高卢蜜环菌（Armillaria gallica）属伞菌目泡头菌科，在世界各地区分布广泛，是为数不多的由营养菌丝聚集形成菌索的几个菌物属之一。高卢蜜环菌的菌索顶端具有较强的分生能力，可使细胞保持不断的分裂，能在活树、朽木上浸染和吸收营养，并能分化出侧枝，以形成完整的菌索［1］。近年来，高卢蜜环菌的药用价值受到了广泛关注，被认为具有利肺、清目、镇静、抗惊厥、益肠胃、扩张血管、降血压等功效［2-3］。高卢蜜环菌含有多种化合物，如倍半萜类化合物具有抗抑郁、抗肿瘤、抗菌消炎及抗病毒的功效；多糖类化合物可以抗衰老、提高机体免疫力；腺苷类化合物在镇静、抗凝血、改善心脑血液循环、抗心律失常等方面发挥了较强的作用［4-7］。利用生物工程创制高卢蜜环菌新资源是提高蜜环菌产量、增强蜜环菌药效的有效途径之一，而高效遗传转化体系是开展蜜环菌生物育种的前提。关于真菌的遗传转化研究首次报道于1973年，随后该技术迅速引起了菌类科学界的重视［8］。直到2015年，FORD等［9］利用农杆菌介导法，建立了以蜜环菌孢子为实验材料的遗传转化体系，成功地在体外稳定地产生蜜环菌子实体和有活力的担孢子。2017年，本实验室以高卢蜜环菌菌索为实验材料，利用农杆菌介导法将含有增强绿色荧光蛋白（EGFP）的外源基因整合到蜜环菌的基因组中，成功建立了高卢蜜环菌菌索的遗传转化体系［10］。与CaCl2转化法需要获得原生质体不同，根癌农杆菌介导的遗传转化法具有操作简单、转化效率较高、外源基因能稳定整合到寄主染色体特定位点上等优点［11-12］。本研究利用农杆菌介导法，在已经建立的高卢蜜环菌菌索的遗传转化体系基础上，从农杆菌的选择、抗生素的种类及浓度、共培养时间、菌液浓度和浸染方式6个方面探究该遗传转化体系的优化条件。高卢蜜环菌为名贵中药天麻和猪苓的共生真菌，并为其输送营养物质，是天麻和猪苓重要的营养来源［13-14］，天麻为兰科植物的干燥块茎，近年来，天麻的临床应用和药用价值受到了广泛关注，但是其与蜜环菌的共生机制尚未清楚。天麻、猪苓与蜜环菌共生机制的研究亟需建立一套高效且稳定的高卢蜜环菌遗传转化体系。此外，由于高卢蜜环菌品质的优良直接影响到天麻的产量与质量，欲提高天麻的产量和质量可以从改造与之共生的高卢蜜环菌入手。然而，已建立的高卢蜜环菌遗传转化体系的转化效率较低，尚不能满足基因编辑、基因功能的研究，分子育种等一系列分子生物学实验的需求［15］。因此，在前期工作的基础上，本文对高卢蜜环菌遗传转化体系进行优化，提高遗传转化效率，为后续高卢蜜环菌功能基因、分子育种及与天麻共生机制的研究奠定基础。1 材料1.1　菌株和载体高卢蜜环菌为本实验室保存的菌株；农杆菌EHA105，LBA4404，AGL-1，GV3101为本实验室保存菌株；大肠埃希菌菌株Escherichia coli Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司，批号L20710），基因表达载体pCAMBIA2300-AG1，pCAMBIA1300-GFP为本实验室保存。1.2　主要试剂及培养基Plant Genomic DNA Kit、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、同源重组试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，批号分别为W9907、W9930、W9726、W9122］）；Fast pfu Fly聚合酶（北京全式金生物技术有限公司，批号P10312）；G418 Sulfate、利福平（Rif）、头孢噻肟钠（Cef）（上海源叶生物，批号分别为M31GS149857、A08GS144743、J28GS155891）；卡那霉素（Kan）（北京索莱宝科技有限公司，批号815H042）；潮霉素（Hyg）（北京酷莱搏，批号CH30883552）；乙酰丁香酮（上海麦克林公司，批号C10242549）；其他试剂均为国产分析纯。Potato Dextrose Agar（PDA）培养基：马铃薯浸出粉4 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂粉12 g·L-1，pH 5.6~5.8，加去离子水定容至1 L，121 ℃高温高压灭菌15 min。Luria-Bertani（LB）培养基：酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，加超纯水定容至1 L，121 ℃高温高压灭菌20 min；共培养基：PDA培养基中加入终浓度为200 μmol·L-1乙酰丁香酮；筛选培养基：在PDA培养基中加入终质量浓度为10 mg·L-1 Hyg，400 mg·L-1 Cef。1.3　主要仪器SCIENTZ-48型高通量组织研磨仪（宁波新芝生物科技有限公司）；5415D型离心机（Eppendorf公司）；Veriti 96型孔梯度聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（Applied Biosystem公司）；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；SYNGENE型凝胶成像系统（GENE公司）；Nanodrop 2000型微量核酸定量分析仪（Thermo Fisher公司）；LightCycler 480型实时荧光定量PCR仪（美国罗氏公司）；Zeiss LSM 880型双光子激光扫描共聚焦显微镜（美国ZEISS公司）。2 方法2.1　载体pH101-PAgGPD-GFP-TrpC的构建利用Primer Premier 5软件分别设计目的基因MCS，prototer-AgGPD，trpC-teminator的全长序列扩增引物，并由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。在本实验室前期改造的真菌表达载体pCAMBIA1300-GFP基础上进行载体构建。采用无缝拼接试剂盒构建底盘质粒pH101-PAgGPD-GFP-TrpC，新构建载体采用了来源于蜜环菌的启动子序列。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列（5'-3'）长度/bp1033-PAbGPD.F1上游TTGCCCCCCGGGGGCGATAAGCTTGTTGTGTG321034-PAbGPD.R下游CAAAGGGCTATTTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT321035-Bone1.F上游GGACCTCTTAAATAGCCCTTTGGTCTTCT291036-Bone1.R1下游GACGGTACCGAGCTCGCCTGGGGTGCCTAATGAG341037-Frag1.F2上游CTTTTTCATATCTCATTGCCCCCCGGGGGCGATAA351038-Frag1.R2下游GGAGATCTGTCGACGGTACCGAGCTCGCC291039-PAgGPD.F1上游 GCAGTGAAACGTGATGATTAAT221040-PAgGPD.R1下游 CTACGAGAACACGACG171041-GFP.F1上游CGGCTATGAGCAAGGGCGAGGAGC241041-PAgGPD.F21051-HP101seq.F1下游TCGGTACCGTCGACAGATCTCCATGGGCAGTGA上游AACGTGATGACGCCCGATACCCTGTCCT33281052-HP101ver.R1下游CAGAAGACGGCTGCACTGAAC21以Frag1_pCAMBIA1300为初始载体，根据设计的引物获取目标基因片段，使用同源重组技术将MCS，prototer-AgGPD，trpC-teminator连接到质粒载体上，并将构建的载体命名为pH101-PAgGPD-GFP-TrpC。载体转化大肠埃希菌（E. coli Trans1-T1），并进行PCR扩增验证阳性转化子。经菌落PCR验证的含有目的条带的阳性转化子送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。采用DNAMAN软件和SnapGene软件对测序获得的序列进行拼接比对，获得验证正确的载体pH101-PAgGPD-GFP-TrpC菌株。构建完成的载体图谱，见图1。将获得的阳性菌株扩大培养，提取质粒。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.F001图1pH101-PAgGPD-GFP-TrpC质粒Fig.1Plasmid of pH101-PAgGPD-GFP-TrpC2.2　农杆菌工程菌的制备使用CaCl2法制备农杆菌感受态细胞［16］，取制备的农杆菌感受态细胞置于冰上融化，完全融化后轻轻混匀，向感受态细胞悬液200 μL中加质粒1 μL，混匀后冰浴放置10 min，液氮速冻5 min，37 ℃热激5 min，向离心管中加入无菌LB培养基（不含抗生素）1 mL，混匀后置于28 ℃，200 r·min-1左右摇床震荡培养4 h，使菌体复苏并表达质粒上的抗生素抗性基因。然后以2 350×g离心5 min，去上清，加入新鲜LB培养基100 μL后将细胞轻轻吹打均匀，涂布于含有抗生素的LB平板（50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif，下同），28 ℃倒置培养48 h。选择单克隆菌落并进行菌液PCR验证，将阳性转化子送至北京六合华大基因科技有限公司测序，鉴定后的阳性克隆菌种接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期，无菌条件下将阳性克隆菌液与灭菌后的50%甘油等体积混合于保菌管中，-80 ℃保存。农杆菌浸染液的制备：取-80 ℃保存的工程菌菌液10 μL加入到LB液体培养基1 mL中，28 ℃恒温过夜培养24 h活化菌株。取活化后菌液接种到LB液体培养基50 mL中，于28 ℃，200 r·min-1 的摇床中避光培养至菌液浓度吸光度A600 nm=0.6。将制备好的农杆菌工程菌2 350×g离心5 min收集菌体，在无菌环境中弃上清，在LB培养基50 mL中加入终浓度为200 μmol·L-1乙酰丁香酮对菌体进行重悬，于28 ℃，200 r·min-1 的摇床中避光培养至菌液浓度A600 nm=0.6。2.3　农杆菌法介导高卢蜜环菌转化体系的优化2.3.1　高卢蜜环菌耐受性试验将高卢蜜环菌接种于含不同浓度Kan（100、400、600、800 mg·L-1），G418（75、100、125、150 mg·L-1），Hyg（7、10、15 mg·L-1）和Cef（100、200、400、500 mg·L-1）的PDA培养基上，使用Synbiosis ProtoCol 3测量影像分析仪观察并拍摄蜜环菌在不同浓度抗生素上的生长情况，使用SmartRoot软件进行跟踪标记高卢蜜环菌生长轨迹［17］。2.3.2　浸染农杆菌种类及浓度的优化农杆菌选择实验室常用的EHA105、LBA4404、AGL-1、GV3101共4种农杆菌；选取优化后的农杆菌进行浓度优化，农杆菌浓度A600 nm在0.2~1.5。2.3.3　浸染方法的优化采用负压浸染与常压静置浸染两种方式研究不同浸染方法对转化效率的影响。将高卢蜜环菌菌索（约1 cm）浸泡于农杆菌菌液中，分别将其置于常压和真空泵抽真空后的负压环境中进行浸染，浸染的时间均为10 min。2.3.4　共培养时间优化浸染后的高卢蜜环菌菌索用无菌纸吸去多余菌液，将菌索转移到共培养基上，25 ℃避光培养，培养时间为1~6 d。2.3.5　筛选使用含有800 mg·L-1 Cef的无菌水和无菌水分别清洗高卢蜜环菌菌索3次，并接种到含一定浓度Cef、Hyg、Kan、G418的PDA培养基中，25 ℃避光培养。2.3.6　复筛将新生的高卢蜜环菌菌索转移到含一定浓度Cef、Hyg、Kan、G418的PDA培养基中，待高卢蜜环菌生长旺盛，挑取部分菌索提取DNA。2.4　高卢蜜环菌基因组DNA提取使用高通量组织研磨仪将蜜环菌菌索研磨粉碎，使用“高效植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）”提取DNA，使用核酸蛋白仪测定DNA浓度和纯度，-20 ℃保存备用。2.5　转基因高卢蜜环菌阳性菌株鉴定2.5.1　使用鉴定引物1051-HP101seq.F1、1052-HP101ver R1对提取的蜜环菌DNA进行克隆PCR扩增条件为95 ℃预变性10 min；94 ℃变性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸30 s。将PCR产物送测序验证。2.5.2　荧光检测将转化后新生的高卢蜜环菌菌索制片，用双光子激光扫描共聚焦显微镜观察。激发光波长为488 nm，放大倍数为20/40倍。3 结果3.1　载体的构建选用DNA限制性内切酶AatII和SphI对质粒pCAMBIA1300-GFP进行双酶切，载体条带大小为7 487 bp，切胶回收后命名为Frag1_pCAMBIA1300，用同源重组方法将双孢蘑菇GPDⅡ基因启动子、蜜环菌内源GPD基因启动子及内含子、潮霉素基因、核定位信号和构巢曲霉trpC基因终止子等元件构建到切胶回收后的载体上，载体大小为10 862 bp，构建的载体命名为pH101-PAgGPD-GFP-TrpC。3.2　高卢蜜环菌遗传转化体系的优化3.2.1　高卢蜜环菌耐受性试验将高卢蜜环菌接种到含有不同浓度抗生素的PDA培养基中培养。结果显示，蜜环菌在800 mg·L-1 Kan、150 mg·L-1 G418、10 mg·L-1 Hyg存在时，生长受到抑制。由于Hyg在真菌中广泛使用，且重复性好和用量少，因此选择Hyg作为后期的高卢蜜环菌筛选抗生素。蜜环菌在200~400 mg·L-1 Cef存在时均可生长，因此选择400 mg·L-1 Cef作为转化高卢蜜环菌后去除农杆菌的抗生素，见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.F002图2不同抗生素浓度高卢蜜环菌生长情况Fig.2Growth of Armillaria gallica at different antibiotic concentrations注：A.Kan浓度筛选；A1~A4.100、400、600、800 mg·L-1；B.G418浓度筛选；B1~B4.75、100、125、150 mg·L-1；C.Hyg浓度筛选；C1~C4.5、7、10、15 mg·L-1；D.Cef浓度筛选；D1.空白；D2~D4.100、200、400 mg·L-13.2.2　浸染方法的优化浸染方式为负压浸染和常压静置浸染，结果显示，基于真空泵的负压真空浸染法，转化后蜜环菌生长状态优于常压静置浸染法，见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.F003图3不同浸染方法高卢蜜环菌的生长状态Fig.3Growth status of Armillaria gallica with different infection methods注：A.真空泵浸染；B.静置浸染3.2.3　其他条件的筛选农杆菌菌株：在LBA4404、EHA105、GV3101、AGL-1 4种不同农杆菌菌株中，EHA105的转化效率最高，约3%，其余各组农杆菌未转化或者转化效率较低。共培养时间：浸染过后的蜜环菌经1、2、3、4、5、6 d的共培养，结果显示共培养2~3 d的转化率最高，约达3.2%，4~6 d后随着共培养时间的增加转化率降低。农杆菌浓度的筛选：当扩大培养的农杆菌菌液A600=0.6左右时，农杆菌的浸染效率3%，浸染效率较其他处理组高。由农杆菌EHA105介导的PH101-PAgGPD-GFP-TrpC转化高卢蜜环菌，提取样品DNA，PCR法验证高卢蜜环菌基因组中是否含有目的基因。电泳结果见图4，转化后的高卢蜜环菌基因组含有目的片段，未转化高卢蜜环菌中并未扩增出相同的片段。将含有目的条带的产物进行测序，对测序结果进行拼接后，得到序列与合成序列一致。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.F004图4高卢蜜环菌转化的电泳检测Fig.4Electrophoresis detection of Armillaria gallica transformation注：M.2 000 bp Maker；1~12.转化后高卢蜜环菌；ck.空白pH101-PAgGPD-GFP-TrpC载体定位于细胞核上并表达，利用双光子共聚焦显微镜对转化后的高卢蜜环菌菌索进行观察，在蓝光（488 nm）激发下，能够观察到菌丝有绿色的荧光点；明场下菌丝的细胞核为淡绿色的荧光点；空白对照无绿色荧光点，见图5。结果表明转入的外源基因已整合到蜜环菌基因组中。10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.F005图5高卢蜜环菌菌丝的荧光观察Fig.5Fluorescence observation of Armillaria gallica hyphae注：A.蓝光（488 nm）激发下的菌丝荧光；B.明场下的菌丝荧光图；C.明场下空白4 讨论高卢蜜环菌是名贵中药材天麻和猪苓等中药材的共生真菌，高卢蜜环菌的生长状况直接影响到其共生植物的生长发育。且对蜜环菌与天麻、猪苓共生机制的研究，可从研究高卢蜜环菌入手。本研究对高卢蜜环菌的遗传转化体系进行了优化，统计结果显示，优化后转化效率约为4.33%，相比优化前转化效率提高了近8倍。该体系的优化，为进一步从分子水平上研究高卢蜜环菌菌株的定向改良、生长规律以及天麻与蜜环菌的共生机制奠定了重要基础。基于本实验室之前的研究，在已经建立好的蜜环菌遗传转化体系的基础上，主要从抗生素种类及浓度、农杆菌种类、浸染方法、共培养时间和农杆菌菌液浓度这5个方面对该体系进行了优化。首先是农杆菌的选择，能够转化真菌的农杆菌有很多种，如AGL-1，EHA105，LBA1100，LBA4404等。优化后所使用的农杆菌是本实验室保存的EHA105根癌农杆菌，该菌株由EHA101菌株改造而来，该菌相较于其他农杆菌具有较高的转化率（3%），且含有利福平抗性基因，便于转化筛选。众所周知，细菌的生长呈现对数型指数增长趋势，菌液的浓度对后续实验的影响尤为重要［18］。经反复筛选实验发现，将阳性农杆菌工程菌扩大培养时，菌液A600 nm达到0.6时为农杆菌的最佳转化浓度。此时的农杆菌处于对数增长期，生长旺盛也更活跃。当该值0.6甚至过高时，此时的农杆菌生长缓慢或者可能已经老化，会影响后续的浸染效率。与猪苓等其他真菌不同，高卢蜜环菌是由营养菌丝形成菌索的为数不多的几个物属之一，其菌索高度分化，完全自治，并且向顶性生长。选取的浸染材料应选用生长旺盛的蜜环菌菌索，因为此时的菌索处的细胞分裂和分化最为旺盛，更有利于提高遗传转化的效率。在尽量去除菌索表面培养基后，长度取1 cm左右即可，过长或过短均会影响操作的方便性及浸染效率。高卢蜜环菌使用农杆菌浸染后，在共培养基上共培养2~3 d时转化效率为最高，而共培养4~6 d后发现，高卢蜜环菌的活力随共培养时间增加而降低，后期在筛选培养基上基本不生长，即转化率随着共培养时间的增加而降低。因此合适的共培养时间为2 d。关于农杆菌的浸染方式的研究报道甚少，但真空渗入浸染已成为烟草遗传转化的主要方式，利用真空渗入浸染烟草比普通浸染对出芽的影响更大，再生芽健壮且生长快，特别是当真空度为0.04 MPa时，转化率最高［19］。在本研究中，使用真空泵抽真空浸染的高卢蜜环菌比静置浸染的高卢蜜环菌生长状态更好，其长出分支的速度明显高于静置浸染的蜜环菌。因此，使用真空泵抽真空的负压浸染方式的浸染蜜环菌的效果更理想。在蜜环菌的耐受性实验中，分别选取了含不同浓度的四种抗生素的PDA培养基对其进行筛选。当培养基含800 mg·L-1 Kan、150 mg·L-1 G418或10 mg·L-1 Hyg时，均能对高卢蜜环菌的生长产生较好的抑制。但由于Hyg在真菌中应用广泛，且重复性好和用量少，故选取10 mg·L-1 Hyg为后期筛选高卢蜜环菌的抗生素。当Cef为200~400 mg·L-1时，高卢蜜环菌的生长并未受到明显抑制，故选取400 mg·L-1浓度的Cef作为转化高卢蜜环菌后去除农杆菌的抗生素。