枳壳，六大陈药之一，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium及其栽培变种的干燥未成熟果实［1］。据报道，枳壳有调节胃肠、利胆排石和降血脂等药理作用，临床多用于肠胃功能性疾病［2-3］。枳壳的主要化学成分包括挥发油、黄酮类、香豆素类、生物碱和少量的微量元素［4-6］。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）以柚皮苷和新橙皮苷的含量作为枳壳的质量控制指标［1］。柠檬烯是枳壳挥发油的主要成分，早期被认为是枳壳燥性的主要来源，而郑莹等［3］发现该成分也是枳壳促胃肠动力作用的药效成分之一。同时，挥发油［3］、多甲氧基黄酮［5］和黄酮类［6］被认为是枳壳促胃肠动力作用的活性物质。许姗姗等［7］在文献分析基础上，预测橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林等可作为枳壳的质量标志物。本课题组前期研究表明芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等既是枳壳理气的质量标志物，也是枳壳燥性的质量标志物，提示枳壳理气功效可能是多成分的整体作用结果，且其功效的强弱可能还跟这些化合物的含量及配比有关［5，8-9］。因此，有必要重新梳理与枳壳功效相关的质量控制指标，以提升其质量标准。现有枳壳质量控制的研究手段较为单一［10-14］，很难全面评价其质量。近年来，指纹图谱定性结合多指标定量的分析方法为中药质量评价提供了有益探索［15-18］，为中药质量快速准确的评价提供了良好途径。因此，为了辨别不同产地、不同基原的枳壳药材是否存在差异，发掘更多的枳壳质量评价指标，以便更全面地评价其质量，本实验拟对不同产地、不同基原枳壳进行系统研究，建立基于同一色谱条件的质量标志物指纹图谱和多指标成分含量测定方法，从定性和定量2个方面进行有效评价，以期为枳壳的整体质量评价提供借鉴。1 材料1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AE240型1/10万电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），BT25S型1/1万电子天平（德国赛多利斯公司），PS-80A型超声波清洗机（东莞市洁康超声波设备有限公司）。对照品新北美圣草苷（批号DST-190710-095），伞形花内酯（批号DST-170526-066），芸香柚皮苷（批号DST-180325-098），柚皮苷（批号DST-180601-099），橙皮苷（批号DST-180619-038），新橙皮苷（批号DST-170714-039），水合橙皮内酯（批号DST-190408-147），橙皮内酯（批号DST-190408-146），川陈皮素（批号DST-170607-037），橘皮素（批号DST-170712-004），橙皮油素（批号DST-190607-098）购自成都德思特生物科技有限公司，纯度均≥98%，马尔敏［实验室自制［9］，经高效液相色谱法（HPLC）检测，纯度98%］，水为娃哈哈纯净水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。枳壳药材采自江西、湖南、四川、浙江、重庆等地，经江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室杨武亮教授鉴定为芸香科植物酸橙C. aurantium的栽培变种的干燥未成熟果实，具体信息见表1。所有药材进行润湿、切片、烘干（60 ℃）和粉碎处理。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.T001表126批枳壳药材的产地信息Table 1Origin information of 26 batches of Aurantii Fructus编号产地采集时间基原植物编号产地采集时间基原植物S1江西樟树2018-07香橙S14湖南沅江2018-07香橙S2江西新干2018-07柚子橙S15湖南怀化2018-07香橙S3江西樟树2018-07柚子橙S16湖南沅江2018-08柚子橙S4江西新干2018-07柚子橙S17四川安岳2018-08香橙S5江西樟树2018-07臭橙S18四川眉山2018-08臭橙S6江西新干2018-07臭橙S19四川宜宾2018-08香橙S7江西宜春2018-07香橙S20四川眉山2018-08臭橙S8江西宜春2018-07臭橙S21重庆綦江2018-07臭橙S9江西宜春2018-11臭橙S22重庆綦江2018-07香橙S10湖南沅江2018-07臭橙S23重庆江津2018-07柚子橙S11湖南沅江2018-07臭橙S24浙江金华2018-07臭橙S12湖南沅江2008-07臭橙S25浙江金华2018-07臭橙S13湖南汉寿2008-07臭橙S26浙江金华2018-07香橙2 方法与结果2.1　溶液的制备2.1.1　混合对照品溶液分别称取各对照品适量，精密称定，分别置于量瓶中配制成母液；分别精密吸取上述各母液适量，配制成新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素、橙皮油素的质量浓度分别为24.2，6.12，18.6，688.8，43.2，560，28.8，13.6，41.6，21.1，8.80，22.4 mg·L-1的混合对照品溶液，摇匀，备用。2.1.2　供试品溶液称取枳壳样品粉末（过三号筛，下同）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，静置1 h，超声处理30 min（功率480 W，频率40 kHz），4 000 r·min-1离心5 min（离心半径9.5 cm），取上清液；药渣重复提取1次，合并上清液，加甲醇定容至50 mL量瓶中，摇匀，临用前过0.22 μm微孔滤膜，即得。2.2　色谱条件COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相选择乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0~4 min，19%A；4~5 min，19%~21%A；5~18 min，21%A；18~19 min，21%~28%A；19~27 min，28%A；27~28 min，28%~40%A；28~36 min，40%A；36~37 min，40%~50%A；37~42 min，50%~60%A；42~46 min，60%~95%A；46~55 min，95%~100%A），进样量设定10 μL，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，检测波长320 nm。2.3　HPLC指纹图谱的建立2.3.1　精密度试验取样品S1适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，以6号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均3.0%，表明仪器精密度良好。2.3.2　重复性试验取样品S1适量，平行6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定，以6号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均3.0%，表明该方法重复性良好。2.3.3　稳定性试验取样品S1适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h按2.2项下色谱条件测定，以6号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.3.4　相似度评价取26批不同产地的枳壳样品适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件测定，得HPLC色谱图，选择S1~S3，S10~S12，S17~S19和S24~S26这12批枳壳药材的HPLC色谱图，将其数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），设定S1为参照色谱图，选取时间窗宽度0.2 min，通过平均数法生成指纹图谱，运用多点校正方法对色谱峰进行匹配，计算相似度。结果12批样品与其对照图谱的相似度均≥0.85，见表2，共标记了20个共有峰，见图1。基于前期研究情况［5，19-20］，归属了14个共有峰，分别为3号峰（新北美圣草苷），4号峰（伞形花内酯），5号峰（芸香柚皮苷），6号峰（柚皮苷），7号峰（橙皮苷），9号峰（新橙皮苷），10号峰（水合橙皮内酯），11号峰（枸橘苷），12号峰（马尔敏），14号峰（橙皮内酯），16号峰（川陈皮素），18号峰（3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮），19号峰（橘皮素）和20号峰（橙皮油素）。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.T002表212批不同产地枳壳的相似度评价Table 2Similarity evaluation of 12 batches of Aurantii Fructus from different production areas样品S1S2S3S10S11S12S17S18S19S24S25S26对照指纹图谱S11.0000.9820.9830.9430.9750.9830.9870.9830.9790.9840.9650.9510.994S20.9821.0000.9760.9000.9770.9680.9920.9680.9420.9530.9730.9730.987S30.9830.9761.0000.9140.9930.9890.9790.9830.9470.9590.9860.9620.993S100.9430.9000.9141.0000.8910.9430.9140.9450.9510.9750.8730.8500.935S110.9750.9770.9930.8911.0000.9880.9770.9850.9300.9380.9950.9720.990S120.9830.9680.9890.9430.9881.0000.9760.9960.9560.9650.9770.9550.993S170.9870.9920.9790.9140.9770.9761.0000.9740.9480.9600.9720.9780.992S180.9830.9680.9830.9450.9850.9960.9741.0000.9550.9630.9770.9500.992S190.9790.9420.9470.9510.9300.9560.9480.9551.0000.9840.9070.8820.961S240.9840.9530.9590.9750.9380.9650.9600.9630.9841.0000.9200.9000.972S250.9650.9730.9860.8730.9950.9770.9720.9770.9070.9201.0000.9800.984S260.9510.9730.9620.8500.9720.9550.9780.9500.8820.9000.9801.0000.971对照指纹图谱0.9940.9870.9930.9350.9900.9930.9920.9920.9610.9720.9840.9711.00010.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F001图112批枳壳的HPLC指纹谱（A）与对照指纹谱（B）Fig. 1HPLC fingerprint （A） and reference fingerprint （B） of 12 batches of Aurantii FructusR.对照指纹图谱2.4　基于化学计量学的枳壳质量分析2.4.1　聚类分析（CA）［4，14，16］将26批枳壳样品的20个共有峰的峰面积导入SPSS 21.0，采用组间连接系统聚类法，测量区间为平方欧氏距离，见图2。结果发现当平方欧氏距离为25时，26批样品可大致聚为两类，其中产自江西的9批样品（S1~S9）聚为一大类，其余17批枳壳药材（S10~S26）聚为一大类。在产自江西的这一大类中，基原植物为香橙的S1和S7聚为一类，基原植物为柚子橙的S2~S4聚为一类，基原植物为臭橙的S5，S6，S8和S9聚为一类。在另外的一大类中，产自湖南的枳壳（S10~S16）聚为一类，其中的基原植物为臭橙的S10~S13聚为一小类，基原植物为香橙的S14和S15聚为一小类，基原植物为柚子橙的S16单独聚为一小类。产自四川和重庆的S17~S23聚为一类，其中基原植物为香橙的S17，S19和S22聚为一小类，基原植物为臭橙的S18，S20和S21聚为一小类，基原植物为柚子橙的S23单独聚为一小类。产自浙江的基原植物为臭橙的S24和S25聚为一小类，基原植物为香橙的S26单独成一小类。说明不同产地的枳壳之间存在一定差异；相同产地、不同基原植物的枳壳之间也存在差异。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F002图226批枳壳的CAFig. 2CA of 26 batches of Aurantii Fructus2.4.2　主成分分析（PCA）［4，9，15］将26批枳壳样品中20个共有峰的峰面积导入SIMCA 14.1进行PCA处理，结果前4个主成分的累计贡献率83.6%，说明所提取的4个主成分能代表枳壳指纹图谱中20个共有峰信息，从而反映枳壳药材质量情况，见图3。结果发现PCA结果与CA结果基本一致，进一步验证了前4个主成分可以代表这26批枳壳药材的整体质量情况，且表明不同产地枳壳间存在差异，相同产地、不同基原的枳壳之间也存在差异。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F003图326批枳壳样品的PCA得分Fig. 3PCA score of 26 batches of Aurantii Fructus2.4.3　正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）处理为进一步寻找不同产地枳壳间产生差异的标志物，对26批枳壳样品进行OPLS-DA处理。将共有峰峰面积导入SIMCA 14.1，获得相应OPLS-DA模型，见图4。结果与CA，PCA基本一致，进一步验证了分析结果的可靠性。变量重要性投影（VIP）值是筛选差异性化合物的重要指标，VIP值越高，对组间差异的影响越大。以VIP值1为阈值，筛选出了7个成分，见图5，按VIP值大小排序依次为9号峰（新橙皮苷）6号峰（柚皮苷）10号峰（水合橙皮内酯）19号峰（橘皮素）16号峰（川陈皮素）5号峰（芸香柚皮苷）7号峰（橙皮苷），提示这7个共有峰是引起不同产地枳壳之间差异的主要变量。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F004图426批枳壳样品的OPLS-DA得分矩阵Fig. 4OPLS-DA score matrix of 26 batches of Aurantii Fructus10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F005图5枳壳样品中各成分的VIP值Fig. 5VIP values of components in Aurantii Fructus samples2.5　多指标成分的含量测定［5］2.5.1　色谱条件同2.2项。2.5.2　专属性考察精密吸取2.1项下混合对照品溶液及供试品溶液适量，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图，见图6。结果发现各化合物均能达到良好的分离，分离度均1.5。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F006图6枳壳样品的HPLCFig. 6HPLC chromatograms of Aurantii FructusA.混合对照品；B.供试品；3.新北美圣草苷；4.伞形花内酯；5.芸香柚皮苷；6.柚皮苷；7.橙皮苷；9.新橙皮苷；10.水合橙皮内酯；12.马尔敏；14.橙皮内酯；16.川陈皮素；19.橘皮素；20.橙皮油素（图7同）2.5.3　线性关系考察精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，依次加甲醇稀释，得6个水平的系列混合对照品溶液，按2.2项下条件测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，得回归方程、相关系数及线性范围，见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.T003表3枳壳中12个指标成分含量测定的线性参数Table 3Linear parameters of 12 components in Aurantii Fructus化合物回归方程R2线性范围/mg·L-1新北美圣草苷Y=2.357 3X+8.671 40.999 50.756~24.2伞形花内酯Y=64.874 1X+1.792 20.999 40.191~6.12芸香柚皮苷Y=6.950 6X+2.659 60.999 10.581~18.6柚皮苷Y=2.938 7X+15.245 60.999 621.5~688.8橙皮苷Y=3.041 6X+1.667 00.999 61.35~43.2新橙皮苷Y=3.442 6X+10.242 40.999 717.5~560水合橙皮内酯Y=34.386 6X-1.343 70.999 80.900~28.8马尔敏Y=43.560 5X-1.484 90.999 90.425~13.6橙皮内酯Y=14.402 6X-1.837 40.999 91.30~41.6川陈皮素Y=22.640 4X-1.199 50.999 90.659~21.1橘皮素Y=49.837 8X+6.656 70.999 40.275~8.80橙皮油素Y=14.441 2X-8.402 60.999 90.700~22.42.5.4　精密度试验取2.1.1项下混合对照品溶液，按2.2项下条件连续进样6次，计算新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素和橙皮油素峰面积的RSD分别为2.9%，2.5%，2.1%，1.4%，1.3%，1.0%，0.7%，0.7%，0.7%，0.6%，0.6%，2.2%，表明仪器精密度良好。2.5.5　重复性试验取样品S1适量，平行6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件测定，计算新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素和橙皮油素平均质量分数分别为8.453，0.412，1.335，57.01，3.389，51.03，2.806，0.388，1.297，2.425，0.753，0.247 mg·g-1，RSD分别2.5%，1.3%，2.2%，0.6%，0.8%，0.2%，0.3%，0.4%，0.4%，0.6%，1.0%，2.2%，表明该方法重复性良好。2.5.6　稳定性试验称取样品S1适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h按2.2项下条件测定，计算新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素和橙皮油素峰面积的RSD分别2.4%，0.8%，1.1%，0.5%，1.8%，0.8%，0.7%，0.8%，0.6%，0.5%，0.5%，1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.5.7　加样回收试验称取样品S1共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别按已知指标成分含量的100%加入新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素、橙皮油素混合对照品溶液，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件测定，计算上述各成分的平均加样回收率分别为101.00%，100.79%，99.53%，99.99%，100.21%，100.77%，99.96%，100.04%，100.15%，100.91%，99.21%，100.16%，RSD分别为1.6%，1.7%，1.9%，0.9%，1.4%，1.3%，1.5%，1.6%，1.6%，2.0%，1.5%，1.8%。2.5.8　检测限及定量限精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液适量，逐级稀释，按2.2项下色谱条件测定，以信噪比（S/N）=3作为检测限，S/N=10作为定量限，得新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素和橙皮油素的检测限分别为0.101，0.010 5，0.049 2，0.089 7，0.094 8，0.097 2，0.015 2，0.012 4，0.063 6，0.021 7，0.013 2，0.058 8 mg·L-1；定量限分别为0.336，0.034 9，0.164，0.299，0.316，0.324，0.050 8，0.041 2，0.212，0.072 3，0.044 1，0.196 mg·L-1。2.5.9　样品测定取26批枳壳样品粉末，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件测定，计算12个成分的含量，见增强出版附加材料；同时，以各成分含量生成聚类热图，见图7。结果发现26批样品中新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素的含量差异较大，这与OPLS-DA筛选出的7个差异性成分基本一致。相同产地、相同基原、不同采收时间的样品S11和S12，新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量差异较大，且S12均较S11高，这种差异可能与药材的储藏时间有关。10.13422/j.cnki.syfjx.20211946.F007图726批枳壳12个成分含量的聚类热分析Fig. 7Cluster thermal analysis of 12 components of 26 batches of Aurantii Fructus3 讨论枳壳是一种多基原、多产地的中药，不同基原与产地的枳壳存在化学成分差异，进而药效作用可能也有所区别。枳壳药材在市场的流通甚广，主要来源四大产地，江西的江枳壳作为道地药材、四川和重庆的川枳壳作为主流品种、湖南的湘枳壳作为大宗药材、浙江和江苏的浙产枳壳在市场上也较为常见。此外，枳壳药材质量与地理环境、采收时间和栽培品种等因素密切相关。因此，有效区分枳壳的基原、产地及活性成分差异是枳壳质量评价的关键环节。对于多基原的中药材，有必要应用新技术结合传统鉴别方法，因为只有建立全面、可行的质量标准，明确不同产地、不同基原药材之间的差异，才能更好地发挥药材的药效价值。本课题组多年来收集了不同基原、产区、采收期的枳壳样品220多个，经系统分析，发现表1的26批样品能较好地代表所收集的所有样品。为简化分析结果及相关表述，本文仅提供了上述26个样品的分析结果。本课题组前期优选出了枳壳的12个有效成分，并进行了PCA与判别分析，以探讨其道地性成因［9］，后续实验发现新北美圣草苷、枸橘苷和伞形花内酯系其重要的理气质量标志物（Q-marker）［5］，因此，对含量测定指标性成分做了进一步调整。在含量测定实验中选择了枳壳的12个理气Q-marker（新北美圣草苷、伞形花内酯、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素和橙皮油素）为评价指标。为实现良好的色谱分离，笔者系统优化了分析流程与影响因素，包括样品制备、流动相组成、洗脱梯度及检测条件等。结果显示，以甲醇为提取溶剂，浸泡1 h，超声提取2次，每次30 min时，各个化合物均有较好的提取效率。本研究对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.2%磷酸水溶液等流动相体系进行考察，结果以乙腈-0.2%磷酸水溶液体系得到的色谱峰峰形及分离度较好。根据全波长（190~400 nm）扫描结果，发现320 nm波长下的色谱峰信息较多，分离情况良好。考察了不同柱温、不同流速等条件对色谱分离的影响，结果表明柱温30 ℃，流速设定1 mL·min-1时，色谱分离结果较优。基于优化的色谱条件，筛选了12批枳壳药材建立了特征HPLC指纹图谱。指纹图谱相似度评价结果显示，各产地枳壳药材相似度较高，不足以辨别各个产地的枳壳药材是否存在差异。继而采用CA，PCA和OPLS-DA等化学计量学方法充分挖掘枳壳药材的化学成分、产地与品种等信息，结果表明相同产地的枳壳自动聚为一类，同时筛选得到7个差异性成分；这3种化学计量学分析得到的结果互为补充、互为验证。含量测定结果表明，26批药材均符合2020年版《中国药典》枳壳含量测定项下的要求，均为合格药材。另一方面，部分样品间的含测结果差异较大，以柚皮苷和新橙皮苷质量分数为例，二者最低值分别为44.92，32.24 mg·g-1，最高值则依次为74.83，61.64 mg·g-1，含量差异接近两倍。因此，对中药而言，仅以1~2个化学成分指标去评价药材的质量属性是不够的，建立更加科学和完善的中药质量评价体系至关重要。本文研究结果还提示，单纯的指纹图谱相似度评价很难适应多基原、多产地药材的评价，需进一步的统计分析以获取更丰富的药材信息，进而对其作出更全面的质量评价。本文研究结果表明，枳壳作为栽培的大宗药材，其基原容易确定，同一产区各基原枳壳的质量差异不大；产地、气候等因素对药材质量的影响更大，如湘枳壳、川枳壳多是从江西引种，但二者与江枳壳的差异已比较明显。在操作模式上，本文采用了统一的色谱条件，实现了指纹图谱定性与多指标定量的同时分析，简单可行。在研究思路上，本文借鉴了中药质量标志物的研究成果［21-24］，在指纹图谱研究基础上，纳入了更多能反映中药整体质量属性的指标，再结合化学计量学方法充分挖掘药材质量信息，可以更全面地评价药材质量。