重症肌无力（MG）是一种神经肌肉接头传递障碍的获得性自身免疫性疾病，病变部位在神经肌肉接头（NMJ）的突出后膜。致病性抗体包括常见的乙酰胆碱受体（AChR）抗体及不常见的肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）抗体及兰尼碱受体（RyR）抗体等，这些抗体可阻断AChR的聚集、并破坏AChR的功能及神经肌肉接头间信号的传递。疲劳性、波动性的肌肉收缩无力为核心的临床症状，可累及眼、延髓、呼吸和四肢肌肉等全身骨骼肌，临床表现也因自身抗体类型和是否存在胸腺瘤而异［1］。重症肌无力全球患病率为（150~250）/百万，我国重症肌无力发病率约为0.68/10万，女性略高于男性。全身骨骼肌均可受累，症状呈“晨轻暮重”，活动后加重、休息后可减轻的特点［2］。重症肌无力的治疗目前西医仍以胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换为主。中药对重症肌无力治疗有独特的优势，提高临床疗效同时减轻西药用量及副作用、改善机体免疫平衡［3］。升陷汤出自民国名医张锡纯的《医学衷中参西录》，用于治疗“气短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘。或气息将停，危在顷刻”的大气下陷证，法以益气升提，以补中益气汤化裁，方有黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗［4］。有研究表明升陷汤可以提高自身免疫力。《中医内科临床诊疗指南》中提出重症肌无力危象期属中医大气下陷证候，用升陷汤治疗［5］。国医大师邓铁涛［6］、王健教授［7］等临床实践表明重症肌无力属脾胃虚损、元气虚脱证候范围，用升陷汤治疗疗效显著。虽然该方剂在临床上被各医家广泛地应用，但是对该方剂作用疾病的分子基础和作用机制尚不完全清楚，目前缺乏更加系统、深入地研究。网络药理学是近年来的新兴学科，是基于系统生物学、多向药理学及蛋白组学，通过高通量组学数据分析和网络数据库的检索，基于“疾病-基因-靶点-药物”互作网络，通过分析整个网络以阐释药物的药理作用和疾病的发病机制，揭示多分子药物对疾病网络的干预与影响［8-9］。不仅体现了中药复方多成分、多靶点的作用机制特点，也同中医的整体观及辨证论治的原则相符［10］。本研究运用网络药理学联合分子对接技术，分析升陷汤的有效成分，预测升陷汤治疗重症肌无力的作用靶点及信号通路，并结合实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）大鼠动物模型的实验验证，进一步探讨升陷汤治疗重症肌无力的分子机制，并明确相关作用关键靶点，同时也为临床新药的研发提供基础理论依据。1 资料与方法1.1　中药成分及靶点搜集通过中药系统药理学数据库与分析平台［11］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）检索黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗所含活性成分，根据毒药物动力学（ADME）原则设定口服生物利用度（OB）≥30、类药性（DL）≥0.18两个筛选条件，初步筛选出5味中药的潜在活性成分，利用得到的活性成分在该数据库中捕获对应靶点，并在UniProt数据库［12］（https：//www.uniprot.org/）中利用UniProtKB搜索功能（以“Homo sapiens”和“Reviewed”为筛选条件，将所获得的蛋白名转换为对应基因名，整理得到黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗有效成分的所有靶点。利用Cytoscape 3.8.2软件构建中药有效成分-靶点网络［13］。1.2　重症肌无力相关靶点的筛选以“myasthenia gravis”为关键词，分别输入GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）［14］、DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）［15］、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/）［16］和TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）［17］、PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）［18］，取交集并删除重复靶点，获取疾病靶点，输入到UniProt数据库中，得到对应基因名，最后得到所有重症肌无力疾病相关靶点。1.3　疾病-中药活性成分-交集靶点网络构建为了确定5味中药有效成分作用于重症肌无力的对应靶标，通过Perl语言分析得到重症肌无力靶点与黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗有效成分对应靶点的交集靶点，并绘制韦恩图；再将这些中药的有效化合物和相互作用的交集靶点数据导入Cytoscape 3.8.2软件构建“疾病-中药活性成分-交集靶点”网络并进行拓扑分析，以探索黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗活性成分的药理作用机制。1.4　构建核心靶点网络将上述得到的交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org）［19］，选择“multiple proteins”，属性限定“Homo sapiens”，并隐藏游离节点，其他参数保持默认值，获取交集靶点相互作用网络，同时设置medium confidence0.4的数据来保证本分析的可靠性。下载蛋白质-蛋白质tsv格式文件，将所筛选的蛋白节点建立对应关系并整理在Excel表格里，利用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化，用Cytohubba插件筛选核心靶点，并以度值为标准构建蛋白互作网络。1.5　基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将交集靶点导入Hiplot数据库（https：//hiplot.com.cn/），物种为“Homo sapiens”，设定阈值P0.01，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。选取前30个条目，绘制成气泡图和条形图，得到升陷汤治疗重症肌无力所参与的生物学过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC）及主要信号通路。1.6　关键活性成分与核心靶点的分子对接验证基于以上研究结果，运用Network Analyzer插件进行网络拓扑结构分析，度值越大的节点在网络中的重要性越大，选取节点度值前3位且靶点数目最多的活性成分作为配体，用Cytohubba插件筛选核心关键基因作为受体，二者进行分子对接，在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的3D结构，在PDB数据库（http：//www1.rcsb.org/）获取靶点的蛋白3D结构，利用AutoDockTools1.5.6、AutoDock Vina及PyMOL软件进行分子结构处理和分子对接。1.7　实验验证1.7.1　动物60只雌性SPF级Lewis大鼠，体质量160~180 g，周龄6~8周，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2016-0006，饲养于长春中医药大学动物实验中心SPF级屏障实验室，自由食水，室内保持（21±2） °C，相对湿度50%~60%，昼夜明暗交替12 h。实验过程经长春中医药大学实验动物伦理委员会审查通过。1.7.2　试剂与仪器醋酸泼尼松片（上海上药信谊药厂有限公司，批号H31020675）；升陷汤所需配方颗粒（生黄芪18 g、知母9 g、柴胡5 g、桔梗5 g、升麻3 g，批号20210823）由长春中医药大学附属医院药学中心提供；大鼠来源的AchRα亚基97-116肽段（中国苏州强耀生物科技有限公司）；完全福氏佐剂（CFA）、不完全福氏佐剂（IFA）（美国Sigma-Aldrich公司，批号分别为F5881、F5506）；肺结核菌H37RA干粉（美国Difco Bacto公司，批号231141）；大鼠抗乙酰胆碱脂酶受体抗体（AchR-Ab）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（酶免公司，货号MM-70967R1）；磷酸盐缓冲液（PBS，赛默飞公司，货号003002）；磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗体（美国Abcam公司，货号ab38449）；蛋白激酶B（Akt）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号4691）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参抗体（Proteintech公司，货号10494-1-AP）；二抗辣根过氧化酶标记山羊抗兔（美国Abcam公司，货号ab150077）；RIPA裂解液（强）、蛋白预染Marker、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天公司，货号分别为P0013B、P0068、P0010S）。1.7.3　实验性EAMG大鼠模型制备及分组从60只Lewis雌性大鼠中，随机选取8只作为佐剂组，剩余52只参考BAGGI等［20］方法采用主动免疫法建立EAMG大鼠模型，每只大鼠注射混合乳剂200 μL，将Rα97-116肽段干粉和结核分枝杆菌H37RA粉加入到PBS中，每200 μL PBS中含有Rα97-116干粉50 μg、H37RA干粉1 mg，在冰盒上进行超声溶解，使多肽和干粉充分融于PBS直至溶液浑浊。溶解后液体抽取到1 mL注射器里，另一支注射器抽取CFA 200 μL，医用软管将2个注射器连接，将含义肽段和菌粉的PBS和CFA混合，防止蛋白变性，整个过程在冰上进行，反复来回抽吸2只注射器，直到出现乳白色液体，并且乳剂不溶解、不扩散，保持球状长时间浮于水面上，则造模药配制成功。配备好的造模抗原乳剂每只鼠皮下注射于尾基部、双后肢足垫和背部两侧共5个点位。将CFA与PBS的混合乳剂等量注射给佐剂组；首次免疫当天记为第0天，于第30天、第45天各给予1次加强免疫，免疫乳剂的配制、注射剂量、注射位点和注射方法与首次免疫相同，只将CFA换为IFA。佐剂组注射IFA与PBS混合乳剂，注射剂量、注射位点和注射方法与首次免疫相同。第60天评估模型，以体质量变化、Lennon临床症状分级法［21］及大鼠尾静脉外周血清AChR-Ab水平变化评估模型成功与否。并将符合EAMG标准Lewis大鼠随机分为模型组、升陷汤低剂量组、升陷汤中剂量组、升陷汤高剂量组和醋酸泼尼松片组各8只。1.7.4　灌胃给药及取材给药剂量参考《药理实验方法学》中关于人与动物体表面积折算等效比值表（大鼠比表面积/人体比表面积=6.6）进行折算，大鼠每公斤体质量生药量27 g左右。升陷汤中药配方颗粒高剂量组58.5 g、升陷汤中剂量组29.25 g、升陷汤低剂量组14.63 g，分别加纯水溶解并定容至100 mL，20 mL·kg-1；醋酸泼尼松片组5.4 mg·kg-1·d-1；佐剂组予与治疗等体积的生理盐水。每日1次灌胃，连续20 d后处理大鼠并取大鼠脾脏组织后快速冷冻于液氮中，并储存于-80 °C冰箱中备用。1.7.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）分析将取出的脾脏组织剪碎后放入RIPA裂解液中，在冰上裂解30 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心（离心半径21 cm）10 min，取上清，BCA法测蛋白浓度，将样本蛋白浓度调整相同，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质样品，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，转膜结束用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，孵育Akt、p-Akt一抗（1∶500）及二抗。使用化学发光成像系统对转移的蛋白条带进行曝光显影，光密度定量分析，采集图像。1.7.6　统计学方法采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料以x¯±s表示，使用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果2.1　中药有效活性成分及靶点筛选通过上述筛选条件检索TCMSP数据库，同时去除未找到相关作用靶点的化合物，共获得138个有效活性成分，去除重复最终得到76个活性成分，其中黄芪20个、知母15个、柴胡17个、升麻17个、桔梗7个，见表1。通过UniProt数据库转换得到517个作用靶点，去重整理后得到118个靶点。10.13422/j.cnki.syfjx.20220411.T001表1升陷汤中药活性成分情况Table 1Potential active ingredients of ShengxiantangMol IDOB/%DL来源中药Mol IDOB/%DL来源中药MOL00037936.740.92黄芪MOL00465346.060.66柴胡MOL00003336.230.78黄芪MOL01318757.130.64柴胡MOL00021155.380.78黄芪MOL00470230.500.63柴胡MOL00029636.910.75黄芪MOL00459831.970.59柴胡MOL00043368.960.71黄芪MOL00462447.720.53柴胡MOL00037441.720.69黄芪MOL00460948.960.41柴胡MOL00038731.100.67黄芪MOL00049030.050.31柴胡MOL00043949.280.62黄芪MOL00035449.600.31柴胡MOL00044239.050.48黄芪MOL00464831.600.28柴胡MOL00037153.740.48黄芪MOL00462847.820.28柴胡MOL00038064.260.42黄芪MOL00009846.430.28柴胡MOL00035449.600.31黄芪MOL00042241.880.24柴胡MOL00037874.690.30黄芪MOL00464479.910.23柴胡MOL000398109.990.30黄芪MOL00164542.100.20柴胡MOL00023950.830.29黄芪MOL01204031.310.84升麻MOL00009846.430.28黄芪MOL00192453.870.79升麻MOL00043867.670.26黄芪MOL01208140.100.76升麻MOL00041747.750.24黄芪MOL00044943.830.76升麻MOL00042241.880.24黄芪MOL00035936.910.75升麻MOL00039269.670.21黄芪MOL01205533.840.74升麻MOL00451435.260.87知母MOL01205383.020.45升麻MOL00454035.500.87知母MOL01199931.310.42升麻MOL00454230.670.86知母MOL01202336.790.40升麻MOL00377336.160.84知母MOL01206237.190.40升麻MOL00054680.880.81知母MOL00192568.180.40升麻MOL00448960.060.79知母MOL01199147.640.35升麻MOL00044943.830.76知母MOL012052102.670.34升麻MOL00449751.650.62知母MOL01201130.040.32升麻MOL00452841.580.61知母MOL000483118.350.26升麻MOL00449238.720.58知母MOL01207330.190.24升麻MOL00167758.020.52知母MOL01207850.010.23升麻MOL00437345.410.44知母MOL00435542.980.76桔梗MOL000483118.350.26知母MOL00607039.840.71桔梗MOL00042241.880.24知母MOL00458066.440.27桔梗MOL000631112.900.20知母MOL00602639.210.25桔梗MOL00471842.980.76柴胡MOL00599645.150.25桔梗MOL00044943.830.76柴胡MOL00000636.160.25桔梗MOL00277640.120.75柴胡MOL00168934.970.24桔梗2.2　重症肌无力疾病相关靶点筛选从GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD和PharmGKB数据库中以“myasthenia gravis”为关键词查找重症肌无力相关的所有靶点，经筛选后共获得655个重症肌无力相关的靶点，见增强出版附加材料。2.3　疾病-中药活性成分-交集靶点网络构建基于Perl语言分析升陷汤中药活性成分靶点与重症肌无力疾病对应靶点，得到交集靶点蛋白共21个，认为这些蛋白质是升陷汤治疗重症肌无力的相关靶点。通过Cytoscape 3.8.2构建疾病-中药活性成分-交集靶点网络，网络中共有90个节点和331条边。度值表示与该点连接的边的数量，度值越大，表示该节点与其他节点作用越广泛。绿色菱形代表疾病，蓝色长方形代表靶基因节点，红色椭圆形代表5种中药，各活性成分在其周围呈圆形排列。进一步的拓扑学分析（依据网络节点的度值和Betwennes Centrality大小）显示，该网络中的关键化学成分为薯蓣皂苷（diosgenin，MOL000546）、槲皮素（quercetin，MOL000098）、木犀草素（luteolin，MOL000006）等。该疾病-活性成分-靶点网络具有成分复杂、靶点多、成分与靶点相互作用密切等特点，形成了升陷汤治疗重症肌无力的复杂网络。见增强出版附加材料。2.4　升陷汤治疗重症肌无力PPI网络的构建及核心靶点的筛选为了更好解释升陷汤作用于重症肌无力相关的机制，笔者对其21个交集靶点进行了进一步评估，以分析它们之间的关系。将21个交集靶点导入STRING数据库，获得蛋白互作信息，利用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理。交集靶点网络共有21个节点，44条边。节点代表中药有效成分治疗重症肌无力的靶点，靶点间的相互度值越大则其颜色越深，表明该节点越重要。进一步利用Cytohubba和MCODE插件筛选核心靶点，取7种算法的交集基因，获得最终的核心靶点Akt1、ESR1、TP53，说明升陷汤可能通过这些蛋白发挥重症肌无力的治疗作用。见增强出版附加材料。2.5　GO富集分析将21个交集靶点输入Hiplot在线数据库，设置Pvalue0.01，Qvalue0.05，进行GO富集分析得到的前10个条目绘制气泡图，共得到68个BP、20个MF和14个CC。经系统分析，发现升陷汤治疗重症肌无力的生物过程中位于前列的有蛋白质运输的正调控、蛋白质定位的正调节、上皮细胞增殖、DNA结合转录因子活性的调节、抗氧化反应、活性氧代谢过程的调节、细胞的氧化应激反应及细胞的化学应激反应等过程。其分子功能中位于前列的有细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性、信号受体激动剂的活性、生长因子受体结合磷酸酶结合和G蛋白偶联胺受体活性等。其细胞组成中位于前列的有膜筏、膜微结构域、突触膜、突触前膜等。见增强出版附加材料。2.6　KEGG信号通路富集分析通过Hiplot在线数据库对21个交集靶点进行KEGG信号通路富集分析，结果显示其主要富集于76条信号通路（P0.01），前20条通路绘制条形图，见增强出版附加材料。与重症肌无力息息相关的信号通路主要包括Toll样受体信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、T细胞受体等信号通路等。2.7　分子对接技术预测中药活性成分与潜在靶点的结合能力根据“疾病-中药活性成分-交集靶点”网络分析得到前3个核心活性成分薯蓣皂苷、槲皮素、木犀草素与Cytohubba及MCODE插件筛选的前3个核心靶点Akt1、TP53和ESR1进行结合能力预测。一般认为，当小分子受体与配体结合构像越稳定时，其能量越低产生的相互作用型越大［15］，根据对接得分可知，Akt1与槲皮素的结合性最强，能量得分最低，见表2。二者通过氨基酸残基LYS-30发生H键作用，见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20220411.T002表23个分子靶点分子对接结合能Table 2Molecular docking of 3 target核心靶点PDB ID化合物名称结合能/kJ·mol-1Akt1P31749薯蓣皂苷-8.80槲皮素-9.31木犀草素-3.19TP53P04637薯蓣皂苷-6.4槲皮素-2.11木犀草素-2.98ESR1P03372薯蓣皂苷-6.89槲皮素-2.16木犀草素-2.042.8　造模期间大鼠外周血清AChR-Ab水平变化造模期间（给药前），采用ELISA检测大鼠尾静脉外周血清中AChR-Ab的含量，EAMG模型组大鼠血清中AChR-Ab含量明显高于佐剂组［佐剂组（42.931±2.966） pmol·L-1，EAMG组（48.497±5.256） pmol·L-1，P=0.003］。2.9　升陷汤对大鼠脾脏Akt蛋白表达水平的影响采用Western blot检测治疗结束后各组大鼠脾脏组织中Akt蛋白及磷酸化的表达，见表3。与佐剂组比较，EAMG模型组大鼠p-Akt蛋白表达明显升高（P0.05），与EAMG模型组比较，升陷汤低、中、高剂量组和醋酸泼尼松组p-Akt蛋白表达均明显降低（P0.05）。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220411.T003表3升陷汤对大鼠脾脏p-Akt蛋白表达水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Protein expression of p-Akt in rats of spleen tissue（x¯±s，n=3）组别剂量p-Akt/Akt佐剂组0.312±0.017EAMG模型组0.767±0.0161）升陷汤低剂量组1.463 g·L-10.657±0.0141）升陷汤中剂量组2.925 g·L-10.607±0.0181）升陷汤高剂量组5.85 g·L-10.506±0.0071）醋酸泼尼松组5.4 mg·kg-1·d-10.484±0.0141）注：与佐剂组比较1）P0.0510.13422/j.cnki.syfjx.20220411.F001图1各组大鼠脾脏p-Akt蛋白表达电泳Fig.1Expression level of p-Akt analyzed by Western blot注：A.佐剂组；B.EAMG模型组；C.升陷汤低剂量组；D.升陷汤中剂量组；E.升陷汤高剂量组；F.醋酸泼尼松组3 讨论重症肌无力在现代医学中属于神经系统自身免疫性疾病，病情复杂，缠绵难愈，属于难治性疾病，国家卫生健康委员会在内联合5部门制定的《第一批罕见病目录》中纳入该病。在中医学中其属痿证，《黄帝内经·素问·痿论》中有“痿躄” “脉痿” “筋痿” “肉痿” “骨痿”的论述。根据本病的临床表现和疾病的不同阶段，可属中医不同的病证，如“睑废” “上胞下垂” “视歧” “大气下陷”等病证。近代医家张锡纯在《黄帝内经》宗气理论基础上，结合自己的临床实践，在《医学衷中参西录》中明确指出，大气即宗气，并首次提出“大气下陷”一词，并创制了治疗大气下陷证的代表方升陷汤。研究者在重症肌无力的临床治疗中发现，重症肌无力主要是由于脾气亏虚，虚极下陷，不输精微而导致，以升陷汤为主方随证加减则颇有良效，不仅能缓解症状，减慢疾病进展，而且无不良反应，同时也为广大肌无力患者漫长的病程中减轻经济负担［22］。方中以黄芪为君，黄芪补气的同是又生气，此药性甘温，故用知母之清凉降润以制之，一升一降，谓之妙也，柴胡入肝经为少阳的引经药，升举少阳之气，能引大气下陷者自左上升；升麻升举力强，升阳明之气，为阳明的引经药，能引大气下陷者自右上升，与“治痿独取阳明”同法；桔梗为舟楫为使药，轻清上行，能载诸药之力上达于胸，诸药共奏益气升提，升阳举陷之功以治重症肌无力大气下陷证［23］。网络药理学以系统生物学理论为基础，集药理学、高通量测序、基因组学等多种技术于一体，强调信号通路的多通道调控［24］。本研究从网络药理学的角度寻找升陷汤治疗重症肌无力的作用机制及潜在的治疗靶点。依托TCMSP数据平台根据毒药物动力学筛选出了升陷汤中5味中药（黄芪、知母、柴胡、升麻、桔梗）的76种有效成分，118个作用靶点；检索得到重症肌无力疾病靶点655个；经分析获得21个交集靶点基因，76条信号通路。同时构建了疾病-有效成分-交集靶点网络，分析了有效成分与靶点、靶点与疾病之间的相互作用关系，为升陷汤“多成分-多靶点-多通路”的治疗机制提供了参考依据。有效成分-交集靶点网络显示，薯蓣皂苷、槲皮素、木犀草素、豆甾醇匹配的靶点较多，为升陷汤发挥治疗重症肌无力作用的核心化合物和重要物质基础。研究表明，豆甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷、木犀草素均具抗炎，抗氧化，免疫调节和神经保护作用［25-28］。豆甾醇通过选择性抑制Akt/mTOR信号通路促进树突状突起的生长和突触发生，抑制乙酰胆碱酯酶活性，有效改善神经退行性疾病的神经损伤［29］。槲皮素的药理作用广泛，具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫调节等作用，可显著上调T辅助（Th）1中干扰素-γ（IFN-γ）和下调Th2中白细胞介素-4（IL-4）的表达，进而调节免疫功能［26，30］。薯蓣皂苷能有效抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的基因表达改善免疫功能［31］。木犀草素具有抗肿瘤、抗炎、脑血管保护等作用，其有关机制涉及PI3K/Akt、MAPK等信号通路的调节以及相关细胞因子和激酶的表达等［32］。表明升陷汤中的中药可能通过抗炎、免疫调节、神经功能保护等作用治疗重症肌无力。通过Cytohubba及MCODE插件对PPI网络中交集靶点筛选得到的核心靶点有Akt1、TP53、ESR1，预测它们可能是升陷汤治疗重症肌无力的主要靶标。研究报道Akt1可增强CD8+T细胞的分化，改善CD8+T细胞的增殖，抑制DCs的过度激活，从而达到调节免疫反应的作用［33］。研究显示重症肌无力患者外周血清中Th1和Th17细胞及其相关细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达数量增加［34］。可通过抑制Akt/mTOR信号通路调节IL-6的表达去改善重症肌无力患者肌肉疲劳性无力的症状［35］。ESR1是编码雌激素受体α（ER）的基因，具有免疫调节的作用，ESR1可以调节VEGFA的含量水平［36］，研究表明血清AChR-Ab阳性的重症肌无力患者VEGFA水平显著升高，这表明VEGFA可能参与了重症肌无力的发病［37］。TP53是当前研究最广泛的肿瘤基因，TP53既可以是自噬的激活者，也可以是自噬的抑制剂，在营养耗尽或缺氧等应激条件下，TP53通过抑制mTOR信号通路促进自噬激活，从而抑制炎症反应［38］。抑制TP53可增加IL-6的基因表达同时促进细胞的增殖分化［39］。根据KEGG通路富集分析结果可以看到，升陷汤主要通过调节Toll样受体（TLR）信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等信号通路来发挥治疗重症肌无力的作用。重症肌无力的发病与遗传、感染、免疫应答、药物等因素有关［40］。TLR是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，目前已被证明参与多种自身免疫疾病，TLR介导的先天免疫反应失调在自身免疫中起关键作用，可促进B细胞异常活化，表达和分泌多种促炎症细胞因子，如TNF-α、IL-12、IL-6等［41］。研究显示在重症肌无力患者的PBMCs中存在TLR的异常表达，TLR9 mRNA的总表达水平与重症肌无力的临床严重程度呈显著正相关，提示TLR可能参与了重症肌无力的发病机制［42］。已有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与了细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运的调控，可调节T细胞的发育、稳定和功能［43］。一项研究表明，PI3K/Akt特异性抑制剂可使重症肌无力患者PBMCs中Th1和Th17细胞显著上调，HIF-1α是糖酵解和PI3K/Akt/mTOR调控通路的连接点，HIF-1α激活GLUT1及关键糖酵解基因的表达为免疫细胞快速活化提供能量［44］。这表明PI3K/Akt/HIF-1α信号通路可调节重症肌无力的免疫功能，但仍需要进一步的动物实验研究来阐明该通路与重症肌无力的发病关系。重症肌无力的发病机制涉及体液和细胞的双重免疫应答异常，与T淋巴细胞所释放的细胞因子的免疫调节密切相关，抗体的产生依赖CD4+T细胞，T细胞受体识别特异性抗原后CD4+T细胞分化为不同的Th细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17，Th细胞和调节性T（Treg）细胞。实验研究表明［45］，升陷汤可升高EAMG模型大鼠血清CD4+T淋巴细胞含量，降低CD4+/CD8+的比例，进而抑制AChR-Ab的合成或促进其降解，起到治疗作用。研究结果涉及了T细胞受体信号通路，与网络药理学研究结果一致，一定程度上证明了网络药理学的科学性。因此，笔者预测上述信号通路是升陷汤治疗重症肌无力的关键信号通路。为了验证升陷汤对重症肌无力治疗作用的药效物质基础，运用分子对接技术选取预测靶点最多的活性成分薯蓣皂苷、槲皮素、木犀草素为配体，筛选出的核心靶点为受体，结果可见主要活性化合物均能与核心靶点通过氢键等作用稳定结合。其中属槲皮素对接到Akt1的蛋白结构上的结合能最强，通过氨基酸残基LYS-30发生H键作用。为证实上述预测进行了动物实验，结果表明升陷汤可通过调节Akt蛋白含量表达，从而改善EAMG症状，说明升陷汤对重症肌无力治疗作用机制可能是通过调节Akt等靶点蛋白的变化。综上所述，网络药理分析结果表明升陷汤主要通过薯蓣皂苷、槲皮素、木犀草素等多种活性成分作用于Akt1、TP53、ESR1等基因，调控多种生物学功能和多条信号通路起到治疗重症肌无力的作用，并运用分子对接和动物实验初步验证了升陷汤治疗重症肌无力作用机制是通过其药物的主要活性成分与潜在的核心靶点Akt发生相互作用而成，为深入研究升陷汤治疗重症肌无力的分子机制奠定基础。