结核分枝杆菌是一种对引起死亡人数最多的乙类传染性呼吸道病原体。常感染肺部引起肺结核，临床表现为咳嗽咳痰、偶有痰中带血或咯血，低热乏力、盗汗自汗等［1］。结核病的常规治疗大多依靠化疗，不良事件发生率高，而且容易诱导耐药结核的发生［2-3］。在中医辨证施治中，肺结核称为“肺痨”“肺疳”，早在《黄帝内经》中有记载，“外有痨虫侵袭，内因正气虚弱”。起病之初，邪气盛，主肺阴伤，最易累及脾肾，久之邪毒内盛导致气血两虚，呈阴虚、痰火、瘀热状［4］。抗痨方就是根据这种致病特点组方，由桂林市政府根据民间经验牵头研制，曾获广西壮族自治区科研成果奖。最早官方记载在1977年版《中华人民共和国药典》（一部）［5］，由矮地茶、百部、白及、穿破石、五指毛桃和桑白皮6味药材组成［6-7］。目前以该方为基础的市售剂型有丸、胶囊、冲剂或颗粒等，以颗粒剂型最多见，且各种剂型在市售平台描述功效基本一致。方药中以矮地茶（紫金牛科小灌木）为君药，在宋代《本草图经》中指出，“紫金牛，生福州，叶如茶，上绿下紫，红如丹株”，可化痰止咳、活血化瘀和清湿利热；百部兼顾“杀虫”和润肺止咳，白及善于收敛止血、止痛生肌，二者共为臣药；桑白皮清肺热、泻肺火，助平喘止咳；五指毛桃健脾润肺，行气利湿，补益扶正共为佐药；穿破石活血通经，利于药物到达病灶，为佐使药，诸药相合，共呈祛痰止咳、活血止血和散痰生新之功［6］。目前关于抗痨颗粒在结核病的研究大多集中在结核转阴率、临床症状的控制或免疫功能影响等疗效观察性研究方面，均显示出良好疗效、高安全性，但作用机制尚不完全明确［8-10］。网络药理学系统性地将生物网络和药物网络相结合，为全面探索中医治疗疾病的作用机制提供可能，与传统医药的辨证、系统、整体研究观不谋而合［11］。因此，本研究拟通过联合网络药理和分子对接的技术，筛选抗痨颗粒的主要活性成分并进行靶点预测，构建“中药化学活性成分-关键靶标-作用通路”可视化的网络关系，为更全面深入地探索抗痨方剂中药效物质基础和药效作用的分子机制提供理论支撑，为抗痨颗粒的临床应用和进一步的实验研究提供理论依据。1 资料与方法1.1　中药化学活性筛选在中医药百科全书数据库（ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/）和中药网络数据库分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）中检索抗痨颗粒方中“百部” “矮地茶” “桑白皮” “白及” “五指毛桃”和“穿破石”6味中药，以基本药动学参数口服吸收度（OB）≥30%，类药性（DL）≥18%为标准筛选中药方中的化学活性成分，同时以方中各成分在知网、万方和PubMed进行文献挖掘中药各成分的候选活性成分，与中药数据库TCMSP和ETCM互为补充和复核。1.2　药物成分靶标筛选筛选得到的抗痨颗粒各化学成分在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集其标准化线性格式的SMILES号，并将其在在线数据库SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行药物分子靶点预测，获取排在前15位的基因作为药物可能作用的靶点，以ETCM和TCMSP靶标进行补充和去重得到药物成分靶标。1.3　疾病分子靶标预测人类基因综合数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）是一个整合了多个平台的生物信息数据库，包含丰富的疾病相关分子信息。同时利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）平台（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），以关键词“tuberculosis”，并设置物种为“Homo sapiens”进行搜索，得到疾病相关基因。1.4　关键靶标药物分子-疾病靶点网络构建以中药抗痨颗粒活性成分，GeneCards和NCBI数据库得到的疾病靶点，三者通过FunRich 3.1.3软件进行韦恩图映射，得到疾病靶标药物分子和疾病共同靶点，通过蛋白相互作用数据库STRING进行生物信息分析，用Cytoscape 3.8.0构建靶标药物分子-疾病靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。1.5　基因本体（GO），分子功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将疾病靶标药物分子和疾病共同潜在靶点在生物信息数据库DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）进行分析，同时利用R软件4.0.2版本进行计算，并绘制GO和KEGG富集分析柱状图和气泡图。以P0.01为差异有统计学意义。1.6　分子对接登陆PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）获取靶蛋白晶体结构，使用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取核心药物成分结构并保存，为蛋白分子对接作前期准备。通过CB-Ddock对接，可识别蛋白结合位点并计算出对接口袋大小。通过内置AutoDock Vina进行分子对接，同时对其结构进行打分。完成上述步骤后，使用LeDock对蛋白晶体进行对接，然后使用GraphPad Prism 8.3.0将对接Vina分值绘制成热图，并用PyMOL 2.3.0展示对接3D示意图。1.7　细胞实验验证1.7.1　实验材料人单核细胞THP-1（编号SCSP-567）购自中国科学院细胞库。芝麻素（北京索莱宝科技有限公司，批号IS0650，纯度≥98%）；二甲基亚砜DMSO，RPMI1640，蛋白Marker（美国Thermo公司，批号分别为20688，11875119，26617）；胎牛血清FBS（杭州四季青，特级，货号13011-8611）；青霉素-链霉素溶液，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、蛋白上样缓冲液（碧云天生物科技公司，批号分别为C0222，P0012A，P0015）；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA，美国Sigma公司，货号P8139）；一抗蛋白激酶B1（Akt1），磷酸化Akt1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），山羊抗兔二抗（美国CST公司，批号分别为75692S，4060S，5174，7074S）。1.7.2　细胞模型构建在含10%胎牛血清的RPMI1640中培养THP-1细胞，在培养基中添加100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素，每2~3 d将细胞传代培养1次，在25 μg·L-1PMA存在下，细胞以1×106个/孔的密度在六孔板中培养24 h，以分化成黏附在培养瓶中的巨噬细胞样表型，用脓肿分枝杆菌（感染复数=10）感染分化的巨噬细胞，将细胞继续置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，将细胞分组：①选择预测的结合最佳靶蛋白-药物活性成分（Akt1-芝麻素）中的芝麻素，并根据文献［12］按浓度梯度为0（空白），10，20，40 μmol·L-1 4个梯度，在感染菌液1 h前加入，再以脓肿分枝杆菌感染巨噬细胞1 h后，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔地清洗细胞2次，加入新的完全培养基，继续培养24 h；②以不加药和不加菌液的组为对照组。1.7.3　蛋白免疫印迹法（Western blot）验证收集不同药物梯度下的各组蛋白样品，以蛋白样品和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液4∶1混合，取适量样品上样电泳，转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗（1∶2 000）4 ℃过夜，二抗孵育时间1.5 h，PBS洗膜3次后用增强型化学发光试剂（ECL）显影检测。1.7.4　菌落形成实验取各组细胞的裂解液8 μL，用分枝杆菌液体培养基稀释10倍，超声分散后接种至血平板，3 d后计数菌落情况。1.8　统计学分析用GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据统计分析，定量资料以x¯±s表示，采用单因素方差分析组间差异，组间两两比较用最小显著性差异法（LSD），P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1　抗痨颗粒化学活性成分通过TCMSP和ETCM抗痨颗粒中6种主要成分，以OB≥30%以及类药性DL≥18%为标准筛选，同时与中国知网、万方和PubMed多数据库进行文献资料互为补充和复核，筛选得到抗痨颗粒活性成分29个，其重要成分信息见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220215.T001表1抗痨颗粒部分化学活性成分基本信息Table 1Basic information of main active components in anti-tuberculosis particlesID成分名称成分英文名称OB/%DL来源MOL003621水合橙皮内酯*meranzin hydrate43.610.17五指毛桃MOL001945佛手柑内酯*bergapten42.210.13五指毛桃MOL000561黄芪苷astragalin14.030.74五指毛桃MOL000365丁香树脂酚*syringaresinol3.290.72五指毛桃MOL001950补骨脂素psoralon33.060.10五指毛桃MOL012719桑辛素Omoracin O62.330.44桑白皮MOL005043campest-5-en-3beta-ol37.580.71桑白皮MOL004912光果甘草酮glabrone52.510.50桑白皮MOL003860桑辛素Fmoracin F53.810.23桑白皮MOL003857桑辛素Cmoracin C82.130.29桑白皮MOL003856桑辛素Bmoracin B55.850.23桑白皮MOL003758桑辛素Dmoracin D71.550.34桑白皮MOL002514sexangularetin62.860.30桑白皮MOL000211白桦脂酸mairin55.380.78桑白皮MOL000098槲皮素quercetin46.430.28桑白皮MOL000737桑黄素morin46.230.27穿破石MOL0057562，3，4，7 -四甲氧基菲2，3，4，7-tetramethoxy phenanthrene39.090.29白及MOL0057761-（2，7-二羟基-4-甲氧基-1-菲）-4-甲氧基菲-2，7-二醇1-（2，7-dihydroxy-4-methoxy-1-phenanthryl）-4-methoxyphenanthrene-2，7-diol35.220.67白及MOL0057684，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲4，7-dihydroxy-1-p-hydroxybenzyl-2-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene30.540.55白及MOL0057562，3，4，7-四甲氧基菲2，3，4，7-tetramethoxyphenanthrene39.090.29白及MOL0057551-（4-羟基苄基）-4-甲氧基-9，10-二氢菲-2，7-二醇1-（4-hydroxybenzyl）-4-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene-2，7-diol54.180.55白及MOL000358β-谷甾醇beta-sitosterol36.910.75矮地茶、百部、桑白皮MOL009414百部碱Csessilifoliamide C65.870.20矮地茶、百部MOL001558芝麻素sesamin56.550.83矮地茶、百部MOL000449豆甾醇stigmasterol43.830.76矮地茶、百部MOL000392芒柄花黄素formononetin69.670.21矮地茶、百部MOL000359谷甾醇sitosterol36.910.75矮地茶、百部MOL000422山柰酚kaempferol41.880.24桑白皮、五指毛桃MOL009441（3S，3′R，4′R，9S，9aS）-4′-羟基-3′-甲基-3-［（2S，4S）-4-甲基-5-氧杂环戊烷-2-基］螺［1，2，3，5，6，7，8，9a-八氢吡咯［1，2-a］氮杂环戊烷-9，5′-氧杂环戊烷］-2′-酮（3S，3'R，4'R，9S，9aS）-4'-hydroxy-3'-methyl-3-［（2S，4S）-4-methyl-5-oxooxolan-2-yl］spiro［1，2，3，5，6，7，8，9a-octahydropyrrolo［1，2-a］azepine-9，5'-oxolane］-2'-one85.520.38百部注：*化合物是文献补充的重要活性成分，属于香豆素类化合物［13］。2.2　抗痨颗粒治疗结核病的活性成分靶点通过PubChem和SwissTargetPrediction收集，并与ETCM和TCMSP药物靶标进行补充和去重，筛选得到的抗痨颗粒各化学活性成分靶点基因212个。NCBI得到疾病靶点基因757个，GeneCards平台获得疾病靶点基因2 378个，二者与化学活性成分靶点取交集，最终获得药物抗痨颗粒治疗结核病的潜在靶点28个。2.3　关键靶标药物分子-疾病靶点PPI网络构建通过STRING与Cytoscape 3.8.0构建抗痨颗粒治疗结核病的潜在28个靶点的PPI网络，见增强出版附件材料。这些可能是抗痨颗粒有效成分中治疗结核病的蛋白互作网络中的关键靶点。根据Cytoscape中的复合分子检测法（MCODE）分析得到度中心度和中介中心度（BC）值，用来评估节点的重要性，见表2。按度值（Degree）排名在前五的关键蛋白依次为蛋白激酶B1（Akt1），原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC），人表皮生长因子受体（EGFR），基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和缺氧诱导因子-1α（HIF1A）。按Cytoscape软件的Cyto Hubba插件得到抗痨颗粒治疗结核病的关键药效成分-作用靶点图，见增强出版附件材料，一共包括57个节点和115条边，可认为是抗痨颗粒治疗结核病的关键靶点。10.13422/j.cnki.syfjx.20220215.T002表2Top基因度中心度（Degree Centrality）和MCODE分析Table 2Degree Centrality and MCODE analysis of top genes名称BC度值聚类评分名称BC度值聚类评分Akt10.14384.94NFKB10.02225.44SRC0.26364.96MMP-20.02225.22EGFR0.17364.94SIRT10.09225.44MMP-90.06304.94IL-20.029224.50HIF1A0.02225.44MCL10.01205.34注：类簇均为Cluster 1。2.4　GO和KEGG富集通路分析用R软件的cluster Profiler对前面得到的抗痨颗粒治疗结核病的潜在28个靶点进行分析，得到的41条GO分子条目主要涉及氧代谢反应、核酸转录和代谢酶活性等方面，展示前10条最显著的条目，见增强出版附件材料。结合DAVID对抗痨颗粒治疗结核的28个靶点通路富集分析显示，按富集得到的通路按基因数Count和P值进行排名，排在前20位的通路包括结核分枝杆菌信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路和HIF-1信号通路等，见增强出版附件材料。2.5　分子对接分子对接结果显示，抗痨颗粒中按Degree排名前3的药物活性成分β-谷甾醇、芝麻素和山柰酚，与Akt1，SRC，EGFR，MMP-9和HIF1A关键靶蛋白结合的Vina值显示，15对药物活性成分和靶蛋白作用的Vina值均-7，其中芝麻素与Akt1结合能最小（-9 kcal·mol-1，1 kcal≈4.186 kJ），表明靶蛋白和关键药物活性成分结合能力强，见表3。Akt1与芝麻素相互作用见增强出版附件材料，芝麻素与Akt1中的ASN-265，GLY264及HIS297相结合，见增强出版附件材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20220215.T003表3重要药物有效成分和核心分子对接结果Table 3Docking results of active components and core molecules of important drugs成分靶点结合能成分靶点结合能β-谷甾醇Akt1-7.5SRC-8.9EGFR-8.0MMP-9-8.6HIF1A-7.0山柰酚Akt1-8.2SRC-7.4EGFR-7.8MMP-9-7.6HIF1A-7.8芝麻素Akt1-9.3SRC-8.1EGFR-8.5MMP-9-8.3HIF1A-7.6kcal·mol-12.6　实验验证芝麻素在0，10，20，40 μmol·L-1浓度作用下呈剂量依赖地下调p-Akt的表达，见图1；菌落形成实验表明，芝麻素浓度越高，胞内分枝杆菌越多，显示抗痨颗粒中的关键成分芝麻素具有增强巨噬细胞对分枝杆菌的控制作用，见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220215.F001图1药物芝麻素浓度效应下对蛋白的影响Fig.1Effect of sesamin on protein Akt1A.未加菌未加药；B.加药不加菌；C~F.芝麻素0，10，20，40 μmol·L-110.13422/j.cnki.syfjx.20220215.T004表4药物浓度梯度对应的24 h细胞胞内分枝杆菌负荷 （x¯±s，n=3）Table 4Intracellular mycobacterial load corresponding to drug concentration gradients at 24 h （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1CFU（×103/mL-1）空白26.67±2.88芝麻素1048.67±3.511）2056.67±0.582）4076.67±3.062）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01。3 讨论抗痨颗粒在辅助治疗结核病方面具有良好的疗效，可协同作用于人体内的靶点网络，活血化瘀、祛痰止咳和增强机体免疫功能等发挥综合治疗的作用［3，6，14］。本研究以可视化的方式展现“活性成分-靶点-信号途径”，说明抗痨颗粒以多靶标、多通路的网络途径发挥治疗结核的作用，与中药强调的协同作用和辩证整体的思路相符［15-16］。现重点从药物活性成分和蛋白分子靶点2个方面重点阐述抗痨颗粒治疗结核病的分子机制。3.1　药物活性成分是中医药各种组分实现药效的物质基础本研究从抗痨颗粒方中筛选得到β-谷甾醇、芝麻素和山柰酚等重要活性成分，其中芝麻素衍生物被研究证实对结核分枝杆菌H37Rv表现出良好的抗结核活性［17］，山柰酚（KAE）及其苄基衍生物（KAE3）是很好的结核分枝杆菌CYP121抑制剂配体［18］，符合传统中医药“杀虫”的理念。此外，芝麻素可通过Akt和ERK激活增强Nrf2介导的结肠炎氧化应激和炎症的保护性防御［19］，对于调节免疫和保护肠黏膜免受氧化应激损伤具有一定的作用。β-谷甾醇可抑制炎症因子白细胞介素（IL）-1β，调节巨噬细胞免疫功能［20］。山柰酚通过抑制血小板活化和血栓形成、槲皮素能抑制凝血酶的活性，协同实现活血化瘀的功效［21］。表明抗痨颗粒可通过多种药效成分抑菌杀菌、调节免疫和活血化瘀等实现抗结核分枝杆菌的感染。3.2　蛋白靶点是药物和疾病联结的重要“桥梁”结核病和抗痨颗粒交集的靶点获包括Akt1，SRC，EGFR，MMP-9和HIF1A关键靶蛋白28个。其中Akt1是PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路中重要的下游分子，属丝氨酸/酪氨酸家族成员之一，参与细胞因子激活等重要免疫通路。结核分枝杆菌分泌的致病蛋白Rv1987可诱导的M2型巨噬细胞中PI3K/Akt1/mTOR信号通路被激活，这种极化的巨噬细胞杀菌能力显著降低，导致细菌在巨噬细胞中的存活增加［22］，体内不断增殖的分枝杆菌产生的毒性代谢物，加重患者的中毒症状［23］。PI3K/Akt1通路的激活也会使HIF-1活性降低，影响机体氧化应激和能量代谢途径，促进疲劳乏力的产生，可能是结核病患者乏力产生的部分原因［24］。为了进一步选取抗痨颗粒方中芝麻素（与重要分子靶标Akt1结合分值最高，也是抗痨颗粒方中君药矮地茶的主要活性成分［6］）进行细胞实验，结果表明，与前面的文献研究结论一致［22］，芝麻素通过抑制Akt1的磷酸化实现对分枝杆菌的控制。这些暗示了芝麻素单体是抗痨颗粒方中的重要活性成分，Akt1是抗结核病的重要靶点之一。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β构成的异源二聚体，被证明对干扰素（IFN）-γ介导的结核分枝杆菌感染的控制至关重要［25］。山柰酚通过损害HIF-1通路相关的MAPK依赖性磷酸化，减少其核积累来抑制HIF-1的活性，从而达到增强结核治疗的作用［26-28］。分枝杆菌感染引起的ROS和早期分泌蛋白可诱导EGFR的表达，EGFR介导下游靶标MAPK和PI3K/Akt的调控，促进NF-κB转录合成黏液蛋白MUC5AC［29］，刺激呼吸道产生咳嗽咳痰的反应［30］。推测抗痨颗粒方可能是通过β-谷甾醇和山柰酚等关键成分抑制EGFR的转录［25，31］，从而达到祛痰止咳的功效。结核病感染激活自身免疫系统，诱导MMP-9和其他靶蛋白共同趋化和活化巨噬细胞以抵抗结核分枝杆菌感染。SRC能显著降低THP-1巨噬细胞中H37Rv，促进结核分枝杆菌多耐药和泛耐药菌株的存活［15］。这也表明抗痨颗粒通过多靶点的协同“杀菌”，祛痰止咳和改善机体免疫等综合治疗的疗效，侧面反应出抗痨颗粒治疗结核病分子机制的复杂性。抗痨颗粒方通过β-谷甾醇、芝麻素和山柰酚等重要活性成分，作用于Akt1，SRC，EGFR，MMP-9和HIF1A等关键蛋白靶点，调节PI3K/Akt1/mTOR，HIF-1等信号通路，参与调控结核分枝杆菌氧化代谢、核酸转录和结核分枝杆菌通路等生物学途径，抑制结核分枝杆菌的胞内复制、增强宿主免疫能力等从而达到“杀虫”“补虚”的功效。为进一步实验验证中药治疗结核病的分子机制研究提供理论基础和新的思路，也为结核病的精准治疗研究提供线索。本课题也存在一定的局限性：本研究并未用抗痨颗粒本方验证，即使芝麻素是抗痨颗粒方中最重要的生物活性成分，仍不能真正代表抗痨颗粒本方。需要进一步的实验研究来深入探索抗痨颗粒在体内外治疗结核病的分子机制。