近年来，肿瘤的发病率和死亡人数呈逐年上升的趋势。研究表明，2020年中国新发癌症患病人数约457万例，死亡人数约300万，新发癌症人数和死亡人数位居全球第一。肿瘤恶病质是肿瘤疾病中复杂的一种代谢紊乱综合征，其发病机制尚未完全阐明，一般是由厌食导致的骨骼肌代谢、脂肪代谢、肌肉代谢、线粒体能量代谢紊乱造成的［1-2］，肌肉萎缩是临床最常见的症状，目前尚缺乏有效的治疗药物及手段，多以手术、放化疗、食欲刺激药为主［3］。信号传导及转录激活因子3（STAT3）是一种信号传导与转录激活因子，研究表明STAT3的异常活化可激活泛素蛋白酶体途径（UPS），该途径是骨骼肌蛋白质异常分解代谢的主要方式之一，也是导致肿瘤恶病质肌肉萎缩的关键因素［4］。中医药在治疗肿瘤恶病质方面凸显出越来越重要的地位，具有较小的不良反应、减轻患者的身心负担、提高患者的免疫力及耐受度、延长患者生存期等优势［5］。肿瘤恶病质属于中医学“虚劳”范畴，中医学认为五脏六腑、阴阳气血、形体肌肉的亏损都可称之为虚劳。《黄帝内经·素问·玉机真脏论》中“大骨枯槁，大肉陷下，胸中气满，喘息不便，其气动形。”的描述，符合临床肿瘤晚期恶病质患者形体消瘦、肌肉萎缩的症状［6］。六君子汤出自《医学正传》，由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏组成，具有益气健脾，燥湿化痰的功效。本课题组前期相关的体外实验研究发现，六君子汤可以通过干预白细胞介素-6（IL-6）/STAT3信号通路，改善食管癌细胞的微环境，激活免疫机制，抑制人食管癌细胞（EC9706细胞）的增殖［7-8］；六君子汤能够抑制肺癌Lewis细胞（LLC）与小鼠成肌细胞（C2C12细胞）共培养条件下IL-6的分泌，抑制肿瘤细胞STAT3的激活和表达，改善肿瘤恶病质肌肉萎缩［9-10］。因此本实验在体内从STAT3信号通路介导的UPS角度探讨六君子汤防治肺癌恶病质小鼠肌肉萎缩的作用机制，为肿瘤恶病质的中医药防治研究提供思路。1 材料1.1　细胞LLC细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库，37 ℃，5%CO2培养箱中常规培养。1.2　动物SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6周龄，购于河南华兴实验动物养殖场，合格证号SCXK（豫）2019-0002，动物实验已通过河南中医药大学实验动物伦理委员会批准，编号DWLL202003220。1.3　试剂抑制剂stattic（北京百奥莱博科技有限公司，批号M00248）；高效组织细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，ECL超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为R0010，P0100，PE0010-A）；预染蛋白分子量标准（美国CST公司，批号12949）；BCA蛋白浓度测定试剂盒，兔抗人磷酸化信号传导及转录激活因子-3（p-STAT3）抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为AR0146，BA1709）；兔抗人STAT3，兔抗人肌肉特异性环指蛋白1（MuRF1），兔抗人肌肉萎缩盒F基因（MAFbx）（英国Abcam公司，批号分别为ab76315，ab172479，ab168372）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Proteintech公司，批号60004-1-Ig）；2×Universal SYBR Green Fast实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR） Mix（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号RK21203）；TRIzol，逆转录试剂盒（美国赛默飞公司，批号分别为15596026，K1622），二抗山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G辣根过氧化物酶（HRP）标记（美国CST公司，批号7074S）；苏木素-伊红（HE）染色液（珠海贝索生物技术有限公司，批号BA-4041，BA-4024）。1.4　仪器SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Primovert型倒置显微镜（德国Zeiss公司）；CHEMIDOCXRS+型高灵敏度化学发光成像系统，PowerPac1000型电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司）；371型CO2培养箱，Multifuge X1R型低温离心机，QuantStudio 6 Flex型实时荧光定量PCR仪（美国Thermo-Fisher Scientific公司）。1.5　六君子汤溶液的制备参照《医学正传》组方，药物剂量比例为人参-白术-茯苓-甘草-陈皮-半夏 2∶3∶2∶2∶2∶3。六君子汤由人参9 g，白术13.5 g，茯苓9 g，甘草9 g，陈皮9 g，半夏13.5 g组成，中药材由河南中医药第一附属医院中药房提供，由河南中医药大学中药分析学科冯素香教授鉴定均为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》。所有药材纯水浸泡2 h，煎煮40 min后过滤药液保存，滤渣再次加纯水煎煮30 min后，过滤药液，与第1次混合，2次煎煮滤液合并后，文火浓缩至生药含量为2 g·mL-1，4 ℃保存冷藏备用。根据《中药药理研究方法学》，按照动物体表面积比率换算等效剂量法计算小鼠给药量，小鼠用药剂量（g·kg-1）＝人原生药用量（g）/（60 kg）×9.1，故六君子汤组小鼠每日灌胃剂量为9.56 g·kg-1。2 方法2.1　模型制备与评价标准取对数生长期的LLC细胞，调整细胞密度为1×107个/mL。实验分为空白组、模型组、六君子汤组、抑制剂组、联合用药组（六君子汤+stattic），每组8只。空白组每只小鼠右前腋下注射生理盐水0.2 mL，其余各组每只小鼠右前腋下注射LLC细胞悬液0.2 mL，复制肿瘤恶病质动物模型［11］。观察小鼠状态，每周记录小鼠的瘤体体积和体质量变化。注射第8天，测量肿瘤长径（a），短径（b），计算瘤体体积（V=a×b2/2）。LLC细胞接种第8天，除空白组外，模型组小鼠右前腋下可触及圆形或扁圆形肿块，瘤体0.5 mm3，且模型组较空白组小鼠腓肠肌质量减轻，肌纤维横截面面积变小，视为造模成功。2.2　分组与给药分为空白组（灌胃超纯水、腹腔注射等体积生理盐水），模型组（灌胃超纯水、腹腔注射等体积生理盐水），六君子汤组［灌胃六君子汤剂量9.56 g·kg-1·d-1，腹腔注射等体积生理盐水）、抑制剂组（腹腔注射stattic剂量25 mg·kg-1·（2 d）-1，灌胃等体积生理盐水］［12］、联合用药组［腹腔注射stattic剂量25 mg·kg-1·（2 d）-1灌胃六君子汤］，灌胃每天1次，腹腔注射2 d/次，3周后，采用10%水合氯醛对小鼠按体质量（3 mL·kg-1）进行麻醉，眼球取血，并取双后肢腓肠肌称重，部分腓肠肌固定保存进行HE染色，剩余组织-80 ℃冷冻保存用于相关蛋白和基因的检测。2.3　指标检测2.3.1　HE染色观察腓肠肌肌纤维病理变化将固定（4%多聚甲醛）的腓肠肌肌肉组织用梯度乙醇及二甲苯脱水，石蜡包埋后切5 μm薄片后进行HE染色，中性树胶封片，镜下观察。使用Image pro plus6.0图像采集系统分析，计算出肌纤维横截面的平均值和标准差。2.3.2　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测腓肠肌p-STAT3，STAT3，MAFbx，MuRF1蛋白表达取小鼠腓肠肌组织匀浆，4 ℃，14 000 r·min-1离心15 min（离心半径12 cm），取上清用BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样品50 μg与上样缓冲液按比例混匀，100 ℃加热变性8 min。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，5%的封闭缓冲液封闭后加一抗（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，用ECL化学发光法显色，收集图像，使用Image Lab软件进行数据整理。2.3.3　Real-time PCR检测腓肠肌p-STAT3，STAT3，MAFbx，MuRF1 mRNA表达取腓肠肌组织称重，研磨，裂解后应用TRIzol法提取组织RNA，测量RNA浓度和纯度，逆转录反应条件为37 ℃，30 min，75 ℃，5 min，RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。反应体系为10 μL，扩增条件：95 ℃预变性3 min，共1个循环；95 ℃循环反应5 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，目的基因的相对表达倍数改变采用2-ΔΔCt计算。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列长度/bpMuRF1上游5΄-TGCCTACTTGCTCCTTGTGC-3΄101下游5΄-CACCAGCATGGAGATGCAGT-3΄MAFbx上游5΄-ACGTCGCAGCCAAGAAGAG-3΄104下游5΄-ATGGCGCTCCTTCGTACTTC-3΄STAT3上游5΄-TGGCACCTTGGATTGAGAGT-3΄109下游5΄-TGCTGATAGAGGACATTGGACT-3΄GAPDH上游5΄-TGGTCGTATTGGGCGCCTGGT-3΄150下游5΄-TCGCTCCTGGAAGAGGTGA-3΄2.4　统计分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析，数据结果用x¯±s表示，采用One-Way ANOVA进行组间数据比较，两组间比较采用最小显著性差异法LSD检验，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　对肺癌恶病质小鼠的瘤体生长和一般情况的影响与空白组比较，模型组小鼠皮下注射LLC细胞8 d时可在右前腋下触及到明显的肿块，形状多为圆形或扁圆形，且模型组小鼠明显表现出毛发光泽暗淡，活动减少，四肢无力，形体消瘦，体质量降低，饮食量减少等症状，随后肿瘤体积迅速增长，具备明显的恶病质症状；与模型组比较，六君子汤组、抑制剂组及联合用药组肿瘤体积明显减小，但差异无统计学意义。各用药组之间小鼠瘤体比较差异无统计学意义。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.T002表2六君子汤对肺癌恶病质小鼠瘤体的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of Liu Junzitang on tumor volume of lung cancer cachexia mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1肿瘤长径/cm肿瘤短径/cm肿瘤体积/cm3模型2.37±1.211.97±0.766.07±5.16六君子汤9.561.73±0.711.58±0.662.94±3.23抑制剂25×10-31.80±0.691.43±0.642.46±1.91联合用药9.56+25×10-31.30±0.171.17±0.110.91±0.31注：空白组肿瘤长径、肿瘤短径、肿瘤体积均为0。3.2　对肺癌恶病质小鼠体质量、腓肠肌质量及横截面积的影响与空白组比较，模型组小鼠体质量及腓肠肌质量明显减轻，腓肠肌肌纤维横截面积明显减小（P0.05）；与模型组比较，六君子汤组小鼠体质量、腓肠肌质量、肌纤维横截面积明显增加（P0.05），抑制剂组小鼠体质量及腓肠肌肌纤维横截面积增加（P0.05），联合用药组小鼠体质量及腓肠肌质量增加（P0.05）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.T003表3六君子汤对肺癌恶病质小鼠体质量、腓肠肌质量及横截面积的影响 （x¯±s，n=6）Table 3Effect of Liu Junzitang on body weight，gastrocnemius muscle weight and cross-sectional area of lung cancer cachexia mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1体质量/g腓肠肌质量/mg肌纤维横截面积/μｍ2空白33.70±2.480.13±0.01228 697.31±41 444.54模型19.90±4.471）0.08±0.021）88 628.14±13 446.551）六君子汤9.5629.40±4.772）0.13±0.032）207 436.27±17 253.872）抑制剂25×10-333.10±2.192）0.11±0.01205 169.00±14 790.752）联合用药9.56+25×10-328.70±2.192）0.13±0.022）126 509.42±27 047.06注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05（表5同）。3.3　对肺癌恶病质小鼠腓肠肌病理形态的影响与空白组比较，模型组腓肠肌肌纤维横截面面积变小，细胞萎缩，包浆颜色深染，细胞核减少，相邻细胞间隙增宽；与模型组比较，各用药组腓肠肌肌纤维病理状态均有所改善，可见肌肉纤维横截面积增加，细胞核增多，细胞间隙变窄等。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.F001图1六君子汤对腓肠肌肌纤维横截面积的影响（HE，×400）Fig.1Effect of Liu Junzitang on cross-sectional area of gastrocnemius muscle fiber （HE，×400）A.空白组；B.模型组；C.六君子汤组；D.抑制剂组；E.联合用药组（图2同）3.4　对肺癌恶病质小鼠腓肠肌STAT3和UPS途径关键蛋白表达的影响与空白组比较，模型组小鼠腓肠肌中p-STAT3，STAT3，MAFbx，MuRF1蛋白表达明显增加（P0.05）；与模型组比较，六君子汤组、抑制剂组小鼠腓肠肌p-STAT3，STAT3，MuRF1，MAFbx蛋白表达降低（P0.05），联合用药组小鼠腓肠肌p-STAT3，STAT3，MuRF1蛋白表达降低（P0.05）；与六君子汤组比较，抑制剂组、联合用药组腓肠肌中p-STAT3蛋白表达明显下降（P0.05）。见图2，表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.F002图2六君子汤作用后STAT3和UPS途径关键蛋白表达的电泳Fig.2Electrophoresis of Liu Junzitang on expression of key proteins in STAT3 and UPS pathway10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.T004表4六君子汤对肺癌恶病质小鼠腓肠肌STAT3和UPS途径关键蛋白表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of Liu Junzitang on expression of key proteins of STAT3 and UPS pathway in gastrocnemius muscle of mice with lung cancer cachexia （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1p-STAT3/GAPDHSTAT3/GAPDHMAFbx/GAPDHMuRF1/GAPDH空白0.48±0.040.25±0.070.36±0.010.23±0.14模型0.66±0.071）0.50±0.191）0.56±0.031）0.51±0.121）六君子汤9.560.49±0.032）0.23±0.092）0.24±0.012）0.18±0.042）抑制剂25×10-30.20±0.012，3）0.26±0.042）0.19±0.022）0.14±0.042）联合用药9.56+25×10-30.02±0.002，3）0.34±0.142）0.44±0.010.26±0.222）注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05；与六君子汤组比较3）P0.05。3.5　对肺癌恶病质小鼠STAT3和UPS途径关键基因mRNA表达的影响与空白组比较，模型组腓肠肌STAT3，MuRF1，MAFbx mRNA表达明显增加（P0.05）；与模型组比较，六君子汤组、抑制剂组、联合用药组腓肠肌STAT3，MAFbx mRNA表达均明显下降（P0.05）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20220430.T005表5六君子汤对肺癌恶病质小鼠腓肠肌STAT3和UPS途径关键基因表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 5Effect of Liu Junzitang on expression of key genes of STAT3 and UPS pathway in gastrocnemius muscle of mice with lung cancer cachexia （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1STAT3MuRF1MAFbx模型7.15±0.201）1.80±0.261）4.73±0.101）六君子汤9.562.03±0.042）1.76±0.302.79±0.432）抑制剂25×10-31.73±0.072）1.68±0.281.59±0.492）联合用药9.56+25×10-31.58±0.072）1.33±0.152.57±0.082）注：空白组STAT3，MuRF1，MAFbx mRNA相对表达为1。4 讨论中医认为，肿瘤恶病质属于中医学“虚劳”范畴，张锡纯在《医学衷中参西录》中把本病称为“虚劳”“痨瘵”，认为本病的发生与脾胃虚弱有关，其治疗应多从调理脾胃入手［13］，中医药在治疗肿瘤恶病质上具有显著优势，可延长患者生存期、提高患者生活质量、减少靶向药物的胃肠道反应。六君子汤是健脾和胃的代表方剂，具有益气健脾，燥湿化痰之功，在临床上应用广泛［14］。大量的现代研究证实，健脾和胃类方药在本病的临床治疗和实验研究中显示出了较好的疗效，如香砂六君子汤联合甲羟孕酮能有效改善肿瘤患者生存质量，延长患者寿命［15］；四君子汤能改善肿瘤小鼠由恶病质引起的体质量减轻的现象，并提高生存质量［16］；本团队前期的课题研究发现，六君子汤能抑制裸鼠移植瘤的生长［17］，增强顺铂对食管癌EC9706细胞线粒体膜电位的影响，调节线粒体呼吸能力［18］，能改善食管癌小鼠生存质量，保护脏器、减少组织病理损伤［19］。中医认为“脾主肌肉”，脾为“仓禀之官”，脾在体合肉，主四肢，脾胃健运可充养脏腑，气血化生则濡养肌肉，故健脾和胃法治疗肺癌、食管癌等肿瘤恶病质肌肉萎缩的机制研究具有前瞻性的参考价值。骨骼肌的动态平衡主要通过分解代谢和合成代谢实现，当蛋白质降解速度超过蛋白质合成速度时，易发生肌肉萎缩，并可能在多疾病状态下引起肌肉萎缩，包括肿瘤恶病质、厌食症、心力衰竭和衰老，代谢紊乱主要通过UPS途径的激活来促进蛋白质降解导致骨骼肌质量损失［20-21］。研究表明JAK/STAT3信号通路可以激活UPS途径加剧蛋白降解，最终导致骨骼肌萎缩，其中STAT3信号通路和UPS中关键蛋白和基因的高表达是造成肿瘤恶病质肌肉萎缩的重要因素［22］。研究发现，在肿瘤微环境中，受到炎症因子的影响，STAT3被磷酸化成同源或异源二聚体，当STAT3被磷酸化后，E3泛素连接酶（MuRF1，MAFbx）的表达被激活，导致蛋白降解加剧，出现肌肉萎缩，而抑制STAT3的激活可有效减少蛋白降解［23］。有研究表明，STAT3的抑制剂如舒尼替尼，泮托拉唑，C188-9（STAT3的小分子抑制剂），均可以通过抑制STAT3和UPS信号通路的过度激活，有效减缓肿瘤恶病质期间肌肉蛋白质分解代谢进程，增加肿瘤小鼠体质量［24-25］。LLC移植瘤动物常被作为恶病质模型，研究发现，LLC植入小鼠体内2周后，当肿瘤负荷约占体质量6%时，可导致小鼠体质量迅速下降，蛋白质分解速率加快［26］。因此，本研究复制了LLC恶病质小鼠模型，在Lewis细胞株植入C57BL/6J小鼠右腋下皮下第8天时，可在小鼠腋下观察到明显的肿瘤，还表现出皮毛发暗，精神萎靡，活跃度降低，体质量减轻，表面模型小鼠已出现了肿瘤恶病质的症状；肿瘤体积随着时间的延长逐渐变大，模型小鼠体质量进一步下降，腓肠肌质量减少，腓肠肌肌纤维横截面积变小，病理切片分析表明，模型组腓肠肌肌纤维横截面积变小、相邻肌纤维间隙增宽，细胞核减少。以上结果表明本实验成功复制了肺癌恶病质肌肉萎缩模型。此时开始用药，一方面是对肿瘤恶病质小鼠进行治疗，同时也预防其肌肉萎缩的进一步恶化。实验结果显示，六君子汤组、抑制剂组、联合用药组动物体质量较模型组均显著上升，六君子汤组、联合用药组腓肠肌质量明显增加，六君子汤组、抑制剂组小鼠腓肠肌肌纤维横截面积明显增加，相邻肌纤维间隙变窄，提示六君子汤可以增加Lewis肺癌恶病质小鼠的体质量、腓肠肌质量，对维持腓肠肌肌纤维中细胞器的形态均有显著的改善和调节作用。为了进一步研究六君子汤改善肿瘤恶病质模型动物的肌肉萎缩机制，结合通路抑制剂对STAT3信号通路相关分子mRNA和蛋白表达进行了检测。结果显示，与空白组比较，模型组小鼠p-STAT3蛋白，STAT3 mRNA及蛋白表达均增加，提示造模后STAT3信号通路被激活，本实验模型组中STAT3的高表达与相关研究报道的恶病质患者中STAT3异常活化结果一致［27］。使用六君子汤干预后，与模型组比较，六君子汤组、抑制剂组、联合用药组的p-STAT3蛋白，STAT3 mRNA及蛋白表达均下降，表明六君子汤对STAT3信号通路具有抑制作用，可通过下调p-STAT3，STAT3蛋白的表达有效改善肺癌恶病质小鼠肌肉萎缩。这与CHEN等［28］报道的通过抑制STAT3表达进而抑制泛素蛋白酶体途径相关分子表达改善肺癌恶病质肌肉萎缩的结果相一致。本研究还观察了参与泛素化的两种关键的泛素连接酶MAFbx，MuRF1的蛋白及mRNA表达量，发现与空白组比较，模型组小鼠MAFbx，MuRF1蛋白及mRNA表达均增加，而STAT3抑制剂组以上两分子蛋白及mRNA表达均降低，提示造模后UPS途径被激活，其介导的蛋白水解异常增加可能是诱发肌肉萎缩的关键因素，并与STAT3被激活有关，这与GUO等［25］的研究结果相一致。六君子汤干预后，与模型组比较，MAFbx蛋白及mRNA，MuRF1蛋白表达均下降，表明六君子汤对于UPS途径具有抑制作用，而联合抑制剂组与六君子汤组之间MAFbx蛋白及mRNA，MuRF1蛋白表达没有差异，说明六君子汤是通过抑制STAT3相关通路，从而介导降低UPS途径改善肺癌恶病质肌肉萎缩。综上，六君子汤可以改善肺癌恶病质小鼠体质量减轻，缓解肺癌恶病质小鼠腓肠肌质量丢失，增加肺癌恶病质小鼠腓肠肌中肌纤维的横截面积，减缓恶病质小鼠的肌肉萎缩进程，其机制可能是通过抑制STAT3/泛素蛋白酶体途径相关蛋白和基因的表达，可为临床中医药治疗肿瘤恶病质肌肉萎缩提供借鉴意义。