贞芪扶正颗粒是由黄芪、女贞子2味中药经提取、浓缩、干燥、加入辅料制粒等现代生产工艺制备而成的复方中药制剂，具有提高人体免疫、保护骨髓和肾上腺皮质的功能，用于各种疾病引起的虚损。近年来，较多研究报道贞芪扶正颗粒用于放疗、化疗及癌症术后患者的临床疗效显著［1-6］。目前，贞芪扶正颗粒有多家企业生产，但产品质量存在一定差异。SHI等［7］采用高效液相色谱法（HPLC）对市售贞芪扶正颗粒中腺苷、红景天苷、绿原酸、毛蕊异黄酮、刺芒柄花素、黄芪甲苷6个成分进行含量测定，发现不同厂家产品间存在显著差异；任承涛等［8］利用HPLC对市售贞芪扶正颗粒中红景天苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷6个成分进行含量测定，同样发现不同厂家产品间化学成分含量的差异性。此外，康凯等［9］运用HPLC-可变波长扫描紫外检测器法（VWD）进行贞芪扶正颗粒的指纹图谱研究，标定了8个共有峰，发现7个厂家产品中有2个指纹图谱相似度差异较大。本课题组近年一直致力于贞芪扶正颗粒质量标准提升及药效物质基础研究，前期已采用HPLC-蒸发光散射检测器法（ELSD）建立了贞芪扶正颗粒指纹图谱［10］，标定了13个共有峰，发现不同厂家产品ELSD指纹图谱相似度存在明显差异。之后又对各厂家产品进行红景天苷、特女贞苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷4个成分含量测定及免疫增强药效研究，发现不同厂家产品的4个指标成分含量及药效存在显著差异［11］。在前期研究及文献报道基础上，针对贞芪扶正颗粒产品存在普遍质量差异的现状，笔者拟采用谱效相关分析开展其药效物质基础研究，探究显著影响其产品质量及药效的主要化学成分，为贞芪扶正颗粒质量标准提升提供支持。中药谱效学是以中药指纹图谱为基础，以效应及效应体学为主要内容，应用生物信息学方法，找出中药“谱”与“效”之间科学规律，谱效相关分析可为阐明中药药效物质基础、制定中药质量评价体系、优化中药或复方的提取工艺提供科学依据［12-18］。基于此，本研究收集了市场上6家主要生产企业的贞芪扶正颗粒产品共18批，采用HPLC-紫外检测器法（UV）建立该制剂的指纹图谱，通过指纹图谱共有峰峰面积差异性分析、相似度分析及层次聚类分析（HCA）全面考察不同厂家产品的质量差异性，并开展谱效相关分析及HPLC串联质谱法（HPLC-MSn）分析，以期探究贞芪扶正颗粒具有增强免疫功能的谱效成分。1 材料UltiMate3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司），ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪（美国沃特斯公司），LTQ XL型线性离子阱质谱仪（美国赛默飞世尔公司），ME204E型双量程电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，SpectraMax Plus 384型酶标仪（美国分子仪器公司）。贞芪扶正颗粒产品购自各药房或网上药店，共收集6个厂家18批产品（每个厂家3批，厂家A，批号61102120、61102124、61102131；厂家B，批号K20160305、K20161220、K20161185；厂家C，批号074161007002、074160403039、036161001044；厂家D，批号20160307、20160601、20160611；厂家E，批号170305、170410、170801；厂家F，批号160507、161102、170801），分别记录为样品A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3、F1、F2、F3。红景天苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、刺芒柄花素对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110818-201206、111920-201505、111926-201404、111703-200501，纯度分别为93.4%、97.6%、93.3%、98.8%），小鼠白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及免疫球蛋白G（IgG）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20181204、20170116、20181203），注射用环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司，批号16093025），氯化钠注射液（吉林康乃尔药业有限公司，体积分数0.9%，批号S17031625-1），水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。SPF级ICR小鼠共96只，雌雄各半，体质量18~22 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号SCXK（吉）2016-0003。动物饲养于放有垫料的聚碳酸酯盒中，自由饮用蒸馏水及进食标准颗粒饲料，饲养间温度20.0~26.0 ℃，相对湿度40.0%~70.0%，换气数≥15次/h；动物照明，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。本研究涉及的动物实验经吉林省现代中药工程研究中心有限公司动物实验伦理委员会批准，批准号B201803-01。2 方法与结果2.1　指纹图谱的建立与质量分析2.1.1　供试品溶液的制备取贞芪扶正颗粒粉末（过80目筛，下同）3.0 g，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，定量滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，过孔径为0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。2.1.2　对照品溶液的制备取红景天苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、刺芒柄花素对照品适量，精密称定，制成每1 mL分别含红景天苷44.5 μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷46.7 μg、特女贞苷53.4 μg、刺芒柄花素52.3 μg的混合对照品溶液，即得。2.1.3　色谱条件采用ACE 5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0~15 min，5%A；15~23 min，5%~8%A；23~30 min，8%~11%A；30~45 min，11%~18%A；45~60 min，18%~21%A；60~67 min，21%~23%A；67~90 min，23%~37%A），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量5 μL，检测波长220 nm。2.1.4　方法学考察取同一供试品溶液，按2.1.3项下条件连续进样6次，以峰6（选择依据为峰面积较大、保留时间适宜且有对照品作为对照的谱效相关色谱峰）为参照，计算各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）0.05%~0.2%，相对峰面积的RSD 0.9%~1.9%，表明仪器精密度良好。取同一样品，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、16、20、24 h按2.1.3项下条件测定，以峰6的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间RSD 0.06%~0.8%，相对峰面积RSD 0.3%~1.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。取同一批号样品（样品F1），按2.1.1项下方法制备供试品溶液6份，按2.1.3项下条件测定，以峰6为参照，计算各共有峰相对保留时间RSD 0.04%~0.2%，相对峰面积RSD 1.1%~2.7%，表明该方法重复性良好。2.1.5　指纹图谱的建立采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）对18批样品的HPLC图谱进行分析，建立对照图谱，通过与红景天苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、刺芒柄花素对照品色谱峰保留时间及紫外最大吸收波长比对，完成部分色谱峰指认，见增强出版附加材料。结果在指纹图谱中共标定了20个共有峰（18批样品共有峰面积占比均95%），设定6号峰为指纹图谱参照峰。2.1.6　相似度分析计算各样品图谱与对照指纹图谱之间的相似度值，进行相似度分析，结果显示，18批样品（A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3、F1、F2、F3）与对照指纹图谱的相似度分别为0.857、0.903、0.931、0.986、0.811、0.949、0.884、0.852、0.977、0.933、0.937、0.925、0.983、0.985、0.977、0.983、0.987、0.989，其中有4批样品的相似度0.90，且以样品B2的相似度为最低。2.1.7　峰面积差异性分析通过计算指纹图谱各共有峰峰面积的RSD，进行峰面积差异性分析，见表1。结果发现RSD处于38.10%~129.74%，表明来自6个生产厂家的贞芪扶正颗粒各色谱峰成分差异显著，尤其是3、4、5、10、11号峰，RSD均90%。10.13422/j.cnki.syfjx.20211853.T001表118批贞芪扶正颗粒的共有峰峰面积及其RSDTable 1Peak areas and relative standard deviations of common peaks from 18 batches of Zhenqi Fuzheng granules峰号t/min共有峰峰面积RSD/%A1A2A3B1B2B3C1C2C3D1D2D3E1E2E3F1F2F3110.656.6613.741.5910.6116.5110.5444.8931.7236.172.837.804.357.836.5412.3314.326.625.8389.99213.938.2617.794.0634.0381.2952.0587.8158.52102.5411.9814.5712.9112.3411.8711.5660.6129.8434.2685.47315.8610.539.713.797.117.776.2136.2340.9441.471.612.932.3410.3710.1510.3414.876.657.16100.09424.751.332.200.046.929.615.054.380.720.800.631.430.242.601.601.792.291.511.68100.46529.444.0613.992.7834.7498.4954.657.3910.9720.122.555.303.925.564.994.9426.1916.3117.34129.74634.1735.6748.6111.8038.2834.3739.9540.7469.9553.2315.3322.2921.6817.3816.9616.1834.2628.1629.1547.92737.401.582.710.777.504.144.128.018.3011.853.2511.885.514.623.404.3314.173.873.7065.19841.1133.4654.1322.18111.4995.65106.0394.6276.35192.74111.48180.15175.1472.8961.9976.73238.11128.54123.5652.83946.634.9813.341.8222.8349.7531.9914.117.9320.875.139.837.074.804.064.7324.2712.8413.5986.211051.930.852.420.512.021.990.987.928.3810.860.912.461.593.844.013.723.111.080.9892.151153.470.802.261.553.825.3011.233.0512.9717.372.712.794.121.301.191.295.964.334.3894.751256.767.9212.000.135.651.983.906.261.010.891.388.281.944.114.022.9011.091.803.5879.931360.344.774.160.3816.484.3911.8320.1011.976.194.937.646.874.694.427.248.776.551.5867.331461.7111.1915.209.497.7317.4512.235.3031.8018.375.455.579.302.592.433.606.956.157.2973.011564.3211.3211.975.4426.617.3620.4112.786.3929.4649.2668.7376.6215.8711.4119.3840.0019.8116.4183.491666.941.592.790.316.962.302.852.520.441.011.347.302.011.481.091.956.101.351.2285.451767.651.140.911.282.354.335.791.941.825.996.978.6911.183.532.994.046.055.144.4263.631879.831.121.002.223.333.822.844.256.696.052.292.603.401.151.101.531.702.352.3958.771981.811.430.901.813.782.032.053.193.863.222.122.053.031.751.652.391.141.831.9938.102082.944.804.112.644.245.275.505.907.836.531.642.542.142.362.233.044.795.605.5741.572.1.8　HCA采用SPSS 22.0对18批样品进行HCA，聚类方法为组间链接，以平方欧氏距离为测度、20个共有峰峰面积为变量，见图1。结果发现当类间距离为15时，18批样品可分成3个聚类，聚类1包含了13批样品、聚类2仅含有1批样品、聚类3包含4批样品。该结果与相似度分析结果具有一定的相关性。根据HCA结果，将从每个厂家的3批样品中选择1批开展后续的增强免疫功能药效试验，选择依据为具有厂家代表性或在指纹图谱HCA中具有代表性，共选取6批样品。A和E厂家的3批产品聚类性较好，可选其中任意1批作为代表样品，故选择A1和E1；B厂家样品中B2单独聚类，可代表差异性样品，故选择其进行谱效相关研究；C、D和F厂家的3批产品均有2批样品聚类性较好，而另外1批与其他2批归属于2个聚类簇，综合考虑到HCA的3个聚类中都有适宜数量样品参与后续药效试验，因此选择C3、D2、F2作为C、D、F厂家样品代表。10.13422/j.cnki.syfjx.20211853.F001图118批贞芪扶正颗粒共有峰峰面积HCAFig. 1HCA of peak area of common peaks from 18 batches of Zhenqi Fuzheng granules2.2　增强免疫功能药效试验小鼠适应性饲养1周后随机等分为8组（n=12，每组雌雄各半），即正常组、模型组和A~F组（样品分别为A1、B2、C3、D2、E1、F2）。A~F组小鼠每天灌胃对应贞芪扶正颗粒溶液1次（根据人临床使用剂量折算为1.5 g·kg-1，用水配制，给药体积10 mL·kg-1），正常组及模型组每天灌胃等体积水1次，持续21 d。从第17天起，除正常组外，模型组及A~F组小鼠按剂量80 mg·kg-1腹腔注射环磷酰胺（用氯化钠注射液配制，给药体积10 mL·kg-1），连续4 d ［19-22］。通过检测脾脏指数、胸腺指数及血清中IL-2、TNF-α、IgG水平判断造模是否成功，这5项指标均低于正常组且差异具有统计学意义视为造模成功。第21天末次给药1 h后，称定小鼠体质量，摘除眼球取血，室温静置2 h，于转速3 000 r·min-1离心10 min（半径13 cm），收集血清，按试剂盒说明书操作测定血清IL-2、TNF-α、IgG含量。取血后处死小鼠，无菌条件下分离胸腺和脾脏，称定质量，按公式胸腺（脾脏）指数=胸腺（脾脏）质量/体质量计算相应指数，见表2。结果与正常组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数及IL-2、TNF-α、IgG水平显着降低（P0.01），表明模型复制成功。与模型组比较，B组、C组、D组、F组胸腺指数明显增加（P0.05，P0.01），B组、C组、F组脾脏指数明显增加（P0.05，P0.01），B~F组IL-2水平明显增加（P0.05，P0.01），B~D组TNF-α水平明显增加（P0.05，P0.01），A~F组IgG水平显著增加（P0.01）。表明贞芪扶正颗粒具有增强免疫功能的药效作用，且6个厂家的样品在改善免疫抑制小鼠胸腺指数、脾脏指数及血清IL-2、TNF-α、IgG水平上的药效作用存在一定差异性。10.13422/j.cnki.syfjx.20211853.T002表2贞芪扶正颗粒对小鼠免疫功能的影响（x¯±s，n=12）Table 2Effect of Zhenqi Fuzheng granules on immune function of mice （x¯±s，n=12）组别胸腺指数/mg·g-1脾脏指数/mg·g-1IL-2/ng·L-1TNF-α/ng·L-1IgG/g·L-1正常组2.49±0.503.84±0.3559.45±3.39213.28±5.5316.85±1.75模型组0.85±0.111）2.92±0.421）45.86±4.811）189.49±7.361）8.35±2.141）A组0.75±0.213.28±0.7849.84±5.21192.44±9.0710.89±1.633）B组1.19±0.143）3.78±1.212）52.34±3.953）201.95±13.882）15.17±2.323）C组1.26±0.153）4.12±0.663）50.27±4.632）228.22±9.653）15.52±2.253）D组1.04±0.222）3.06±0.5150.36±4.522）222.48±7.433）14.46±2.513）E组0.88±0.382.87±0.6250.76±3.832）195.68±12.6512.43±2.823）F组1.11±0.133）3.59±0.772）51.56±7.732）185.70±8.8512.28±2.273）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.012.3　谱效相关分析采用Spearman双变量相关分析对样品HPLC指纹图谱与其增强免疫药效的谱效相关性进行分析。将20个共有峰峰面积设置为自变量（X），胸腺指数、脾脏指数、IL-2水平、TNF-α水平、IgG水平均设置为因变量（Y），计算相关系数，见表3。结果发现1号峰与血清TNF-α、IgG水平呈明显正相关（P0.05），2号峰与胸腺指数、脾脏指数及IgG水平呈明显正相关（P0.05，P0.01），4号峰与IL-2水平呈明显正相关（P0.05），5号峰与胸腺指数呈明显正相关（P0.05），6号峰与脾脏指数呈明显正相关（P0.05），7号峰与TNF-α水平呈明显正相关（P0.05），9号峰与胸腺指数、脾脏指数呈明显正相关（P0.05），11号峰与胸腺指数、脾脏指数、IgG水平呈明显正相关（P0.05，P0.01），14号峰与脾脏指数呈显著正相关（P0.01），18号峰与胸腺指数、IgG水平呈显著正相关（P0.01），19号峰与胸腺指数、TNF-α及IgG水平呈明显正相关关系（P0.05），20号峰与脾脏指数呈显著正相关（P0.01）。综上可知，1、2、4~7、9、11、14、18~20号峰是贞芪扶正颗粒增强免疫功能的谱效相关色谱峰。10.13422/j.cnki.syfjx.20211853.T003表3贞芪扶正颗粒共有峰峰面积与药效指标的相关系数Table 3Correlation coefficients between peak area of common peaks and pharmacodynamic indexes of Zhenqi Fuzheng granules峰号胸腺指数脾脏指数IL-2TNF-αIgG10.6000.4290.0290.8291）0.8861）21.0002）0.8291）0.3710.5430.8291）30.0860.371-0.5430.2000.1434-0.029-0.2570.8861）-0.314-0.02950.8861）0.7140.6570.3140.71460.4290.8291）-0.4290.2570.25770.371-0.086-0.0290.8291）0.71480.7710.4860.0290.6570.71490.8861）0.8861）0.4290.3710.657100.4860.086-0.0290.7710.771111.0002）0.8291）0.3710.5430.8291）12-0.771-0.771-0.257-0.086-0.429130.029-0.086-0.3140.086-0.086140.6570.9432）-0.1430.3710.486150.200-0.086-0.3140.4290.25716-0.371-0.4290.1430.086-0.086170.6000.2570.0860.6000.600180.9432）0.7140.2570.7710.9432）190.8291）0.5430.0860.8291）0.8861）200.7710.9432）0.0290.1430.371注：1）P0.05，2）P0.012.4　谱效相关成分的鉴定2.4.1　色谱条件色谱条件同2.1.3项。2.4.2　质谱条件电喷雾离子源（ESI），负离子模式下喷雾电压4.5 kV，毛细管电压-35 V，透镜电压为-180 V，毛细管温度250 ℃，鞘气流速50 arb，辅助气流速3 arb，扫描范围m/z 100~1 500，MSn碎裂方式为碰撞诱导解离，碰撞能量20~25 eV。正离子模式下喷雾电压5 kV，毛细管电压35 V，透镜电压110 V，毛细管温度275 ℃，鞘气流速50 arb，辅助气流速1 arb，扫描范围m/z 100~1 500，MSn碎裂方式为碰撞诱导解离，碰撞能量20~25 eV。采用HPLC-MSn对谱效相关的12个色谱峰进行成分鉴定，推测化合物结构，并与现有文献对比［23-24］，见表4。结果确定2号峰为红景天苷、5号峰为松果菊苷、6号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、7号峰为特女贞苷异构体、9号峰为异女贞苷、11号峰为毛蕊异黄酮、14号峰为女贞苷G13或oleonuezhenide、18号峰为刺芒柄花素，其中2、6、18号峰通过与对照品比对后确认。10.13422/j.cnki.syfjx.20211853.T004表4贞芪扶正颗粒中谱效相关成分的HPLC-MSn鉴定Table 4Identification of spectrum-effect related ingredients in Zhenqi Fuzheng granules by HPLC-MSn峰号t/min相对分子质量正离子模式m/z负离子模式m/z化合物MSMSnMSMSn110.77--1）-1）389MS2 ［389］：345，MS3 ［389~345］：225、183、165、119、113未知213.29300301-1）345MS2 ［345］：299，MS3 ［345~299］：281、270、254、239红景天苷425.07-360、343MS2 ［360］：343、325、307、289、247、205，MS3 ［360~325］：307、247、229、187387MS2 ［387］：341，MS3 ［387~341］：299、281未知530.15786787-1）785MS2 ［785］：623，MS3 ［785~623］：477、461、315松果菊苷633.58446447MS2 ［447］：285，MS3 ［447~285］：270、253、229、225491MS2 ［491］：445、283，MS3 ［491~283］：268毛蕊异黄酮葡萄糖苷738.65686704、687MS2 ［704］：687、525、507、489、369，MS3 ［704~507］：489、475、457、369、351、345、337、303、225731、685MS2 ［731］：713、685、569特女贞苷异构体946.30686704、687MS2 ［704］：525、507、489、387、225731、685MS2 ［731］：685异女贞苷1153.87284285MS2 ［285］：270、253、229、225328、283MS2 ［328］：283，MS2 ［283］：268，MS3 ［283~268］：240、224、211毛蕊异黄酮1460.211 0721 090、1 073MS2 ［1 090］：875、755、713、695、693、5751 117、1 071MS2 ［1117］：1085、730oleonuezhenide或女贞苷G131878.85268269-1）313、267MS2 ［313］：267，MS2 ［267］：252，MS3 ［267~252］：223、208、132刺芒柄花素1982.12--1）-1）-1）-1）未知2083.08-301-1）345MS2 ［345］：299，MS3 ［345~299］：179、161、143、119未知注：1）信号弱；中括号内为进行碎裂的母离子m/z3 讨论在建立贞芪扶正颗粒HPLC指纹图谱的过程中，对色谱条件进行了系统优化，包括流动相体系（乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸）、洗脱梯度、色谱柱（Ultimate XB-C18色谱柱和ACE 5 C18色谱柱）、柱温（25、30、35 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、检测波长（200~400 nm）和进样量（5、10、20 μL）。根据谱峰数量、分离度及峰面积，最终选择了2.1.3项下条件。在选择参照峰时，峰6（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）和峰8（特女贞苷）均较为适合，两者分别来自黄芪和女贞子，考虑到贞芪扶正颗粒目前执行的质量标准设定了黄芪甲苷为含量测定项；此外，谱效相关性研究显示，峰6为谱效正相关色谱峰，而峰8不是，故选择峰6作为参照峰。本文在贞芪扶正颗粒HPLC指纹图谱中标定了20个共有峰，采用该图谱进行质量评价，较前期研究［7-10］更为全面。HCA结果显示，类间距离为15时，6个厂家的18批贞芪扶正颗粒被分为3个聚类，且各厂家产品中A和E厂家聚类性较好，表明批间稳定性较好，其余4个厂家的3批产品均存在1批与另外2批聚类性较差。原因可能有两方面：①现行产品质量标准未涵盖女贞子药材的定量检测项，各厂家女贞子投料质量层次不齐，从而造成厂家间甚至同一厂家产品批间差异性明显；②产品生产工艺为热水回流提取3次，每次1~3 h，各厂家提取时间及提取过程控制存在差异，使得黄芪、女贞子中成分提取率及受热转化不一致，从而导致产品质量的差异性。根据HCA结果，本文选择A1、B2、C3、D2、E1、F2共6批样品开展药效试验，其中样品A1、D2、E1、F2具有厂家代表性；而样品B2、C3不具有厂家代表性，是根据HCA结果选择的具有质量差异性的样品。采用腹腔注射环磷酰胺诱导建立小鼠免疫抑制模型，该模型是研究药物免疫增强功能的经典动物模型［25-28］，胸腺指数、脾脏指数、IL-2、TNF-α和IgG是考察免疫调节功能的常用检测指标。胸腺是机体的中枢免疫器官，是T细胞分化成熟的场所；脾脏是最大的外周免疫器官，是参与机体细胞免疫和体液免疫的T细胞、B细胞和巨噬细胞大量增生场所，免疫器官指数增加是由于器官自身细胞的生长发育和分裂增殖所致，代表机体免疫增强，反之则为机体免疫器官受到损伤，免疫能力降低［29］。IL-2和TNF-α作为常见的具有免疫调节作用的细胞因子，参与机体的细胞免疫［30］。IgG在免疫应答中激活补体，在中和病毒、抗细菌方面起着重要作用，具有重要的免疫效应［31］。本研究采用多个厂家生产的贞芪扶正颗粒作为研究样品开展谱效相关分析，同时本课题组还采用了不同比例的黄芪-女贞子药对提取物作为样品进行谱效相关研究。黄芪-女贞子药对比例设置为0.5∶0.5、0.5∶1、0.5∶1.5、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1.5∶0.5、1.5∶1、1.5∶1.5、1∶0和0∶1，经过HPLC指纹图谱分析确定了13个共有峰（色谱条件与本研究存在差异），而后进行免疫增强药效试验及谱效相关性分析，结果发现所有色谱峰均被确定为谱效相关色谱峰。笔者认为这可能是由于采用不同比例黄芪-女贞子药对作为研究样品，在投料药材质量和制备工艺一致的前提下，即便提取过程中因投料比例导致共有峰成分溶出存在差异，但共有峰峰面积存在关联，从而导致部分色谱峰筛选结果假阳性。故本研究选择市售贞芪扶正颗粒产品为研究样品，不同厂家产品存在原料质量差异，生产工艺也可能存在一些区别［32］，更适合进行谱效学研究。通过谱效相关性分析筛选出贞芪扶正颗粒的12个药效物质成分，其中红景天苷、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花素5个成分有免疫增强功能的研究报道［33-37］，这在一定程度上佐证了本文研究结果。综上分析，本研究初步阐明了贞芪扶正颗粒具有免疫增强功能的药效物质成分，并发现市场上其产品质量及药效存在明显差异，建议该制剂应建立针对药效物质成分的多指标控制的质量标准体系，以改善产品质量稳定性和药效一致性。