重症急性胰腺炎（SAP）作为急性胰腺炎（AP）的一种特殊类型，是一种病情险恶且病死率较高的急腹症。SAP时释放大量炎症介质和细胞因子产生级联效应，引起全身炎性反应综合征（SIRS）或多器官功能障碍综合征（MODS）［1］。因为病情进展迅速，常引起呼吸衰竭、休克等严重并发症［2］。SAP属于中医“腹痛”“胰瘅”等范畴，其基本病机为湿热瘀毒互结、阳明腑气不通［3］。血必净注射液（XBJ）由经典方剂血府逐瘀汤化裁而来，方由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5种中药提取物组成，具有行气活血、清热凉血、解毒止痛之功效。XBJ作为唯一官方授权治疗脓毒症、SIRS和MODS的专利中药［4-5］，被发现对SAP可能有一定的辅助治疗作用［6］。甲酰肽受体1（FPR1）是一种G蛋白偶联受体，其激活可引起免疫应答，驱动中性粒细胞高密度地到达炎性反应位点［7］。NADH-泛素氧化还原酶链1~6（MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5、MT-ND6）均属于人线粒体基因组所编码的人源线粒体N-甲酰肽（NFPs）的氨基酸序列，而线粒体NFPs与细菌NFPs相似，同样是有效的免疫系统激活剂［8］。研究表明，抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）可减少SAP患者出现SIRS和代偿性抗炎反应综合征［9］。目前FPR1对炎症的调控机制被视为疾病潜在的治疗靶点［10］，但是近年来有关使用XBJ治疗实验性SAP大鼠的研究颇少，且治疗机制不明，故本实验选用XBJ为实验药物，观察用药后大鼠血循环中6种线粒体NFPs以及胰腺组织中FPR1和NLRP3的表达变化，进而探讨XBJ对于SAP的抗炎作用，亦为XBJ进一步研究及治疗SAP提供参考和依据。1 材料1.1　动物SPF级SD雄性大鼠40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2020-0004，体质量180~200 g。正常饲料喂养，自由进食饲料和水，室内通风良好，昼夜周期12 h，相对湿度（50±10）%，室温（22±3） ℃。实验前适应性喂养1周。本动物实验经天津市医药科学研究所动物伦理委员会批准（编号IMPS-EAEP-Z-KJ20026-01）。1.2　药物与试剂XBJ由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5味中药提取物按照1∶1∶1∶1∶1比例组成（天津红日药业股份有限公司，批号2102101）；牛磺胆酸钠（Na-Tc，美国Sigma公司，批号SLBT9650）；全血总蛋白提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号TF211148）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号UE285903）；MT-ND1抗体、MT-ND3抗体、MT-ND5抗体（美国Abcam公司，批号分别为GR3189552-7、GR3202807-11、GR3286204-5）；MT-ND2抗体、MT-ND4抗体（美国Invitrogen公司，批号分别为AB2E05N、AB2E06N）；MT-ND6抗体、FPR1抗体（英国Biorbyt公司，批号分别为A3918、W0838）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G、兔SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素法检测系统）、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥公司，批号分别为127760、2005E1124、2040A1012）；苏木素染色液、伊红染色液（广东珠海贝索生物技术有限公司，批号分别为C201004、C200801）；NLRP3抗体（武汉Boster公司，批号BOS3539BP342）。1.3　仪器Tanon-5200型化学发光分析仪、MiNi PRO型电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad公司）；多功能微孔板检测仪（瑞士Tecan公司）；Tissue-Tek® TEC®5型组织包埋机（日本樱花公司）；HI1220型烘片机、RM2235型轮转式切片机、H1210型水浴摊片机（德国Leica公司）；CX41型正置显微镜（日本Olympus公司）。2 方法2.1　动物造模及给药将40只雄性SPF级SD大鼠按随机数字表法均分为5组，分别为假手术组、SAP模型组、XBJ低、中、高剂量（4、8、12 mL·kg·d-1）组。根据XBJ说明书，SIRS患者临床用量为XBJ 50 mL加生理盐水100 mL静脉滴注，在30~40 min内滴毕，2次/d；病情重者，3次/d。人体质量按65 kg计算，XBJ给药剂量为1.54~2.31 mL·kg-1。参考《药理实验方法学》［11］中人和动物间体表面积换算得到相应等效剂量，大鼠XBJ给药剂量为9~14 mL·kg-1，故本实验中XBJ剂量设置分别为4、8、12 mL·kg-1。假手术组仅在开腹后轻轻翻动胰腺，即关闭腹腔。XBJ各剂量组从造模前3 d开始，按上述剂量每天一次性腹腔注射给药。参照文献［12］方法，模型制备前禁食12 h，不禁水。以10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，无菌条件下经腹壁正中切口入腹，以无损伤小动脉夹暂阻胆管出肝门端，在胆胰管十二指肠乳头开口对应系膜缘处用PE50导管逆行插入胆胰管0.5 cm，以无损伤小动脉夹妥善固定后匀速（0.02 mL·min-1）注入5%Na-Tc（1 mL·kg-1），以无损伤缝线缝合十二指肠穿刺孔，缝合腹壁。XBJ各剂量组于SAP造模完毕后0.5 h分别按上述剂量腹腔注射XBJ。2.2　标本采集及处理制备SAP模型4 h后，采用10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，开腹后使用量筒测定腹水体积，4%枸橼酸钠预润洗处理一次性无菌注射器抽取腹主动脉全血5 mL，室温850×g离心10 min留取血浆，用生理盐水冲洗去除血污后精确称量胰腺湿重，计算胰腺湿质量比=胰腺质量（g）/大鼠体质量（g），称量后于4%多聚甲醛中固定。2.3　苏木素-伊红（HE）染色观察胰腺组织病理学变化胰腺组织固定48 h后常规脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察胰腺组织形态变化。依照SCHMIDT等［13］病理评分标准对各组胰腺组织进行评分，评分标准见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.T001表1病理评分标准Table 1Pathology scale评分标准水肿评分标准炎症评分标准：小叶内或血管周围浸润的白细胞/高倍镜视坏死评分标准出血和脂肪坏死评分标准：出血和脂肪坏死区域0无改变0~1个无改变无改变0.5局限叶间隙扩张2~5个局限性1~4个坏死细胞/高倍镜视野1区域1弥漫叶间隙扩张6~10个弥漫性1~4个坏死细胞/高倍镜视野2区域1.51分标准+局限小叶扩张11~15个1分标准+局限性5~10个坏死细胞/高倍镜视野3区域21分标准+弥漫小叶间扩张16~20个弥漫性5~10个坏死细胞/高倍镜视野4区域2.52分标准+局限腺泡间隙扩张21~25个2分标准+局限性11~16个坏死细胞/高倍镜视野5区域32分标准+弥漫腺泡间隙扩张26~30个弥漫性11~16个坏死细胞/高倍镜视野6区域3.53分标准+局限细胞间隙扩张30个或局限形成小脓肿3分标准+局限性16个坏死细胞/高倍镜视野7区域43分标准+弥漫细胞间隙扩张35个或小脓肿汇聚16个坏死细胞/高倍镜视野≥8区域2.4　免疫组化（IHC）检测胰腺组织FPR1和NLRP3蛋白的表达取胰腺组织石蜡切片，二甲苯脱蜡及乙醇水化，热修复抗原后，按照兔SP试剂盒说明书指示阻断内源性过氧化物酶，羊血清封闭后滴加一抗FPR1抗体（1∶400）、NLRP3抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，次日洗片后常规孵育二抗，DAB显色液显色，苏木素复染，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片，显微镜下观察。用Image J图像分析系统进行图像染色强度和染色面积测量，阳性表达评分即为High Positive、Positive、Low Positive评分之和。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测血浆中MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5及MT-ND6蛋白表达采用BCA蛋白定量试剂盒定量血浆蛋白，MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3和MT-ND6均上样60 μg，MT-ND4上样30 μg，MT-ND5上样10 μg。电泳分离蛋白，转膜后5%脱脂牛奶封闭，各条带分别孵育一抗MT-ND1（1∶500），MT-ND2（1∶500），MT-ND3（1∶1 000），MT-ND4（1∶1 000），MT-ND5（1∶500），MT-ND6（1∶1 000） 4 ℃过夜，洗膜后孵育二抗（1∶5 000）1 h，洗膜后采用化学发光法曝光，使用Image J软件分析各蛋白的相对表达水平。结果中MT-ND1水平为各组MT-ND1蛋白灰度值与假手术组MT-ND1蛋白灰度值的比值，MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5和MT-ND6依此类推。2.6　统计学分析采用SPSS 24.0软件进行数据统计处理，计量资料均以x¯±s表示，数据间比较采用单因素方差分析，多组间数据比较采用最小显著性差异法（LSD）-t法，以P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠腹水量和胰腺组织湿重比的影响与假手术组比较，SAP模型组大鼠腹水量和胰腺湿质量比均明显升高（P0.05）；与SAP模型组比较，XBJ低、中、高剂量组大鼠腹水量和胰腺湿重比均显著降低（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.T002表2XBJ对SAP大鼠腹水量和胰腺湿重比的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of XBJ on abdominal water volume and pancreas wet weight /body weight in SAP rats （x¯±s，n=8）组别剂量/mL·kg-1腹水量/mL胰腺湿质量比/×10-3假手术组0.39±0.231.28±0.18SAP模型组4.70±0.571）4.66±0.351）XBJ低剂量组43.89±0.502）3.24±0.222）XBJ中剂量组82.00±0.422）2.62±0.152）XBJ高剂量组121.06±0.312）1.75±0.132）注：与假手术组比较1）P0.05；与SAP模型组比较2）P0.01（表3和表4同）3.2　对大鼠胰腺组织病理学影响与假手术组比较，SAP模型组的胰腺组织病变明显，表现为胰腺组织明显出血，腺泡细胞大面积坏死，组织水肿，小叶结构紊乱，叶间隙增宽，间质内有明显炎性细胞浸润等病理改变；与假手术组（0.38±0.35）比较，SAP模型组（12.50±1.00）病理总评分显著升高（P0.01）。与SAP模型组比较，XBJ低、中、高剂量组炎性细胞浸润、腺泡坏死及胰腺水肿和出血均明显改善；与SAP模型组比较，XBJ低、中、高剂量组（10.00±0.80）、（7.94±0.68）、（6.31±0.53）病理总评分显著降低（P0.01）。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.F001图1XBJ对SAP大鼠胰腺组织病理学的影响 （HE，×100）Fig.1Effect of XBJ on pancreatic histopathology in SAP rats （HE，×100）注：A.假手术组；B.SAP模型组；C.XBJ低剂量组；D.XBJ中剂量组；E.XBJ高剂量组（图2和图3同）3.3　对大鼠胰腺组织中FPR1和NLRP3蛋白表达的影响与假手术组比较，SAP模型组胰腺组织中FPR1表达主要定位于坏死腺泡细胞区域、炎性细胞浸润区域和胰岛，NLRP3主要表达定位于胰腺腺泡细胞胞浆部分和胰岛。经XBJ治疗后，XBJ各剂量组胰腺组织FPR1和NLRP3阳性信号区域占比较之SAP模型组均显著降低（P0.01）。见图2和表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.F002图2XBJ对各组大鼠FPR1和NLRP3在胰腺组织中表达的影响 （免疫组化，×100）Fig.2Effect of XBJ on expression of FPR1 and NLRP3 in pancreatic tissues of each groups rats （IHC，×100）10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.T003表3XBJ对SAP大鼠胰腺组织中FPR1和NLRP3表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 3Effect of XBJ on expression of FPR1 and NLRP3 in pancreatic tissues of SAP rats （x¯±s，n=8）组别剂量/mL·kg-1FPR1阳性表达评分NLRP3阳性表达评分假手术组5.95±0.378.59±1.60SAP模型组29.68±0.491）41.06±4.021）XBJ低剂量组425.16±0.582）33.25±3.932）XBJ中剂量组816.57±0.382）28.59±3.372）XBJ高剂量组1211.94±0.272）18.78±3.302）分3.4　对大鼠血浆中6种线粒体NFPs蛋白表达的影响与假手术组比较，SAP模型组MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6蛋白表达均明显增高（P0.05），MT-ND2蛋白表达明显降低（P0.05），MT-ND4和MT-ND5无明显差异；与SAP模型组比较，XBJ低、中、高剂量组MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6蛋白表达均显著降低（P0.01）；MT-ND2表达在XBJ低、中、高剂量组中呈现“抛物线”式变化，其中XBJ中、高剂量组与SAP模型组比较，差异具有显著统计学意义（P0.01）；MT-ND4的表达在3个治疗组中逐渐升高，其中XBJ高剂量组较之SAP模型组表达显著增加（P0.01）；MT-ND5在XBJ各剂量组和SAP模型组之间表达无明显变化。见图3和表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.F003图3大鼠血浆中6种线粒体NFPs蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of six mitochondrial NFPs protein expression in plasma of rats10.13422/j.cnki.syfjx.20220738.T004表4XBJ对SAP大鼠血浆中6种线粒体NFPs蛋白表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 4Effect of XBJ on protein expression of six mitochondrial NFPs in plasma of SAP rats （x¯±s，n=8）组别剂量/mL·kg-1MT-ND1MT-ND2MT-ND3MT-ND4MT-ND5MT-ND6假手术组0.97±0.281.00±0.090.92±0.270.99±0.321.00±0.250.98±0.03SAP模型组2.07±0.421）0.35±0.041）2.32±0.461）0.75±0.281.07±0.241.34±0.091）XBJ低剂量组40.85±0.382）0.32±0.082.13±0.402）0.75±0.271.04±0.261.20±0.052）XBJ中剂量组80.46±0.242）2.15±0.122）1.44±0.312）0.79±0.311.05±0.211.06±0.032）XBJ高剂量组120.31±0.172）1.90±0.182）1.26±0.222）1.13±0.352）1.04±0.250.89±0.032）注：各造模组MT-ND表达水平为各组MT-ND蛋白灰度值与假手术组MT-ND蛋白灰度值比值4 讨论本文采用胆胰管逆行注射Na-Tc刺激胰腺以模拟胰腺内炎症及坏死的病理状态，这一模型与临床SAP的病理生理过程极为相似［14］。临床研究发现XBJ治疗SAP患者，可以降低C反应蛋白、血清淀粉酶和脂肪酶的水平，缩短治疗时间，降低不良反应［15］。在2019年开始席卷全球的新冠肺炎中，XBJ可能通过调节促炎细胞因子白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α的分泌来抑制新冠肺炎重症患者的细胞因子风暴［16］。本研究发现XBJ可通过降低SAP大鼠血循环中的部分线粒体NFPs以及胰腺中FPR1和NLRP3的表达来控制炎症反应，且XBJ高剂量组效果显著。属于病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的NFPs［17］是细菌和线粒体的共同分子特征，他们通过激活FPRs在炎症起始中扮演重要角色［18］。有趣的是，GABL等［19］发现不同线粒体NFPs与FPRs亲和力不同，相较于SAP模型组，XBJ低、中、高剂量组MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6表达逐渐降低，推测XBJ可能通过降低这3种线粒体NFPs来控制全身炎症反应；而MT-ND4表达逐渐升高，推测MT-ND4可能为一种“保护性”线粒体NFPs，具有一定抗炎作用；然MT-ND2表达情况复杂，其参与炎性反应调控机制不明；MT-ND5表达则不受SAP或XBJ治疗影响。研究表明，激活FPRs可控制和招募免疫细胞到损伤部位以及介导白细胞活化［20］，且NLRP3炎性小体在先天性免疫系统［21］和SAP的发病过程［22］中发挥着重要作用。而NLRP3作为炎症小体的关键组成部分［23］，可识别PAMPs和DAMPs［24］来触发免疫细胞活化，诱导促炎细胞因子的释放［25］。本实验胰腺IHC结果可见SAP模型组FPR1和NLRP3表达显著升高，且此现象被XBJ明显抑制。因此，直接靶向FPR1和NLRP3可能是治疗SAP的有效方法。综上所述，XBJ可能是通过调节线粒体NFPs表达，抑制胰腺组织表达FPR1和NLRP3，进一步调节下游相关炎性因子和细胞因子表达等方面有效治疗SAP，从而改善胰腺组织损伤，并减轻胰腺及全身炎性反应。