的糖酵解途径来供能，这便是著名的Warburg效应［17］。肿瘤细胞的Warburg效应发生的主要相关机制有信号转导通路异常（主要为PI3K/Akt信号通路），糖酵解酶表达异常，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），癌基因的激活或抑癌基因失活，线粒体氧化磷酸化功能抑制，肿瘤微环境的改变等。其中，PI3K/Akt信号通路是调控Warburg效应的关键分子机制，它能够影响肿瘤细胞的糖酵解过程，促进肿瘤的发生、肿瘤的侵袭转移、肿瘤的存活及控制血管的生成等［18］。肿瘤细胞通过Warburg效应生成的大量乳酸，借助单羧酸转运蛋白1（MCT1）输出分泌到细胞外基质，通过多种途径诱导肿瘤细胞发生免疫逃避及诱导血管生成［19］。例如，细胞外大量乳酸能够干扰T细胞受体，从而触发p38信号通路激活，导致γ干扰素（IFN-γ）生成受阻，细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）效应器功能受损，丧失其杀伤肿瘤细胞的细胞毒效应，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸［19］；乳酸作为HIF-1α/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的重要刺激因子，能显著促进血管新生，刺激多种肿瘤细胞膜表面乳酸受体GPR81的表达，这种乳酸介导的GPR81活化通过激活细胞内PI3K/Akt信号通路，增加双调蛋白等促血管形成因子的分泌，促进病理性血管的新生［20］。本实验以膀胱癌细胞5637为目标，研究发现毛兰素对膀胱癌细胞增殖活性具有抑制作用，运用慢病毒载体建立5637细胞Akt稳定过表达株，发现过表达Akt能够逆转毛兰素对膀胱癌细胞5637增殖的抑制作用，表明毛兰素通过PI3K/Akt通路抑制膀胱癌细胞5637增殖，为毛兰素发挥抗肿瘤作用提供了新的靶向依据。