随着人口老龄化及环境、遗传因素的影响，结直肠癌（CRC）每年死亡人数多达90万，已成为全球第四大致命癌症［1-2］。我国CRC的发病率及死亡率逐年增加，统计显示2018年我国CRC发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别排名第三和第五位［3］。CRC是一种具有发病隐匿，误诊率高，高复发，高转移特征的恶性肿瘤，约25%的患者在明确诊断时已经发生转移，50%的CRC患者在治疗干预后仍发生转移［4］，严重危害人类健康。CRC的治疗以手术及放、化疗为主，随着医学技术发展，其诊断与治疗取得了长足的进步，不断涌现出新的治疗方法如靶向治疗和免疫治疗等。因CRC早期症状隐匿，多数患者确诊时已至肿瘤晚期，虽经治疗仍有高复发、高转移以及较低的5年生存率，美国数据显示，转移性CRC患者的5年生存率仅有14%［5］；同时，其高昂的治疗费用与不良反应客观存在。因此，迫切需要更多可以改善患者临床效果和预后的治疗方案。近年来，中医药防治结直肠癌成为研究热点，其具有提高抗癌活性并减少化疗药物的不良反应，如神经损伤、恶心呕吐、腹泻延迟发作、口腔黏膜炎等，研究表明中草药及其化合物能够通过调控多靶点发挥抑制结直肠癌细胞增殖作用，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt），核转录因子（NF）-κB，有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路相关蛋白，抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关xL蛋白（Bcl-xl）和细胞周期相关蛋白等［6-8］，有望成为一种可行的新型替代疗法。癌毒病机理论是国医大师周仲瑛教授对肿瘤疾病创新性的总结，提出“癌毒”作为致病因素的同时，也是一种病理产物，在肿瘤发生发展全程中发挥关键作用［9］。癌毒的产生与机体正虚有关，其与痰、瘀、湿等病邪互结于肠，久病不愈则逐步发展为CRC。本团队以国医大师周仲瑛教授提出的癌毒病机为理论基础，拟定防治CRC的中药复方——参白解毒方。本研究旨在探明参白解毒方抑制HCT116细胞增殖的药效与机制，为参白解毒方的临床应用提供分子生物学基础。1 材料1.1　细胞株HCT116细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，编号TCHu99，本研究采用传10代以内的细胞进行实验。1.2　药物与试剂参白解毒方由苦参、党参、白花蛇舌草、白术等中药材组成，药材均购自江苏亚邦中药饮片有限公司，经南京中医药大学邹立思教授鉴定为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》标准。药材浸泡后用10倍水煎煮1次，用8倍水再次煎煮，共2次，每次煎煮2 h，通过减压浓缩成含生药1.2 g·mL-1，用无水乙醇醇沉后抽滤，旋去乙醇，抽滤浓缩至2 g·mL-1，置于-80 ℃冰箱保存，实验时将浓缩液解冻并离心，取上清用0.22 μm滤膜过滤除菌，加入完全培养基稀释成所需浓度，调整pH 7.2~7.4备用。细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号20200520），细胞周期试剂盒（美国赛默飞世尔公司，批号1999470），JC-1线粒体膜电位荧光探针（碧云天生物技术有限公司，批号c2005），胎牛血清（美国Gibco公司，批号10099-141C），RPMI 1640培养基（上海源培生物科技有限公司，批号D120705），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司，批号MKCK3153），细胞分裂液（Biosharp公司，批号3227440），Bcl-2、Bcl-xl、周期蛋白A2（CyclinA2）、周期蛋白D1（CyclinD1）、周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）抗体（美国Abcam公司，批号分别为GR44442-1、GR258730-2、GR11520-18、GR192733-10、GR304868-3、GR97082-7），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、NF-κB p65抗体、磷酸化（p）-NF-κB p65抗体、NF-κB信号通路相关蛋白IκB激酶α（IKKα）抗体、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）抗体、鼠抗免疫球蛋白（Ig）G、兔抗IgG（美国CST公司，批号分别为5174、8242T、3033P、11930T、4814、7076s、7074s）。1.3　仪器HERAcell 150i型二氧化碳培养箱（美国赛默飞世尔公司），FA1610型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），SL16R型离心机（美国赛默飞世尔公司），Micro CL21R型离心机（美国赛默飞世尔公司），Ti型荧光倒置显微镜（日本Nikon公司），SPARK 10M型酶标仪（Tecan公司），CytoFlex型流式细胞仪（美国Beckman公司）PowerPacTMBasic型电泳仪及电泳槽（美国Bio-Rad公司），Tanon-5500型化学发光凝胶成像仪器（Tanon公司）。2 方法2.1　细胞培养HCT116细胞培养于含有10%FBS，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1链霉素的RPMI 1640培养基中，培养环境为37 ℃，100%湿度，5% CO2的细胞培养箱，取对数生长期的HCT116细胞进行以下实验。2.2　MTT比色法测定参白解毒方对HCT116细胞活力取对数生长期HCT116细胞，收集细胞并计数，将细胞以1×105个接种于96孔板中。置于5% CO2孵化箱中培养24 h，每孔加入不同浓度的参白解毒方（分别为0.25、0.5、1、2、4 g·L-1）100 μL，孵育48 h；取出96孔板，每孔加入MTT 20 μL继续孵育4 h，弃上清，加入DMSO 200 μL，振摇10 min使晶体完全溶解，酶标仪在490 nm处检测吸光度A，计算半抑制浓度（IC50）。2.3　观察HCT116细胞形态取对数生长期HCT116细胞，用PBS仔细冲洗细胞，加入胰酶细胞消化液置于37 ℃培养箱消化，待消化完成后收集细胞，HCT116细胞分为4组：空白组，参白解毒方组（4、2、1 g·L-1）；按组别加入相应浓度的参白解毒方，在5% CO2培养箱中培养48 h，倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。2.4　检测HCT116细胞克隆形成对数生长期的HCT116细胞用胰酶细胞消化液消化、重悬并计数。然后每孔接种500个细胞于6孔板中，分组给药同2.3项，继续培养14 d。形成克隆后终止培养，甲醇固定20 min，用吉姆萨染液染细胞干燥后拍照，镜下计数，以50个细胞计为一个克隆，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。2.5　JC-1探针检测HCT116细胞线粒体膜电位（Δψm）HCT116细胞按2.3项分组给予相应浓度的参白解毒方后继续培养48 h，取适量JC-1试剂（5 mg·L-1）用超纯水稀释后混匀，按照1∶4体积比加入JC-1染色缓冲液，再次混匀，配制成终质量浓度为10 mg·L-1的工作液。去各组细胞培养液，PBS清洗1次，每孔加入体积相等的细胞培养液及JC-1染色工作液，置37 ℃培养箱中避光孵育20 min，去上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，每孔加入适量无血清培养基，在倒置荧光显微镜下进行拍照操作。2.6　流式细胞术检测对HCT116细胞周期取对数生长期的HCT116细胞，以3×105个，每孔2 mL，接种于6孔板继续培养，当密度合适时，分组给药同2.3项，给药后继续培养48 h，用胰酶细胞消化液消化细胞，收集细胞，去上清，PBS洗涤2次，预冷PBS重悬细胞，缓慢滴入70%冰乙醇溶液，边滴边晃动，置于4 ℃冰箱过夜；再以2 000 r·min-1，2 min离心（离心半径16.5 cm）去除乙醇，PBS清洗2次，加入FxCycleTMPI / RNase溶液50 mL，避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。2.7　流式细胞术检测参白解毒方对HCT116细胞凋亡的影响细胞培养同2.6项，分组及给药同2.3项，培养48 h后取HCT116细胞，离心收集细胞，用预冷的PBS小心清洗2次；各样品细胞数应高于1×106个；再用1×Binding buffer 500 μL重悬细胞；加入Annexin V-FITC 5 μL及PI 5 μL染色，轻轻混匀放置避光环境，室温孵育15 min；用流式细胞仪检测，观察细胞凋亡情况并计算凋亡率。2.8　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测相关蛋白表达取对数生长期的HCT116细胞，按2.3分组给药后继续培养48 h；收集细胞后加入RIPA蛋白裂冰上裂解提取各组细胞蛋白，裂解完成后用4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径8.5 cm），去沉淀；用BCA法检测各组细胞蛋白浓度，将各组蛋白配置成相同浓度，加Loading buffer，金属浴锅中95 ℃，10 min使蛋白变性，将各组蛋白样品加入SDS-PAGE胶泳道，电泳分离，再将蛋白湿法转移至甲醇处理后的PVDF膜，5%的脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加相应一抗CyclinA2、CyclinD1、CDK1（1∶1万），Bcl-2、Bcl-xl、CDK4、GAPDH、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKKα、IκBα（1∶1 000），继续4 ℃孵育过夜，用PBST洗涤3次，每次10 min，温室条件下二抗（1∶5 000）孵育2 h，PBST洗涤3次，每次10 min，加显影液曝光，结果使用Image J分析。2.9　统计学分析采用SPSS 23.0软件统计实验数据，数据用x¯±s表示，采用方差分析和t检验比较组间差异，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　参白解毒方对HCT116细胞活力的影响HCT116细胞在参白解毒方干预48 h后呈现不同程度的增殖抑制，细胞生长抑制率随着药物浓度增加和给药时间延长而逐渐上升，在2 g·L-1参白解毒方干预48 h，计算IC50为（1.88±0.23）g·L-1。因此，下面实验选择1、2、4 g·L-1质量浓度的参白解毒方进行下一步实验，给药时间为48 h。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T001表1参白解毒方对HCT116细胞活力的影响 （x¯±s，n=5）Table 1Effect of SBJDF on vitality of HCT-116 cells （x¯±s，n=5）组别时间/h质量浓度/g·L-1抑制率/%空白组24-参白解毒方组0.254.88±1.280.511.30±2.21124.37±4.38238.61±5.64457.69±5.16空白组48-参白解毒方组0.257.67±2.020.518.99±3.88133.27±3.59250.17±5.29471.61±3.283.2　参白解毒方对HCT116细胞形态的影响倒置显微镜观察不同浓度的参白解毒方给药后HCT116细胞的形态变化，与空白组比较，随着参白解毒方药物浓度的增加，HCT116细胞出现排列不紧，胞膜皱缩，形状欠规则，部分细胞脱落，细胞数量逐渐减少。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F001图1参白解毒方对HCT116细胞形态的影响（倒置显微镜，×200）Fig.1Morphological changes after SBJDF treatment of HCT116 for 24 h （inverted microscope，×200）注：A.空白组；B~ D.参白解毒方组（4、2、1 g·L-1）（图2-图6同）3.3　参白解毒方对克隆形成的影响通过克隆形成实验能够观察细胞的增殖能力，与空白组比较，HCT116细胞克隆形成能力随着参白解毒方浓度的增加而降低（P0.05，P0.01）；提示参白解毒方能有效抑制HCT116细胞增殖。见图2、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F002图2参白解毒方对HCT116细胞克隆形成能力的影响Fig.2Effect of SBJDF on cloning ability of HCT116 cells10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T002表2参白解毒方对HCT116细胞克隆形成的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of SBJDF on cloning ability of HCT116 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1克隆形成数/个克隆形成率/%空白组282.0±35.556.4±7.1参白解毒方组425.0±12.55.0±2.52）265.7±17.213.1±3.42）1215.7±19.143.1±3.81）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01（表2-表7同）3.4　参白解毒方对HCT116细胞周期的影响随着参白解毒方浓度增加，HCT116细胞中G1期细胞升高，具有浓度依赖性；与空白组比较，参白解毒方组（4、2 g·L-1）的G1期细胞数量增加（P0.05，P0.01），提示参白解毒方能够诱导HCT116细胞发生G0/G1期阻滞。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T003表3参白解毒方对HCT116细胞周期分布的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of SBJDF on cell cycle distribution of HCT116 （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1细胞周期分布率/%G0/G1G2/MS空白组40.86±1.7720.97±2.9038.17±4.59参白解毒方组455.42±2.462）16.15±1.6928.43±3.861）251.26±4.391）19.32±2.1029.42±6.49144.48±2.7819.42±3.0436.11±5.81与空白组比较，参白解毒方组（4、2 g·L-1）细胞周期蛋白CyclinD1，CyclinA2，CDK1，CDK4明显下调（P0.05，P0.01）。表明参白解毒方能够通过影响细胞周期分布来抑制肿瘤细胞增殖。见图3、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F003图3参白解毒方作用后HCT116细胞周期蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of SBJDF on cell cycle-related proteins in HCT116 cells10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T004表4参白解毒方对HCT116细胞周期相关蛋白水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of SBJDF on expression of cell cycle-related proteins in HCT116 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1CyclinD1/GAPDHCyclinA2/GAPDHCDK1/GAPDHCDK4/GAPDH空白组1.10±0.130.99±0.081.06±0.071.01±0.16参白解毒方组40.53±0.082）0.59±0.092）0.72±0.072）0.31±0.072）20.77±0.121）0.76±0.091）0.92±0.130.48±0.112）10.85±0.071）0.91±0.101.00±0.110.87±0.243.5　参白解毒方对HCT116细胞凋亡的影响Annexin-V可以检测细胞凋亡的早期阶段，其与碘化丙啶（PI）双染色可以区分凋亡细胞与坏死细胞。与空白组比较，参白解毒方组（4、2 g·L-1）细胞凋亡率明显增加（P0.05，P0.01），表明参白解毒方可以诱导HCT116细胞发生凋亡。Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白，通过稳定线粒体外膜透化（MOMP）来抑制细胞凋亡。与空白组比较，参白解毒方组（4、2 g·L-1）能够明显下调HCT116细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达（P0.05，P0.01），表明参白解毒方可能通过下调抗凋亡蛋白的表达来影响MOMP，诱导HCT116细胞凋亡。见图4、表5和表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F004图4参白解毒方作用后HCT116细胞凋亡蛋白电泳Fig.4Electrophoresis of SBJDF on expression of apoptosis-related proteins in HCT116 cells10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T005表5参白解毒方对HCT116细胞凋亡的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of SBJDF on HCT116 cell apoptosis （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1细胞凋亡率/%空白组13.95±3.91参白解毒方组459.60±5.922）226.77±3.761）118.43±2.9710.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T006表6参白解毒方对HCT116细胞凋亡相关蛋白相对表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of SBJDF on expression of apoptosis-related proteins in HCT116 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1Bcl-2/GAPDHBcl-xl/GAPDH空白组1.17±0.111.27±0.06参白解毒方组40.88±0.121）0.83±0.082）20.93±0.101）0.87±0.102）10.99±0.151.03±0.113.6　参白解毒方对HCT116细胞线粒体膜电位的影响JC-1是一种用于检测线粒体膜电位（Δψm）的荧光探针，细胞凋亡早期的Δψm降低，此时JC-1染色呈绿色荧光，而当Δψm较高时，则产生红色荧光［10］。与空白组比较，随着参白解毒方浓度的增加，红色荧光逐渐转变为绿色荧光，提示参白解毒方可能通过影响细胞线粒体膜电位导致HCT116细胞凋亡。见图5。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F005图5参白解毒方对HCT116线粒体膜电位的影响（JC-1，×40）Fig. 5Effect of SBJDF on HCT116 mitochondrial membrane potential（JC-1，×40）3.7　参白解毒方对HCT116细胞NF-κB信号通路的影响与空白组比较，参白解毒方（4、2 g·L-1）明显下调NF-κB信号通路相关蛋白IKKα，IκBα的表达，差异有统计学意义（P0.05，P0.01），参白解毒方（4、2、1 g·L-1）显著下调HCT116细胞的p-p65蛋白表达，差异有统计学意义（P0.01），明显下调p65、p-p65/p65表达，差异有统计学意义（P0.05），并呈浓度依赖性，提示参白解毒方能够抑制NF-κB信号通路的激活。见图6、表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.F006图6参白解毒方作用后NF-κB信号通路蛋白电泳Fig.6Electrophoresis of SBJDF on expression of NF-κB pathway-related proteins in HCT116 cells10.13422/j.cnki.syfjx.20220423.T007表7参白解毒方对NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 7Effect of SBJDF on expression of NF-κB pathway-related proteins in HCT116 cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1IKKα/GAPDHIκBα/GAPDHp-p65/GAPDHp65/GAPDHp-p65/p65空白组0.65±0.091.03±0.080.96±0.081.04±0.110.93±0.05参白解毒方组40.40±0.111）0.47±0.082）0.37±0.062）0.88±0.131）0.43±0.091）20.57±0.071）0.84±0.101）0.48±0.082）0.93±0.121）0.52±0.061）10.63±0.040.93±0.090.60±0.092）0.84±0.111）0.72±0.041）4 讨论癌毒病机理论是国医大师周仲瑛教授在长期临床辨治肿瘤基础上提出的，为中医防治肿瘤开创了新思路。癌毒在机体正虚的基础上，由多种外在因素诱发。其具体致病机制与癌毒的留结、自养、流注有关，贯穿肿瘤发生、生长、转移的病理过程。此外，当癌毒与湿、痰、瘀等诸邪气互结时，则演变为湿毒、痰毒、瘀毒等复合病机［11］，故治疗关键在于消癌解毒，辅以扶正祛邪。本团队在传承周仲瑛教授的学术思想和经验基础上，研制出防治结直肠癌的中药复方参白解毒方。方以苦参、白花蛇舌草、党参、炒白术等中药组成，其中苦参、白花蛇舌草为君药，具有抗癌解毒、清热利湿之功；辅以党参、炒白术等，发挥益气健脾，匡扶正气之效。细胞周期是细胞增殖的重要过程，细胞周期蛋白（Cyclins）与CDKs是调节细胞周期进程的关键，Cyclins的过表达导致CDK活性失调，促使细胞快速生长，绕过关键细胞检查点并最终导致肿瘤细胞生长，例如，细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4是细胞周期从G1期到S期的关键蛋白［12-13］。因此，靶向这些蛋白已成为治疗肿瘤的新方法。通过实验发现参白解毒方可显著抑制HCT116细胞的细胞周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的蛋白表达，同时抑制CyclinA2，CDK1的蛋白表达，诱导细胞发生G0/G1期阻滞。Bcl-2蛋白家族分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，主要通过调节MOMP控制细胞凋亡，其作用机制是通过调节细胞Δψm，维持线粒体膜完整性，影响细胞色素C（CytC）等促凋亡因子的释放从而调控细胞凋亡［14-15］。研究表明线粒体膜电位（Δψm）的下降可增加线粒体膜的通透性，释放促凋亡因子进入胞质，进而激活胱天蛋白酶级联反应，即线粒体凋亡途径。实验结果显示，参白解毒方可诱导HCT116细胞凋亡，降低Bcl-2和Bcl-xl的表达，并降低HCT116细胞Δψm。表明参白解毒方可能通过介导线粒体凋亡相关途径，发挥抑制HCT116细胞增殖的作用。NF-κB信号通路在人类肿瘤发病中扮演重要角色，可在多种炎症因子或者各种理化因素刺激下激活，NF-κB信号通路的激活有两种模式，区别在于经典途径中IKK复合物被激活后将IκB蛋白降解从而使NF-κB二聚体入核参与基因转录；非经典途径则通过非IκB蛋白降解方式调节转录［16-17］。NF-κB信号激活后介导多种细胞活性如炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡等，如调控Bcl-xl、Bcl-2、survivin、凋亡抑制蛋白（cIAPs）发挥抗凋亡作用［18］，调控CyclinD1、CDK4等周期蛋白影响细胞周期［19-20］。Western blot结果显示参白解毒方通过下调HCT116细胞的IKKα、IκBα蛋白表达，降低细胞中p-p65/p65。综上所述，参白解毒方能够有效抑制HCT116细胞增殖，下调HCT116细胞周期相关蛋白的表达，引起细胞发生G0/G1期阻滞；降低HCT116细胞Δψm，下调细胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表达，介导线粒体凋亡相关途径诱导细胞凋亡。为进一步揭示其作用机制，通过实验发现参白解毒方下调HCT116细胞的IKKα、IκBα以及磷酸化p65的表达。因此，参白解毒方可能通过抑制NF-κB信号通路的激活，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，但参白解毒方治疗结直肠癌更深入的作用机制尚不清楚，还需进一步探究。