抑郁症是一种多维度、高度异质性情绪障碍疾病，严重危害患者身心健康，降低生活质量，增加社会负担［1］。在全球新冠肺炎疫情大流行下，由于“新冠期间行为的限制和心理负担”更易诱发机体处于焦虑、恐惧、忧虑过度等负面精神状态，导致抑郁发作。因此，抑郁症有效防治工作已成为社会和医学界广为关注、亟需解决的问题。抑郁症病因复杂、发病机制存在多种假说，单胺类递质分泌降低、下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱、突触可塑性降低、大脑皮层和边缘系统的结构功能环路异常等［2］，据此研发的各类抗抑郁药物仅使部分患者受益，且存在临床症状改善缓慢、易复发及副作用多等缺陷。近几年，国内外学者从“中医整体观”的视角重新审视抑郁症，聚焦“全身机体微生态菌群失调、神经内分泌网络失衡、神经环路异常、脑-肠对话”等多系统交互作用在脑部的特征性表现探究抑郁症发作机制及新型抗抑郁药物研发。传统中医虽无抑郁症之名，但古籍文献可见与其相近描述，如《金匮要略》中所记载百合病，“百合病者，百脉一宗，悉致其病也。意欲食，复不能食，常默然，欲卧不能卧，欲行不能行；饮食或有美时，或有不用闻食臭时；如寒无寒，如热无热；口苦，小便赤；诸药不能治，得药则剧吐利。如有神灵者，而身形如和，其脉微微”，症状表现与抑郁症临床症状相似［3］。治当清心润肺、滋阴安神，方用百合地黄汤。现代临床实践及基础研究证实百合地黄汤治疗抑郁症［4-5］、失眠障碍［6］、焦虑症［7-8］、创伤后应激障碍［9-10］效果显著。近期笔者探究百合地黄汤多组分抗抑郁药理机制发现，毛蕊花糖苷不仅可作为质量标记物，也可作为其有效成分［11-12］。众多研究表明毛蕊花糖苷具有抗肿瘤［13-14］、抗炎［15-16］、神经保护［17-18］、皮肤保护［19-20］、抗病原微生物［21-22］等多种药理作用。然而，基于“脑-肠交互对话”、整体观的毛蕊花糖苷抗抑郁药理机制尚未阐明。因此本实验主要通过慢性不可预知温和应激法（CUMS）结合孤养的方式建立抑郁症小鼠模型，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠血清中神经递质及炎性因子表达水平，分别通过伏隔核、结肠mRNA高通量测序（RNA-Seq）筛选差异基因并分析主要通路，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测组织主要差异表达基因。旨在探讨毛蕊花糖苷抗抑郁作用的关键基因及信号通路，以期为临床应用奠定坚实的理论基础。1 材料1.1　动物SPF级C57BL/6小鼠40只，雄性，5周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2021-0006，此动物实验由山东中医药大学动物伦理委员会批准（伦理审查编号SDUTCM20210301018）。小鼠自由进食及饮水，适应性饲养1周。1.2　试剂毛蕊花糖苷购自南京景竹生物科技有限公司（HPLC98%，批号Z100401）；Real-time PCR试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号043021211213），盐酸氟西汀分散片（礼来苏州制药有限公司，国药准字J20160029），TRIzol（美国Ambion公司，批号262306），小鼠γ氨基丁酸（美国GABA公司，批号JM-02725M1），5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10 ELISA试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号分别为JM-02459M1、JM-0206M1、JM-02323M1、JM-02446M1、JM-02459M1）。1.3　仪器63008型旷场、63010型高架十字迷宫、63022型强迫游泳、DB001型Morris水迷宫、SMART 3.0型动物行为学视频分析系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），5427R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），788BR07377型PCR（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　动物分组适应性饲养1周后，随机将小鼠分为空白组、模型组、氟西汀组、毛蕊花糖苷组，每组10只。2.2　抑郁症模型建立采用CUMS结合孤养方式构建小鼠抑郁模型［23］。具体刺激包括禁食禁水（24 h）、空瓶刺激（12 h）、脏笼（8 h）、空间束缚（3 h）、倾斜笼（12 h）、湿笼（12 h）、强迫运动（3 h）。每天随机安排2种刺激，保证相邻2 d刺激不重复，造模时间持续4周。2.3　给药方法造模1周后给予灌胃。按照人与小鼠体表面积换算药物等效剂量，其中氟西汀组以20 mg·kg-1灌胃，毛蕊花糖苷组给60 mg·kg-1灌胃，给药剂量参考文献［24-25］。空白组及模型组给予等体积的生理盐水灌胃，每天1次，灌胃与造模同时持续3周，结束后进行行为学检测。2.4　行为学评价2.4.1　糖水偏好实验给予每笼小鼠1瓶1%蔗糖水和1瓶普通水，适应24 h，中间12 h将2瓶水位置调换。结束后第2天小鼠禁水但不禁食4 h后，将1瓶1%蔗糖水和1瓶普通水称重后放置，3 h将位置调换，小鼠自由饮水6 h后，将2个水瓶称质量。统计糖水摄入量，糖水偏好度=糖水摄入量/（普通水摄入量+糖水摄入量）×100%。2.4.2　强迫游泳将小鼠轻放入塑料桶中，桶内装有23~24 ℃温水，小鼠适应30 s后，记录小鼠4 min的挣扎情况。测试结束后将小鼠擦干并给予保温措施。对小鼠4 min挣扎、漂浮、不动时间进行统计。2.4.3　旷场实验小鼠在旷场箱中自由活动30 s后，记录4 min内小鼠在旷场箱内活动总距离以及中间停留时间。每只小鼠实验结束后，清除粪便并用75%乙醇擦拭旷场箱，避免遗留气味干扰后续实验。2.4.4　十字高架迷宫将小鼠头朝闭臂放入高架十字迷宫中心，小鼠自由活动30 s后，记录4 min内小鼠进入开臂的探索时间。每只小鼠实验结束后，用75%乙醇擦拭实验区域。2.4.5　水迷宫将圆形水池中注入22~23 ℃温水，用安全无毒燃料染为白色。水迷宫分为东西南北4个象限。在西侧象限距离水池壁25 cm处放置1个直径10 cm的平台，没入水下2 cm。分别将小鼠从不同象限放入水中，记录小鼠找到平台时间，若60 s内未找到平台，则将小鼠引导至平台10，持续4 d时间。第5天进行认知功能测定，撤去平台，将小鼠从任一象限放入水中，停留60 s，记录小鼠经过平台位置的时间。2.5　ELISA检测小鼠血清神经递质及炎性因子的表达取小鼠眼眶血，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，离心半径10 cm，获得血清。采用ELISA试剂盒检测血清中GABA、5-HT、DA、IL-6、TNF-α、IL-1β含量，具体实验步骤严格试剂盒说明书操作。2.6　小鼠伏隔核、结肠mRNA高通量测序及差异基因的筛选小鼠麻醉后处死，断头取伏隔核及结肠，采集样本置于液氮速冻备用，后取单个样本50 mg，TRIzol 法提取总RNA。提取总RNA分为两部分，一部分用于mRNA高通量测序，由深圳华大基因科技服务有限公司提供。筛选出总RNA量10 μg、质量浓度200 mg·L、RIN≥8、28S/18S≥1.5的样品用于构建转录组。2.7　mRNA 生物信息学分析对测序得到的序列数据raw reads进行质控（QC），后经过滤后得到干净片段（clean data）。对模型组与空白组比较、毛蕊花糖苷组与模型组比较，进行差异基因的筛选，标准为FPKM0、Flod change≥1.5、P0.05为差异表达基因，并对差异基因进行KEGG通路富集分析。2.8　Real-time PCR检测小鼠伏隔核组织中主要差异基因mRNA表达将2.6项下提取得到的伏隔核RNA用于Real-time PCR检测。Real-time PCR反应条件为50 ℃反转录20 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环。β-肌动蛋白（actin）作为内参，目的基因相对表达量以2-ΔΔCt表示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220618.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列长度/bpGad1上游5'-GGGCTATGTTCCCCTTTATGT-3'184下游5'-CCTTTCTATGCCGCTGAGT-3'VGAT上游5'-TGGTCATCGCTTACTGTCTC-3'157下游5'-TGCTGCATGTTGCCTTCG-3'BDNF上游5'-TTATTTCATACTTCGGTTGC-3'166下游5'-ATGGGATTACACTTGGTCTC-3'2.7　统计学分析采用SPSS 22.0进行分析，实验数据采用x¯±s表示，各组间比较采用随机单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05有统计学意义。3 结果3.1　毛蕊花糖苷对CUMS诱导小鼠行为学改变3.1.1　毛蕊花糖苷改善CUMS诱导小鼠抑郁样行为与空白组比较，模型组小鼠糖水摄入量明显降低，强迫游泳实验中不动时间显著增多（P0.01），小鼠快感缺失明显及行为绝望增加，模型组有明显的抑郁样特征；毛蕊花糖苷干预后，与模型组比较，糖水摄入量明显恢复，强迫游泳实验中不动时间显著缩短（P0.01），表明其快感及行为绝望恢复，提示毛蕊花糖苷可明显改善CUMS诱导小鼠抑郁样行为。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220618.T002表2毛蕊花糖苷对抑郁样小鼠行为学影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of verbascoside on behavior of depression-like mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1糖水/%强迫游泳/s旷场/%高架/%水迷宫/s空白组76.68±1.2027.62±6.7911.04±0.7510.08±0.873.30±1.17模型组56.12±2.231）63.84±5.671）3.86±0.741）2.75±0.371）0.70±0.161）氟西汀组2067.35±2.932）32.72±5.932）7.05±0.662）5.35±0.692）2.02±0.472）毛蕊花糖苷组6067.26±1.742）30.19±5.122）8.32±0.602）4.24±0.482）1.97±0.772）注：与空白组比较1）P0.01，与模型组比较2）P0.013.1.2　毛蕊花糖苷改善CUMS诱导小鼠焦虑样行为与空白组比较，旷场实验及高架十字迷宫实验中，小鼠在中心区域及开放臂中的探索时间显著减少（P0.01），表明小鼠焦虑样行为明显；毛蕊花糖苷干预后，小鼠在中心区域及开放臂中的探索时间显著提高（P0.01），表明毛蕊花糖苷可明显改善小鼠焦虑样行为。见表2。3.1.3　毛蕊花糖苷改善CUMS诱导小鼠学习记忆能力水迷宫实验结果表明，前4天获得性训练结束后，记录第5天认知功能，撤去平台后，空白组小鼠反复穿过平台次数较多，模型组小鼠与空白组比较，无目的运动较多，穿越平台位置次数明显减少（P0.01）。而毛蕊花糖苷干预后，与模型组相比，穿越平台次数显著增加（P0.01），毛蕊花糖苷可明显改善小鼠学习记忆能力。见表2。3.2　毛蕊花糖苷对CUMS诱导抑郁样小鼠血清神经递质及炎性因子的影响［26］与空白组比较，模型组小鼠血清中5-HT、GABA、DA含量明显降低（P0.05）；IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显上升（P0.05）。与模型组相比，毛蕊花糖苷组小鼠血清中5-HT、GABA、DA含量明显提高（P0.05）；IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显降低（P0.05）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220618.T003表3毛蕊花糖苷对抑郁样小鼠血清神经递质及炎性因子的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effects of verbascoside on serum neurotransmitters and inflammatory factors in depressed mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-15-HT/μg·L-1GABA/μg·L-1DA/μg·L-1IL-1β/ng·L-1IL-6/ng·L-1TNF-α/ng·L-1空白组461.81±35.4310.12±0.6448.63±5.1499.62±4.7018.99±1.53893.69±27.24模型组403.96±24.781）9.33±0.561）38.72±0.801）109.63±5.021）22.41±2.391）937.87±33.441）毛蕊花糖苷组60455.78±39.552）9.98±0.332）46.74±4.292）102.66±2.452）18.11±2.932）878.48±42.762）注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.053.3　毛蕊花糖苷干预后伏隔核、结肠差异基因表达以及信号通路分析伏隔核共得到48个差异基因，其中谷氨酸脱羧酶1（Gad1）、降钙素相关多肽β（Calcb）、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1b2（Slco1b2）等mRNA在毛蕊花糖苷组中上调，水通道蛋白1（Aqp1）、睫状神经营养因子（Cntf）、神经肽Y受体Y2（Npy2r）等mRNA在毛蕊花糖苷组中下调，见增强出版附加材料。结肠共得到43个差异基因，其中Gad1、溶质载体家族32成员1（Slc32a1，又名VGAT）、再生胰岛衍生的3γ（Reg3g）等在毛蕊花糖苷组中上调，神经元五聚蛋白染色体结构域（Npcd）、转甲状腺素蛋白（Ttr）、G蛋白信号调节器8（Rgs8）等在毛蕊花糖苷组中下调。其中伏隔核差异基因主要富集在神经活性配体/受体相互作用、GABA能突触、cAMP信号通路等通路；结肠差异基因主要富集在神经活性配体/受体相互作用、GABA能突触、突触小泡循环等信号通路。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220618.T004表4差异基因主要富集通路Table 4Main KEGG pathway of differential genes通路ID通路名称基因数/个富集基因Pvalue组织04080神经活性配体/受体相互作用14胆碱能受体烟碱β多肽3（Chrnb3）↑、胆碱能受体烟碱β多肽5（Chrna5）↑、肾上腺素受体α1d（Adra1d）↑、Calcb↑、促肾上腺皮质激素释放激素（Crh）↓、γ氨基丁酸A受体ε亚基（Gabre）↓、生长激素释放激素（Ghrh）↓、5-HT受体1B（Htr1b）↓、Npy2r↓、催乳素受体（Prlr）↓、促甲状腺素释放激素（Trh）↓、血管活性肠肽受体2（Vipr2）↓、伪君子受体2（Hcrtr2）↓、γ-氨基丁酸A受体θ亚基（Gabrq）↓7.93×10-12伏隔核04727GABA能突触4Gabre↓、Gad1↑、Slc32a1↑、Gabrq↓3.14×10-4伏隔核04024cAMP信号通路3脑源性神经营养因子（BDNF）↓、Htr1b↓、Vipr2↓4.67×10-2伏隔核04630JAK/STAT信号通路3Cntf↓ Prlr↓、白细胞介素-27受体α（Il27ra）↑2.39×10-2伏隔核05032吗啡成瘾3Gabre↓、Slc32a1↑、Gabrq↓4.76×10-3伏隔核04721突触小泡循环2溶质载体家族17成员6（Slc17a6）↓、Slc32a1（VGAT）↑3.32×10-2伏隔核04917催乳素信号通路2雌激素受体2（Esr2）↓、Prlr↓3.00×10-2伏隔核04924肾素分泌2水通道蛋白1（Aqp1）↓、氯化物通道附件3a1（Clca3a1）↓3.32×10-2伏隔核04976胆汁分泌2Aqp1↓、Slco1b2↑3.00×10-2伏隔核00430牛磺酸和亚牛磺酸代谢1Gad1↑4.08×10-2伏隔核04080Neuroactive ligand-receptor interaction6Gabre↓、谷氨酸受体离子型NMDA2B（Grin2b）↓、Htr1b↓、5-HT受体4（Htr4）↓、胰多肽（Ppy）↓、瞬时受体电位阳离子通道亚科V成员1（Trpv1）↓4.35×10-4结肠04727GABAergic synapse5Gabre↓、溶质载体家族6成员12（Slc6a12）↓、Gad1↑、Slc32a1（VGAT）↑、Slc6a11↑4.89×10-6结肠04721Synaptic vesicle cycle4Slc6a12↓、溶质载体家族1成员2（Slc1a2）↑、Slc32a1（VGAT）↑、溶质载体家族6成员11（Slc6a11）↑6.58×10-5结肠04024cAMP signaling pathway4BDNF↓、Grin2b↓、Htr1b↓、Htr4↓3.37×10-3结肠05033尼古丁成瘾3Gabre↓、Grin2b↓、Slc32a1（VGAT）↑2.09×10-4结肠05014肌萎缩侧索硬化症3Grin2b↓、Slc1a2↑、Tnf↑4.32×10-4结肠04930Ⅱ型糖尿病2ATP结合盒亚家族C成员8（Abcc8）↑、Tnf↑8.69×10-3结肠05030可卡因成瘾2BDNF、Grin2b↓8.69×10-3结肠05144疟疾2血小板反应蛋白4（Thbs4）↓、Tnf↑1.17×10-2结肠04940Ⅰ型糖尿病2Gad1↑、Tnf↑1.69×10-2结肠注：↑表示差异基因在毛蕊花糖苷组中表示上调；↓表示差异基因在毛蕊花糖苷组中表示下调3.4　伏隔核与结肠共同差异基因分析将伏隔核48个差异基因与结肠43个差异基因取交集，得到Gad1、Slc32a1（VGAT）、BDNF、Gabre、Htr1b等5个共同差异基因，其中Gad1、Slc32a1（VGAT）在伏隔核及结肠中，模型组中表示下调，毛蕊花糖苷干预后上调；BDNF、Htr1b在伏隔核及结肠中，模型组中表示上调，毛蕊花糖苷干预后下调；Gabre在伏隔核中的模型组中上调，毛蕊花糖苷干预后下调，但在结肠中的模型组中下调，毛蕊花糖苷干预后上调。3.5　伏隔核组织中主要差异基因mRNA表达与空白组比较，模型组小鼠伏隔核组织中Gad1、Slc32a1（VGAT）表达量明显下降，BDNF表达量明显上升；与模型组比较，毛蕊花糖苷组小鼠伏隔核组织中Gad1、Slc32a1（VGAT）表达量明显升高，BDNF表达量显著下降，见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20220618.T005表5毛蕊花糖苷对抑郁小鼠伏隔核组织Gad1、Slc32a1（VGAT）、BDNF mRNA的影响 （x¯±s，n=4）Table 5Effect of verbascoside on relative expression of Gad1，Slc32a1（VGAT），BDNF mRNA in nucleus accumbens of depressed mice （x¯±s，n=4）组别剂量/mg·kg-1Gad1Slc32a1（VGAT）BDNF空白组1.00±0.081.00±0.211.00±0.22模型组0.70±0.291）0.78±0.091）2.84±1.041）毛蕊花糖苷组601.80±0.822）1.22±0.442）0.57±0.303）注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05，3）P0.014 讨论抑郁症是目前主要的公共卫生问题，是世界上第三大残疾原因，世界终生患病率为20%［27］。其病因复杂，发病机制尚不明确，主要涉及大脑功能障碍、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、免疫系统和脑-肠轴4个方面的功能障碍［28］，大脑功能障碍主要表现为神经递质失衡、神经可塑性受损、神经环路异常等；HPA轴功能障碍主要表现为负反馈机制失调；免疫变化主要表现为慢性炎症；脑肠功能障碍主要包括胃肠道疾病和肠道菌群异常等。抑郁症作为全身性疾病，HPA轴、脑肠轴、神经环路、炎症反应等多系统多层次互相影响、互相作用。本研究采用经典CUMS结合孤养方式构建抑郁模型，采用糖水偏好实验、强迫游泳实验评价小鼠抑郁样行为；旷场实验、十字高架迷宫是实验评价小鼠焦虑样行为；水迷宫实验评价小鼠学习记忆能力。实验结果表明，毛蕊花糖苷可显著恢复小鼠快感、行为绝望得到明显缓解、探索及学习记忆能力显著恢复，表明毛蕊花糖苷具有明显抗抑郁效果。单胺类神经递质假说认为，5-HT、DA缺乏是抑郁症发生发展的重要基础之一［29］。炎症也是抑郁症的一个重要病理特征，一部分抑郁症患者存在免疫失调和慢性炎症［30］。细胞因子假说认为，在抑郁症中，促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量增加，整体免疫反应趋于炎症。过多的促炎细胞因子抑制HPA轴的负反馈，增加血脑屏障的通透性，减少5-HT的合成，扰乱谷氨酸能系统，导致抑郁发生［31］。实验结果表明，模型组小鼠血清中神经递质5-HT、DA、GABA较空白组显著降低，而促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平较空白组显著升高。毛蕊花糖苷干预后，血清中神经递质及促炎因子水平得到逆转。说明毛蕊花糖苷抗抑郁功效可能与单胺类神经递质增加、促炎因子减少以及通过增加GABA恢复神经递质平衡有关。脑肠轴是大脑与胃肠道相互作用的双向调节轴，越来越多研究表明，抑郁症与脑肠轴关系密切［32-34］，抑郁症患者常有肠道脑功能障碍，如食欲障碍、代谢障碍、功能性胃肠道疾病和肠道微生物群异常等［35］。肠道和脑之间通过涉及神经、内分泌和免疫机制的通路进行双向沟通；肠道屏障和血脑屏障通透性的变化也会影响脑-肠轴；肠道菌群亦在其中扮演重要角色［36］。伏隔核是奖赏环路的重要组成部分［37］，研究表明伏隔核参与奖励、动机、学习、摄食、成瘾和情感障碍等，而抑郁症患者快感缺失、兴趣丧失及缺乏动力的症状与伏隔核有关，且快感缺失的症状也表明抑郁症与大脑奖赏环路之间的重要联系，尤其是其组成部分伏隔核区域［38］。伏隔核中98%是GABA能多棘神经元［39］，GABA能神经元的损伤与抑郁症有关。此外伏隔核接收腹侧被盖区的多巴胺神经元发出的投射纤维，同时也接受来自前额叶、海马、杏仁核的谷氨酸能神经元的投射，体现出伏隔核作为皮质边缘回路不可或缺的中枢作用［38］。实验表明，参与奖赏机制的伏隔核与结肠有密切关联，结肠产生的短链脂肪酸（SCFAs）丙酸盐通过中枢神经系统调节进食行为，BYRNE等［40］实验结果表明，结肠丙酸盐可能通过大脑纹状体（伏隔核）通路在食欲和基于奖励的饮食行为中发挥重要作用；NETTLETON等［41］实验结果认为，甜叶菊主要活性成分莱苞迪苷A的摄入会扰乱肠道微生物群和中脑边缘多巴胺奖励系统，降低伏隔核的酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体mRNA水平；AGUSTÍ等［42］实验结果表明，在大鼠食物成瘾模型中施用统一拟杆菌会影响大脑伏隔核介导的奖励反应，改善暴食并减少焦虑样行为。基于此，本实验选择伏隔核及结肠进行mRNA高通量测序，筛选差异表达基因，并对差异基因进行通路富集分析。伏隔核差异基因主要富集在神经活性配体/受体相互作用、GABA 能突触、cAMP 信号通路等通路；结肠差异基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触、突触小泡循环等信号通路。神经活性配体-受体相互作用信号通路与神经功能直接相关，通过与细胞内受体结合来影响神经元功能，细胞内受体具有结合转录因子和调节基因表达的能力，破坏参与神经活性配体-受体相互作用的基因会导致记忆功能下降［43］。GABA能突触通路主要富集Gabre、Gad1、Slc32a1（VGAT）、Gabrq 4个差异基因。GABA是哺乳动物中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质，由GABA能中间神经元释放。GABA能中间神经元和谷氨酸能锥体神经元构成了主要抑制性和兴奋性平衡系统。GABA在突触前膜内由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（GAD）的作用下代谢转化而来，GABA经囊泡转运体（VGAT）转运进入并存储于囊泡，在神经兴奋时被释放进入突触间隙，并经膜转运体（GAT）重摄取回收突触间隙 GABA［44］。因此，抑郁症的发生发展与GABA能系统影响脑功能及行为密切相关。目前常用的以5-HT能系统为靶标的抗抑郁药物最终通过影响GABA能系统活动发挥疗效［45］。cAMP信号通路在情绪调节和学习记忆的形成中发挥关键作用，是研究得最早、最为深入的抗抑郁信号通路［46］，其级联反应的大致过程为腺苷酸环化酶（AC）活化，催化ATP水解生成cAMP，激活PKA（蛋白激酶A），使PKA磷酸化激活CREB（cAMP反应元件结合蛋白）信号转导通路，将细胞外信号传递到细胞内，改变功能蛋白活性和基因表达模式，形成新的突触，从而发挥抗抑郁作用［47］。突触小泡是贮存和释放递质的场所。突触小泡蛋白是突触前膜囊泡上的一种膜蛋白，是突触囊泡中含量最为丰富的蛋白之一，担负着神经递质的包装、储存、调节及释放［48］。神经元之间的交流是由突触小泡释放的神经递质介导的。研究表明，突触小泡蛋白表达增加能够增强大鼠的空间辨别性学习记忆能力［49］，在创伤后应激障碍的大鼠模型中，突触小泡蛋白的表达较空白组明显减少，创伤后刺激激活脑内的5-HT递质系统，神经元损伤甚至是凋亡及坏死，突触前膜突触小泡蛋白的合成及释放也减少，突触可塑性的功能减退，最终导致大鼠的空间记忆能力减退［48］。BDNF、Gad1、Slc32a1（VGAT）、Gabre、Htr1b同时在伏隔核及结肠中表达的差异基因。BDNF在哺乳动物大脑中广泛表达，并与发育、神经再生、突触传递、突触可塑性和神经发生有关，BDNF 含量在抑郁患者体内血清中降低［50-51］，且BDNF可以介导抗抑郁药的治疗作用［52］。肠道细菌代谢产物SCFAs和次级胆汁酸可促进胰高血糖素样肽-１（GLP-1）的产生，GLP-1促进BDNF的产生。伏隔核及结肠测序结果显示，与空白组比较，模型组中BDNF表达量升高，而毛蕊花糖苷干预后，较模型组相比表达量明显下降，伏隔核组织中BDNF的mRNA表达量与测序结果相一致。同时大量实验表明，CUMS诱导抑郁模型会导致伏隔核中BDNF表达增加［53-55］。此结果与抑郁症患者血清及抑郁动物模型中海马体、前额叶中的BDNF表达相反。尽管BDNF在海马体及前额叶中发挥抗抑郁作用，但在不同脑区可能有相反作用。Gad1、Slc32a1（VGAT）、Gabre 3个基因主要富集在GABA能突触信号通路。GABA能中间神经元通过释放GABA激活神经元上的GABAA受体，使氯离子进入神经元，从而起到抑制作用［56-57］。大量实验证明，肠道微生物双歧杆菌可产生GABA［58-60］。Gad1和Slc32a1（VGAT）分别在GABA的代谢、转运过程中起重要作用。Gabre是GABAA受体亚基。在伏隔核中，Gabre在毛蕊花糖苷干预后表示下调，但在结肠中毛蕊花糖苷干预后表示上调，伏隔核组织中Gad1、Slc32a1（VGAT） mRNA表达量与测序结果相一致。目前关于Gabre在抑郁中的作用机制及不同组织中的作用机制研究较少，Gabre在伏隔核与结肠中是否为拮抗作用，值得后续更加深入研究，并为以后Gabre深入研究提供思路。5-HT是常见且主要的脑肠肽，脑肠肽作为脑和胃肠道中双重分布的肽类，是脑肠轴的重要因子，具有神经递质和激素双重作用［61］。5-HT作为主要的抑制性神经递质，对调节认知、情绪和行为功能等有重要作用［62］，抑郁症患者体内5-HT含量减少［63-65］，选择性5-HT重摄取抑制剂是临床常用抗抑郁药物。同时，5-HT在调节胃肠道运动，促进肠神经、黏膜生长，促进肠炎症等方面具有重要作用［66］，肠道微生物代谢产生的SCFAs可调节体内5-HT的水平［67］。5-HT的合成和分泌也受各种因素影响，包括HPA轴、免疫系统和肠脑的影响，并且5-HT含量改变也会反向影响这些器官［68-69］。5-HTR1B编码5-HT1B 受体，5-HT1B受体是一种神经末梢自身受体，参与调节大鼠大脑皮层中5-HT的合成和释放，5-HT1B受体与抑郁的病理生理学有关［70］。测序结果表明，毛蕊花糖苷干预后Htr1b表达下调，与NAUTIYAL等［71］实验结果表明的缺乏Htr1b自身受体会导致焦虑和抑郁相关行为的减少结果一致。综上所示，毛蕊花糖苷通过神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触、突触小泡循环、cAMP等信号通路，增加单胺类神经递质、减少促炎性细胞因子、恢复兴奋性/抑制性神经递质平衡，影响脑-肠交互对话，进而发挥抗抑郁功效。