在人类肠道中有超过100万亿的微生物，他们以互利共生的方式寄宿在宿主肠道中形成肠道微生物群，同时协同参与机体的新陈代谢、免疫反应和维持肠道结构［1］，并且与多种人类疾病的发生发展密切相关，如心力衰竭、肥胖、神经退行性疾病等［2-4］。有研究甚至认为肠道菌群的差异可用于中医证候的分型，对中医药选择治疗具有潜在指导价值，如拟杆菌门（Bacteroidetes）与帕金森病中医内热证相关，而非特异的厚壁菌门（Firmicutes）分别与帕金森病内热证和痰浊证负相关［5］。因此，通过改变或重塑肠道微生物群来治疗疾病被认为是一种新的治疗策略。近几年，大量研究发现中药能够通过调节肠道菌群的数量和比例，恢复肠道微生物多样性及菌群结构，从而影响机体代谢，发挥其药理特性达到治疗目的。黄连解毒汤能够使高脂饲养的自发性高血压大鼠肠道拟杆菌、杆菌、乳酸杆菌的丰度升高，厚壁菌、毛螺菌、巨单胞菌的丰度显著降低，可有效改善大鼠肠道菌群的紊乱，达到对抗高血压的作用［6］。从心论治方能够使高脂喂养的载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠肠道菌群中Firmicutes与Bacteroidetes的比例降低，使菌群多样性增加，肠道菌群失调得到改善［7］。四君子汤能够显著增加心力衰竭大鼠肠道Firmicutes，乳杆菌属，厌氧芽孢杆菌属丰度，减少Bacteroidetes及Muribaculaceae norank菌属丰度，通过调节肠道菌群失衡对大鼠心肌梗死后心力衰竭产生一定的治疗作用［8］。中药复方祛瘀化痰通脉方是由丹参、川芎、人参、山楂、黄连、泽泻、红曲等7味中药组合而成，具有祛瘀化痰、解毒通脉、行气止痛之功，临床主要治疗痰瘀互结证冠心病心绞痛。在冠心病病理机制中肥胖导致的血脂代谢紊乱在一定程度上反映了中医“痰浊”的致病特性，而血液流变学异常反映了动脉粥样硬化形成过程的血液高黏、高凝状态，二者往往相互影响。前期研究发现祛瘀化痰通脉方能够减少经高脂饲料喂养结合冠脉血管拉伤的痰瘀互结证冠心病中国小型猪心肌缺血程度，增强心功能，改善缺血导致的心肌结构和功能改变，改善血液流变学的异常状态；具有调节血脂的作用，能够通过控制核转录因子-κB p65（NF-κB p65）核移位而降低下游炎症反应，从而抑制中国小型猪冠状动脉粥样硬化斑块的发生和发展；同时可能通过对抗自由基氧化损伤，抑制脂质过氧化反应而对痰瘀互结证冠心病中国小型猪心肌损伤有明显保护作用［9-13］。为充分阐释祛瘀化痰通脉方的作用机制，前期研究考察了2种动物（大鼠和小型猪）和2个状态（正常和模型）下体内入血成分情况，应用液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）体外定量了48个成分，但在体内可以检测完整药时曲线的仅有6个成分，且含量不高，均为纳克级，这对物质基础的发现和功效标志物的寻找提出了挑战，限制了对于成分-效应-生物标志物的关联分析。但前期大量的药理学研究已经证实该方的有效性，本研究也发现祛瘀化痰通脉方调节脂质代谢的良好药效，那么入血成分较少的情况下其发挥作用的机制值得探究。因此，本研究从肠道微生物群的角度，旨在进一步明确祛瘀化痰通脉方的作用机制及其配伍的科学性。1 材料1.1　动物SPF级雄性叙利亚金黄地鼠，7周龄，48只，实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司维提供，合格证号SCXK（京）2016-0011，合格证编号114-7002008112。本实验均符合北京实验动物福利伦理审查指南的相关要求，由中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会审核批准，伦理编号2019XLC016-2。1.2　药物与试剂丹参配方颗粒，人参配方颗粒，川芎配方颗粒，黄连配方颗粒，泽泻配方颗粒，生山楂配方颗粒（北京康仁堂药业有限公司，批号分别为16004411，16013471，16009741，16011721，15017762，16018081），红曲粉末（浙江桐君堂中药饮片有限公司，批号160321）；高脂饲料［北京科奥协力饲料有限公司，合格证号SCXK（京）2014-0010，质量合格证号为11002900028290］；血脂四项［总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）］测定试剂盒（日本日立公司，批号分别为701792，605517，702824，701794）；Qubit dsDNA检测试剂盒（美国Life Technologies公司，批号Q328520）；HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液（HiFi Hot Start Ready Mix，美国KAPA公司，批号KK2501）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（珠海贝索生物科技术有限公司，批号718091）。1.3　仪器580BR10905型聚合酶链式反应（PCR）仪和POWERPAC3000型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；HE-120型电泳仪和Tanon-2500型凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；Aglient 2100 Bioanalyzer型生物分析仪［安捷伦科技（中国）有限公司］；LAbOSPECT003型日立全自动生化仪（日本Hitachi公司）；IlluminaHiSeq2000DNA型测序仪（美国Illumina公司）；NANO DROP型紫外分光光度计（美国Thermo公司）；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司）；VX-02 Multi-Tube Vortex型涡旋混合器（北京绿锦科技有限公司）；MIKRO 22R型低温超速离心机（德国Hettich公司）；Eppendorf 5418型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；MSC-100型恒温混匀仪（美国Thermoelectric公司）；AE240型精密分析天平（美国Metter公司产品）；HR-215S型冰箱（青岛海尔公司）。2 方法2.1　动物分组与模型制备叙利亚金黄地鼠48只，根据功效配伍分为正常组，模型组，复方组，祛瘀组（丹参、人参、川芎和山楂），化痰组（人参、泽泻和红曲）和解毒组（黄连），每组8只。本实验采用高脂饲料喂饲法诱导金黄地鼠高脂模型的形成［14］。48只金黄地鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法随机分为6组，正常组给予普通饲料，其余各组饲以高脂饲料，造模4周。2.2　给药情况给药剂量以前期实验的有效剂量为依据［13］，按照金黄地鼠与人的体表面积换算金黄地鼠的等效剂量，灌胃给予祛瘀组1.11 g·kg-1，化痰组0.39 g·kg-1，解毒组0.07 g·kg-1，祛瘀化痰通脉方组1.42 g·kg-1，正常组与模型组给予等体积的蒸馏水，灌胃量为10 mL·kg-1，每天1次，连续灌胃6周。2.3　检测指标2.3.1　血脂指标检测所有动物于末次给药前1 d禁食12 h，末次给药后1 h，称体质量，各组金黄地鼠腹主动脉取血，3 000 r·min-1离心10 min（离心半径85 mm）收集血清，-80 ℃冷冻保存待测。按照试剂盒说明书进行血清TC，TG，HDL-C和LDL-C测定。2.3.2　肝脏组织HE染色观察取各组金黄地鼠新鲜肝脏相同部位组织1块，10%中性甲醛缓冲液固定过夜，常规石蜡包埋，切片，脱蜡，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝组织形态学变化。2.3.3　肠道菌群16S rRNA高通量测序分析取各组动物粪便-80 ℃冷冻保存待测。采用DNA抽提试剂盒对各个金黄地鼠的粪便样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 μg·L-1。以稀释后的基因组DNA为模板对肠道菌群16S V3-V4区进行PCR扩增，使用带Barcode的特异引物进行PCR，确保扩增效率和准确性。引物序列：343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。PCR产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序。2.3.4　生物信息学分析由Illumina Miseq测序获得原始数据，在微生物多样性测序分析中，先使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂、拼接、精准去杂及去嵌合体等处理，最终得到较优质的序列即valid tags，然后采用Vsearch软件，将序列相似度大于或等于97%被归为一个操作分类单元（OTU）。随后使用QIIME软件包从各OTU中挑选丰度最大的序列作为代表序列，并将所有代表序列与Silva数据库进行比对注释，得到系统发育树和OTU分类表格。物种比对注释使用RDP classifier软件，保留置信区间大于0.7的注释结果。最终执行下游的α和β多样性分析。2.4　统计学分析利用统计分析软件SPSS 20.0处理得到的数据，计量资料均以x¯±s表示，采用独立样本t检验进行统计学分析，P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　祛瘀化痰通脉方及其配伍对高脂金黄地鼠体质量、血脂等指标的影响实验开始前，各组动物体质量没有显著差异，至给药6周后，与正常组比较，模型组金黄地鼠体质量明显增加（P0.05），说明高脂饲料喂养引起模型组动物体质量增加较快；与模型组比较，给药6周后复方组能够明显降低动物体质量（P0.05），而其余各配伍组降低体质量的作用不明显。考虑到动物体质量增长受多种因素影响，如体质量基数，进食量等，因此研究者进行了体质量增长率的分析比较，发现与正常组比较，模型组动物体质量增长较快（P0.01），而与模型组比较，复方给药组能够显著降低金黄地鼠体质量增长速度（P0.01），各配伍组中只有化痰组能够明显减缓实验动物的体质量增长速度（P0.05）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T001表 1祛瘀化痰通脉方及其配伍组对高脂金黄地鼠体质量的影响Table 1Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on body weight of high fat golden hamster （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1给药前/g给药6周/g体质量增长率/%正常110.50±5.40169.25±11.8834.33±6.86模型107.38±7.37192.13±13.521）44.00±3.662）复方1.42110.38±7.13171.75±8.103）35.68±4.114）祛瘀1.11110.00±10.42191.25±16.6042.40±2.96化痰0.39113.88±7.45182.13±23.0736.89±6.363）解毒0.07114.38±9.62191.50±11.2840.31±3.96注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01，与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2，3同）。x¯±s，n=8与正常组比较，模型组血清TC，TG及LDL-C/HDL-C显著升高（P0.01），表明金黄地鼠高脂模型构建成功。与模型组比较，复方组和解毒组均能够明显降低TC，TG及LDL-C/HDL-C，差异均具有统计学意义（P0.05，P0.01）；而化痰组能够显著降低TG水平（P0.01），祛瘀组能够显著降低LDL-C/HDL-C（P0.01），且效果较解毒组和复方组更为显著。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T002表 2祛瘀化痰通脉方及其配伍组对高脂金黄地鼠血脂指标的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on blood lipid of high-fat golden hamster （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL-C/HDL-C正常3.38±0.450.53±0.130.27±0.04模型12.92±3.452）5.46±1.272）1.25±0.122）复方1.429.49±1.523）3.59±0.724）0.97±0.143）祛瘀1.119.87±2.284.17±2.110.87±0.074）化痰0.3911.71±3.083.31±0.824）1.18±0.37解毒0.079.61±1.803）3.74±0.924）1.00±0.243）3.2　祛瘀化痰通脉方及其配伍对高脂金黄地鼠肝脏组织病理学的影响正常组金黄地鼠肝组织结构如常，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状分布，排列整齐有序，肝窦充盈、可见，肝细胞未见肿胀变性，汇管区未见炎细胞浸润及纤维组织增生。高脂模型组金黄地鼠肝组织结构紊乱，肝细胞大片气球样变性，灶性小泡性脂肪变，肝细胞肥大致肝窦不明显，枯否细胞增生，肝小叶内可见炎细胞聚集灶，汇管区轻度炎细胞浸润及纤维组织增生。与模型组比较，复方组肝组织结构较正常，肝细胞气球样变性，但程度及范围较模型组明显减轻，肝细胞肥大不明显，肝窦可见，肝小叶见灶性炎细胞灶，汇管区扩张，血管充血，少量炎细胞浸润及纤维组织增生。其他各配伍组可见肝组织结构不同程度损伤，肝细胞气球样变性及脂肪变性，肝细胞轻度肥大，轻度炎细胞浸润，少量纤维组织增生。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F001图 1祛瘀化痰通脉方及其配伍组对高脂金黄地鼠肝组织形态的影响（HE，×200）Fig.1Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on morphology change of liver tissue in golden hamster with high fat （HE， ×200）A.正常组；B.模型组；C.复方组；D.化痰组；E.祛瘀组；F.解毒组3.3　祛瘀化痰通脉方及其配伍组对高脂金黄地鼠肠道菌群的影响3.3.1　菌群多样性分析肠道菌群多样性分为α多样性和β多样性。α多样性是对同样生物环境下单个样本的物种多样性的分析，常用的有Chao指数，Observed-species指数，Shannon指数及Simpson diversity指数等。不同的指数对于衡量群落多样性的侧重点不同，Chao指数和Observed-species指数反映样品中群落的丰富度，即群落中物种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度情况，Shannon和Simpson diversity指数反映群落的多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响。相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性。各个指数的估算以及计算方法不同，以上指数数值越大，说明样品中的菌群物种越多，多样性越高。与正常组比较，模型组的Chao指数，Observed-species指数，Shannon指数明显降低（P0.05，P0.01），表明模型组中菌群丰富度和多样性明显降低；而与模型组比较，复方组和化痰组能够不同程度的提高菌群丰富度和多样性，且具有统计学意义（P0.05，P0.01）。Simpson diversity指数各组之间虽然差异无统计学意义，但是具有与其他各指数相同的变化趋势。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T003表 3肠道菌群α多样性统计分析 （x¯±s，n=6）Table 3Statistical analysis of Alpha diversity of intestinal flora组别剂量/g·kg-1Chao指数Observed-species指数Shannon指数Simpson diversity指数正常486.24±87.11383.50±87.694.77±1.140.88±0.09模型379.48±72.262）267.90±50.342）3.61±0.861）0.77±0.15复方1.42535.67±62.644）414.75±48.714）4.56±0.853）0.85±0.08祛瘀1.11452.19±77.07322.67±60.093.78±0.560.81±0.07化痰0.39547.68±79.933）412.83±75.383）4.79±0.643）0.89±0.04解毒0.07466.27±56.49327.17±63.473.96±0.710.82±0.08x¯±s，n=6β多样性则为不同生物环境之间的多样性程度的分析，即比较不同分组样本菌群结构的差异。经无监督主成分分析（PCA）发现正常组与模型组菌群结构能够被明显区分，而各给药组介于正常与模型组之间，其中复方组的菌群结构与正常组最接近，其次是化痰组；主坐标分析（PCoA）结果也显示正常组与模型组距离最远，差异最大，各给药组介于两组之间，并且具有向正常组靠拢的趋势，其中复方组与正常组距离最近，其次是化痰组，与PCA分析结果一致。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F002图 2各组金黄地鼠肠道菌群β多样性PCA和PCoA分析Fig.2PCA and PCoA analysis of β diversity of intestinal flora of golden hamsters in each groupC.正常组；M.模型组；F.复方组；H.化痰组；J.解毒组；Q.祛瘀组（图3~5同）3.3.2　肠道菌群门水平丰度变化从肠道微生物门分类水平来看，群落组成中优势菌门主要是Firmicutes，Bacteroidetes，变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria）及脱铁杆菌门（Deferribacteres）等，见图3。与正常组比较，金黄地鼠高脂模型组肠道内优势菌群中Proteobacteria，Deferribacteres，Bacteroidetes菌群丰度明显降低（P0.05，P0.01），Firmicutes丰度具有升高的趋势。而给予中药复方干预后，与高脂模型组比较，祛瘀化痰通脉方金黄地鼠肠道内Proteobacteria，Deferribacteres，Bacteroidetes均明显增加（P0.05，P0.01），而化痰组能够明显增加Proteobacteria和Bacteroidetes在肠道菌群中的丰度（P0.05，P0.01），复方组和化痰组均能显著降低FirmicutesFirmicutes的丰度（P0.05）。与复方组比较，化痰组改善菌群丰度的能力与复方组没有显著性差异。本研究正常组与模型组中Firmicutes的相对丰度变化不大，而Bacteroidetes在各组间差异明显，导致Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）值发生明显改变，与正常组比较，模型组F/B值明显升高（P0.05），与模型组比较，复方组和各配伍组均能够明显降低F/B值（P0.05，P0.01），且各给药组之间差异有统计学意义，因此推断祛瘀化痰通脉方及其配伍组均有助于改善高脂饲料引起的Firmicutes和Bacteroidetes比例失调。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F003图 3各组金黄地鼠肠道菌群组成（门水平）Fig.3Composition of intestinal flora of golden hamsters in each group （phylum level）10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T004表 4祛瘀化痰通脉方及其配伍组对金黄地鼠肠道菌群门水平菌群丰度变化的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on abundance change of intestinal microflora phylum level in golden hamster with high fat （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1FirmicutesProteobacteriaDeferribacteresBacteroidetesF/B正常90.097±4.5620.842±0.4350.156±0.0827.913±3.13313.077±4.568模型94.573±2.2050.239±0.1402）0.009±0.0031）3.878±1.7231）24.116±7.2291）复方1.4286.405±4.3013）1.158±0.5484）0.146±0.1283）14.587±6.0174）6.727±2.5074）祛瘀1.1191.322±2.9260.745±0.3780.024±0.0217.074±2.3905）14.215±4.7433）化痰0.3984.042±5.5903）0.886±0.4163）0.031±0.02512.261±2.2034）7.113±1.7674）解毒0.0789.665±5.3360.586±0.3205）0.018±0.0225）8.855±5.33413.758±8.0803）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01；与复方组比较5）P0.05，6）P0.01（表5，6同）。3.3.3　肠道菌群科水平丰度变化从肠道微生物科分类水平来看，群落组成中优势菌科主要是韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae），真杆菌科（Eubacteriaceae），拟杆菌科（Bacteroidaceae）及瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等，见图4。与正常组比较，模型组肠道内Bacteroidaceae，紫单孢菌科（Porphyromonadaceae），理研菌科（Rikenellaceae），乳酸杆菌科（Lactobacillaceae），梭菌科（Clostridiales_vadinBB60_group），Family_􀃼，毛螺菌科（Lachnospiraceae），脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）及Ruminococcaceae菌群丰度明显降低（P0.05，P0.01），Eubacteriaceae菌群丰度显著升高（P0.01）。中药干预后，与高脂模型组比较，复方组金黄地鼠肠道内Bacteroidaceae，Porphyromonadaceae，Rikenellaceae，Clostridiales_vadinBB60_group，Family_􀃼，Lachnospiraceae及Desulfovibrionaceae菌群丰度均明显增加（P0.05，P0.01），而化痰组能够明显增加Bacteroidaceae，Rikenellaceae，Family_􀃼及Lachnospiraceae在肠道菌群中的丰度（P0.05），降低Eubacteriaceae的丰度（P0.05）；解毒组能够明显增加肠道内Lactobacillaceae的菌群丰度（P0.05）。以上结果显示，模型组肠道菌群科水平的菌群丰度较正常组显著下降，而祛瘀化痰通脉方能够显著改善差异菌群的丰度，化痰组和解毒组能够不同程度的、针对性的改善某些菌群的丰度。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F004图 4各组金黄地鼠肠道菌群组成（科水平）Fig.4Composition of intestinal flora of golden hamsters in each group （family level）10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T005表 5祛瘀化痰通脉方及其配伍组对金黄地鼠肠道菌群科水平菌群丰度变化的影响 （x¯±s，n=6）Table 5Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on abundance change of intestinal microflora family level in golden hamster with high fat （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1BacteroidaceaePorphyromonadaceaeRikenellaceaeLactobacillaceaeClostridiales_vadinBB60_group正常1.640±1.3310.441±0.3040.327±0.20511.556±2.8910.222±0.088模型0.228±0.1582）0.076±0.0332）0.086±0.0402）1.041±0.7892）0.016±0.0062）复方1.423.141±1.5754）0.534±0.2544）0.378±0.1344）0.157±0.1460.173±0.0684）祛瘀1.110.423±0.2796）0.117±0.0726）0.152±0.0725）0.533±0.3720.081±0.096化痰0.391.686±1.3933）0.256±0.1285）0.274±0.1903）0.309±0.2620.047±0.0355）解毒0.070.584±0.3705）0.144±0.0866）0.124±0.1076）4.585±2.6393）0.066±0.058组别剂量/g·kg-1EubacteriaceaeFamily_LachnospiraceaeDesulfovibrionaceaeRuminococcaceae正常17.079±9.7440.146±0.0589.737±4.3440.534±0.27810.216±3.429模型43.692±11.0872）0.021±0.0072）1.525±0.4792）0.034±0.0172）4.867±1.0981）复方1.4232.378±10.8660.138±0.0404）7.115±3.6303）0.709±0.3774）4.779±1.217祛瘀1.1143.710±15.3230.035±0.0355）2.190±1.9225）0.068±0.0636）5.636±4.202化痰0.3926.129±12.4283）0.089±0.0763）7.243±4.1873）0.306±0.2044.214±2.418解毒0.0735.972±12.2140.044±0.0355）3.497±2.9800.138±0.1095）4.400±1.3953.3.4　肠道菌群属水平丰度变化从肠道微生物属分类水平来看，群落组成中优势菌属主要是异杆菌属（Allobaculum），瘤胃球菌属_2（Ruminococcus_2），乳酸杆菌属（Lactobacillus）及拟杆菌属（Bacteroides）等，见图5。与正常组比较，模型组肠道内Bacteroides，巴氏杆菌属（Barnesiella），Odoribacter，理研菌属（Rikenellaceae_RC9_gut_group），Family_􀃼_AD3011_group，优杆菌属（［Eubacterium］_brachy_group），Acetatifactor，粪球菌属（Coprococcus_1），毛螺菌属（Lachnospiraceae_FCS020_group），罗氏菌属（Roseburia），颤杆菌属（Oscillibacter），瘤胃菌属_UCG_005（Ruminococcaceae_UCG_005），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），厌氧棍状菌属（Anaerotruncus），瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium_9），瘤胃菌属_NK4A214_group（Ruminococcaceae_NK4A214_group）及Lactobacillus_UCG_002菌群丰度均明显降低（P0.05，P0.01），而红蝽菌属（Coriobacteriaceae_UCG_002）菌群丰度显著升高（P0.01）。中药干预后，与模型组比较，复方组金黄地鼠肠道内拟杆菌属（Bacteroides），Barnesiella，Odoribacter，Rikenellaceae_RC9_gut_group，Family_􀃼_AD3011_group，Acetatifactor，Coprococcus_1，Lachnospiraceae_FCS020_group，Roseburia，Oscillibacter，Ruminococcaceae_UCG_005，Desulfovibrio，Anaerotruncus，Ruminiclostridium_9及Ruminococcaceae_NK4A214_group菌群丰度均明显增加（P0.05，P0.01），Coriobacteriaceae_UCG_002的表达丰度显著下降（P0.05）。化痰组能够明显增加Bacteroides，Coprococcus_1，Lachnospiraceae_FCS020_group，Oscillibacter及Ruminococcaceae_NK4A214_group在肠道菌群中的丰度（P0.05），同时明显降低Coriobacteriaceae_UCG_002的表达丰度（P0.05），差异有统计学意义；解毒组具有升高Lactobacillus菌群丰度的趋势。各配伍组与复方组整体比较调节肠道菌群属水平丰度的能力，发现复方组菌群丰度的调节能力最强，各配伍组中化痰组对属水平的菌群丰度调节能力较强，同时可能对复方组菌群调节能力的贡献度最高。以上结果显示，高脂血症金黄地鼠肠道菌群属水平的菌群丰度较正常组显著下降，而祛瘀化痰通脉方和各配伍组能够不同程度的改善差异菌群的丰度。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F005图 5各组金黄地鼠肠道菌群组成（属水平）Fig.5Composition of intestinal flora of golden hamsters in each group （genus level）10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.T006表 6祛瘀化痰通脉方及其配伍组对金黄地鼠肠道菌群属水平菌群丰度变化的影响 （x¯±s，n=6）Table 6Effect of Quyu Huatan Tongmai prescription and its combination on abundance change of intestinal microflora genus level in golden hamster with high fat （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1Coriobacteriacae_UCG_002BacteroidesBarnesiellaOdoribacterRikenellaceae_RC9_gut_groupFamily__AD3011_group正常0.004±0.0011.640±1.3310.127±0.0970.033±0.0070.096±0.0610.023±0.013模型0.048±0.0222）0.228±0.1021）0.002±0.0012）0.002±0.0022）0.014±0.0101）0.000±0.0002）复方1.420.018±0.0103）3.141±1.5754）0.098±0.0484）0.040±0.0174）0.169±0.0704）0.007±0.0024）祛瘀1.110.028±0.0180.423±0.2796）0.001±0.0006）0.008±0.0055）0.035±0.0165）0.007±0.007化痰0.390.017±0.0103）1.686±1.3933）0.011±0.0000.010±0.0075）0.079±0.0520.004±0.001解毒0.070.027±0.0180.584±0.3705）0.007±0.0026）0.010±0.0065）0.024±0.0216）0.005±0.002组别剂量/g·kg-1［Eubacterium］_brachy_groupAcetatifactorCoprococcus_1Lachnospiraceae_FCS020_groupRoseburiaAnaerotruncus正常0.053±0.0340.032±0.0110.026±0.0140.035±0.0060.191±0.0940.410±0.266模型0.011±0.0052）0.013±0.0072）0.006±0.0042）0.006±0.0022）0.017±0.0032）0.026±0.0122）复方1.420.049±0.0280.068±0.0353）0.081±0.0524）0.025±0.0104）0.062±0.0254）0.192±0.1163）祛瘀1.110.014±0.0090.016±0.0105）0.014±0.0106）0.011±0.0020.048±0.0220.076±0.0475）化痰0.390.045±0.0380.028±0.0180.044±0.0233）0.027±0.0183）0.071±0.0300.192±0.178解毒0.070.020±0.0150.020±0.0105）0.035±0.0230.017±0.0130.053±0.0170.072±0.0675）组别剂量/g·kg-1OscillibacterRuminiclostridium_9Ruminococcaceae_NK4A214_groupRuminococcaceae_UCG_005DesulfovibrioLactobacillus正常0.200±0.1450.196±0.1110.060±0.0240.045±0.0300.400±0.27411.556±2.891模型0.001±0.0012）0.022±0.0101）0.007±0.0052）0.004±0.0022）0.030±0.0192）2.388±0.8732）复方1.420.050±0.0313）0.085±0.0503）0.055±0.0074）0.068±0.0434）0.622±0.3414）0.053±0.032祛瘀1.110.021±0.0130.031±0.0280.026±0.0215）0.005±0.0016）0.055±0.0236）0.533±0.473化痰0.390.053±0.0213）0.087±0.1180.039±0.0313）0.030±0.0230.120±0.0866）0.309±0.262解毒0.070.038±0.0180.028±0.0260.035±0.0330.009±0.0045）0.126±0.1675）4.585±2.6393.4　差异菌群与血脂指标关联性分析斯皮尔曼相关系数（Spearman相关系数）分析结果显示，在科水平，Lactobacillaceae与TC，TG，LDL-C/HDL-C值均呈负相关（Spearman相关系数分别为-0.75，-0.62，-0.71）；在属水平，Family_􀃼_AD3011_group与TC，TG，LDL-C/HDL-C值均呈负相关（Spearman相关系数分别为-0.66，-0.60，-0.67），Lactobacillus与TC，LDL-C/HDL-C值呈负相关（Spearman相关系数分别为-0.71和-0.67），Roseburia，Oscillibacter均与TG呈负相关（Spearman相关系数均为-0.62）。见图6。10.13422/j.cnki.syfjx.20212403.F006图 6金黄地鼠肠道差异菌群与血脂指标关联性分析Fig.6Correlation between intestinal microflora and blood lipid in golden hamsterA.科分类水平；B.属分类水平；L/H.LDL-C/HDL-C4 讨论中药复方祛瘀化痰通脉方主要治疗痰瘀互结证冠心病心绞痛，具有祛瘀化痰、解毒通脉、行气止痛之功。具有抗心肌缺血，改善心功能和血液流变学的异常状态，抗炎，抗自由基氧化损伤，抑制脂质过氧化等多种特性。脂代谢紊乱被认为是心血管疾病的病理基础，研究中，从中药复方功效配伍的角度，观察祛瘀化痰通脉方及其配伍组对高脂饲料喂养诱导的金黄地鼠的体质量、血脂、肝脏脂肪变性和肠道微生物群的影响。研究结果显示大鼠灌胃祛瘀化痰通脉方和配伍组（祛瘀组、化痰组、解毒组）6周后，复方组能够显著降低金黄地鼠的体质量及体质量增长速度，而各配伍组中只有化痰组表现出降低动物体质量增长率的作用。祛瘀化痰通脉方能够使血清TC，TG和LDL-C/HDL-C值均显著降低，各配伍组中解毒组也能够显著降低这3项血脂指标，化痰组则能够显著降低TG水平，而祛瘀组降低LDL-C/HDL-C值的作用更显著；肝脏组织病理学结果显示肝脏组织结构损伤和肝细胞脂肪变性的形成能够被祛瘀化痰通脉方显著逆转，各配伍组能够不同程度的改善肝细胞脂肪变性。肠道菌群与人体健康的关系越来越引起科学界的重视，甚至认为肠道菌群可看作人体的一个独立的“器官”，认为肠道菌群能为人体提供营养、参与宿主共代谢、调节抗生素敏感性、诱导先天性免疫［15］。肠道菌群中99%的细菌隶属于Firmicutes和Bacteroidetes，主要由厌氧菌组成，有助于宿主的食物消化［16-17］。有研究指出，长期的高脂膳食可增加Firmicutes与Bacteroidetes的比值，并且这一比值的改变与肥胖发生有关联［17-19］。本研究结果亦显示高脂金黄地鼠模型组F/B值较正常组明显升高，祛瘀化痰通脉方及各配伍组均能够显著降低F/B值，说明祛瘀化痰通脉方及其配伍组均有助于改善高脂饲料引起的金黄地鼠肠道菌群Firmicutes和Bacteroidetes比例失调。宿主和肠道微生物群之间的互利关系依赖于复杂的分子交互作用，如肠道菌群通过消化降解膳食纤维等产生短链脂肪酸（SCFA），三甲胺-氮-氧化物（TMAO）等［20-21］，肠道菌群还参与人体合成非必需氨基酸：天冬氨酸、丙氨酸等，以及氨基酸的代谢过程［22］，通过影响肠道pH值、肠道通透性，抑制有害细菌的繁殖，增强肠黏膜的免疫功能，保持肠道内稳态，同时参与机体炎症反应、脂质代谢、氨基酸代谢、神经递质传导等过程影响机体的健康状况及疾病的发展［23-27］。本研究结果显示高脂金黄地鼠肠道内拟杆菌、乳酸杆菌、毛螺菌、罗氏菌、瘤胃球菌等菌群丰度较正常组下降，中药干预可以调节这些菌群的丰度，改善肠道微环境。这些差异菌群均可以影响SCFAs的产生，包括乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐等［28-30］。瘤胃球菌能够产生丁酸盐，也是已知与肥胖直接相关的菌群，有研究显示肥胖个体肠道内其比例会显著上升［31-33］，亦有研究表示其在高脂膳食宿主肠道内的相对丰度较低［34-35］。肠道菌群还可以通过对氨基酸的代谢来影响SCFAs的生成，如在肠道微生物的作用下，亮氨酸、异亮氨酸降解形成异戊酸，缬氨酸代谢形成异丁酸，脯氨酸代谢产生戊酸［36］。研究报道膳食蛋白质的降解导致色氨酸的释放，而色氨酸可被拟杆菌、乳酸杆菌、梭菌属、瘤胃球菌、厌氧棍状菌属、脱硫弧菌等肠道微生物群转化为各种代谢活性物，包括吲哚、色胺、吲哚乙醇等，这些分解代谢产物通过肠上皮吸收进入血液，并以多种方式发挥抑制食欲、胰岛素分泌、减缓胃排空、免疫调控、抗氧化和抗炎作用［37］。在本研究中，以上相关菌群在模型组中相对丰度显著降低，复方干预后相应菌群丰度发生了回调。同时，课题组在进行靶向代谢组分析时发现血清中脯氨酸、色氨酸、吲哚类、戊酸等的含量发生了变化，变化趋势与文献报导一致，另外天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸及异亮氨酸等支链氨基酸、芳香氨基酸和非必需氨基酸也发生了改变，而复方干预后可以进行回调。同时相关性分析结果显示乳酸杆菌属、罗氏菌属及颤杆菌属等与血脂指标TC，TG，LDL-C/HDL-C值呈负相关，即血脂异常情况下这些菌群的丰度较低，且具有较高相关性，这可以为临床疾病预测或风险评估提供借鉴或者思路。研究从中药复方及其配伍对肠道菌群的影响来阐释中药复方功效配伍的科学性，从研究结果可以看出祛瘀化痰通脉方较各配伍组对菌群的调节作用确实更强，包括调节强度和菌群种类，化痰组和解毒组调节的菌群也各有优势，如化痰组和解毒组分别对真杆菌科、乳酸杆菌科特异性的调节作用。另外，解毒组只有一味黄连，但是未能显现出其他相关研究报道中较强的菌群调节作用［38-39］，研究者分析由于是复方拆方，黄连的给药量与复方中的药量是一致的，导致单味药的给药量较低，主要有效成分小檗碱的含量则更低，所以对肠道菌群的改善效果并不是很显著，但对血脂的调控作用与文献报道还是一致的［40-41］。祛瘀组对高脂血症金黄地鼠肠道菌群未显示出明显的调节作用，其与化痰组均有人参，而化痰组显示出更接近于复方组对高脂血症金黄地鼠肠道菌群的调节作用，研究者分析认为各配伍组之间的作用差异可能与药物配伍有关，化痰组伍以长于去除痰浊的泽泻和红曲，相应的脂质代谢紊乱的调节作用则体现的更加显著，而祛瘀组中伍以长于活血的丹参、川芎和山楂，高脂血症模型中瘀血症状不甚显著，因而祛瘀效果体现的也就不明显，这与中医“方证相应”的思想是一致的，亦体现了中药复方配伍的优势和科学性。以上结果显示，各给药组在控制体质量、血脂、肝脂肪变性及改善高脂血症金黄地鼠肠道菌群微环境方面均有不同程度的改善作用，但整体来看祛瘀化痰通脉方各方面的调节作用均明显优于各配伍组，在一定程度上提供了中药复方配伍的科学依据，同时表明调节肠道菌群微环境是中药复方祛瘀化痰通脉方起效的作用机制之一。