心血管疾病发生在各个年龄段，被认为是人类死亡的主要原因之一［1］。急性心肌梗死或动脉粥样硬化，是临床上常见的心血管疾病，溶栓和介入治疗等再灌注治疗是治疗急性心梗临床指南首选的治疗方法。然而，突然恢复血液流动会导致心肌缺血再灌注损伤［2-3］。心肌细胞的收缩与舒张功能是心脏泵血功能正常运行的基础，依赖于心肌细胞的兴奋-收缩耦联机制，并且与心肌细胞内Ca2+密切相关。胞浆Ca2+浓度的迅速变化形成钙瞬变，当Ca2+大量积聚于胞浆内，可与肌钙蛋白结合，引发肌丝纤维运动，形成了心肌细胞的收缩/舒张机械运动［4］。心肌收缩/舒张功能是心血管药物研究的重要评价指标，而钙瞬变也是反映心肌收缩/舒张功能离子基础的重要指标。研究表明，金银花提取物绿原酸可以改善心肌缺血再灌注损伤射血分数与短轴缩短率，并减轻心肌细胞的凋亡［5］，但金银花改善心肌缺血再灌注损伤的效应成分和机制还尚未阐明。当药苷又名獐牙菜苷，是四妙勇安汤及其君药金银花中含量最高的环烯醚萜苷类化合物，可能是四妙勇安汤及金银花改善心血管疾病的重要活性成分之一。同时，当药苷也是当药、龙胆等其他中药材的主要成分。大量研究表明，当药苷具有抗肿瘤、治疗糖尿病和保肝等功效［6-8］，但目前当药苷在治疗心血管系统的作用研究极少。因此，本研究通过离体心脏缺血再灌注模型（I/R）及使用原代乳鼠心肌细胞（NRCMs）建立缺氧/复氧（H/R）模型，探究当药苷的心肌保护作用及其对兴奋-收缩耦联相关基因的影响，为拓展新的治疗心肌缺血再灌注损伤的中草药奠定实验基础。1 材料1.1　动物24只雄性SD大鼠，体质量220~250 g，及SD乳鼠（出生1 d）均购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2019-0010。饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室，恒温恒湿，12 h昼夜交替，自由饮水，普通维持饲料，本研究经北京中医药大学动物伦理委员会许可，编号BUCM-4-2019042701-2108（大鼠）、BUCM-4-2019042702-2109（乳鼠）。1.2　试剂当药苷（成都普思生物科技有限公司，货号1415-86-2，purity≥99%）；地高辛（美国Med Chemexpress公司，货号HY-B1049）；氯化钠（NaCl）、葡萄糖（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为s210-500g、g8150-500g）；碳酸氢钠（NaHCO3，如东百奥百乐生物科技有限公司，货号TRH44576-500g）；氯化钾（KCl）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4）、无水氯化钙（CaCl2）（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，货号分别为746436-500G、P5655-500G、M2643-500G、S24110-500g）；2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号G3005）；胰蛋白酶（美国VWR-amresco公司，货号4058-25G）；DMEM（无糖）、DMEM/F12和胶原蛋白酶Ⅱ型（美国Gibco公司，货号分别为11966-025、12400-024、17101-015-1g）；胎牛血清（美国康宁公司，货号35-081-cv）；特级马血清（天津康源生物技术有新公司，货号DE0475-200 mL）；细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（上海东仁化学科技有限公司，货号CK04）；钙离子荧光探针（Fluo-4，AM，美国赛默飞世尔科技有限公司，货号F12401）；QuantiTect Reverse Transcription Kit（德国凯杰生物技术有限公司，货号205311）；iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix（上海伯乐生命产品有限公司，货号1725122）。1.3　仪器ImageXpress Micor XLS型多功能成像细胞分析仪（上海美谷分子仪器有限公司），SpectraMax i3x型多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司），Powerlab 16/35型Powerlab生理记录仪（埃德仪器国际贸易有限公司），ALC-HP型Langendroff灌流系统（上海奥尔科特公司），QuantStudio6Flex型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），FV300型激光共聚焦显微镜（北京奥林巴斯销售服务有限公司）。2 方法2.1　Powerlab生理记录仪及TTC染色检测当药苷对I/R损伤离体心脏血流动力学及梗死面积的影响参考陈婵娟等［9］造模方法，健康雄性SD大鼠麻醉后，迅速摘除心脏并安装在Langendorff设备上进行心脏灌流。正常组：K-H液（NaCl 6.9 g、NaHCO3 2.1 g、KCl 0.35 g、KH2PO4 0.163 g、MgSO4 0.144 g溶于1 L灭菌去离子水中，临用前加入葡萄糖1.998 g、无水CaCl2 0.139 g。提前0.5 h通入5% CO2与95% O2配比的标准气氧合）平衡灌流125 min；模型组：K-H液平衡灌流20 min后，结扎冠状动脉左前降支，局部停灌30 min，再松开结扎线，恢复灌流75 min；当药苷组使用含10 μmol·L-1当药苷的K-H液复灌，余操作同模型组；地高辛组使用1 μmol·L-1地高辛的K-H液复灌，其余操作同模型组。在缺血30 min及再灌注15、30、75 min时采用Powerlab生理记录仪检测血流动力学参数，包括左心室舒张压（LVDP）、左心室终末舒张压（LVEDP）、左心室终末收缩压（LVESP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）。在实验终点，心脏于切心槽中切片，每片约2 mm厚，并采用TTC染色，Image J软件将图片转为8-bit灰度再调整阈值、色度、饱和度、亮度等参数后分析心肌梗死面积与全心面积的比值。2.2　CCK-8法检测当药苷对NRCMs细胞活力的影响参考文献［10］提取NRCMs，收集乳鼠心室，剪成1 mm3左右的小块，转移至含有0.06%胰蛋白酶和0.04%胶原蛋白酶Ⅱ型的缓冲液中解离4~5次，然后将分离的细胞再转移到含有5%胎牛血清和10%马血清的DMEM/F12中，37 ℃培养1.5 h，以去除成纤维细胞。获得的心肌细胞以1×104个/孔密度接种于96孔板，培养3~5 d后，随机分为为正常组、不同浓度当药苷组（0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1），孵育24 h，常规培养。实验终点，采用CCK-8法检测各组细胞活力，确定当药苷对正常心肌细胞活力的影响。2.3　CCK-8法检测当药苷对H/R损伤后的NRCMs细胞活力的影响参考文献［11-12］的方法，取培养3~5 d且生长状态良好的NRCMs，更换培养基为缺氧液（无糖DMEM），置于细胞低氧培养小室，调节气体比例为O2（0.5%）、CO2（5%）、N2（94.5%），缺氧条件下培养6 h后取出，更换培养基为复氧液（正常心肌细胞培养基），再将细胞置于正常培养箱培养1 h后（H6R1），获得心肌细胞H/R损伤模型模拟心脏缺血再灌注损伤。细胞随机分为正常组、模型组、当药苷组。模型组经H/R损伤且无药物处理，各给药组用不同浓度当药苷（0.1、1、10、100 μmol·L-1）预孵24 h后，再进行缺氧复氧，并且在H/R过程中也用不同浓度的当药苷共同孵育，实验终点CCK-8法检测心肌细胞活力。2.4　激光共聚焦显微镜检测当药苷对H/R损伤后的NRCMs收缩功能的影响取3~5 d且生长状态良好的细胞，随机分为4组，正常组、模型组、当药苷组（1、10 μmol·L-1），其余操作同2.3。细胞经处理后，使用激光共聚焦显微镜于明场20倍镜下记录20 s，曝光时间为40 ms，使用Image J Muscle Motion软件分析心肌细胞收缩幅度、心率、收缩时程、达峰时间以及收缩时程［13］。2.5　钙离子荧光探针法检测当药苷对H/R损伤后的NRCMs钙瞬变的影响取3~5 d且生长状态良好的细胞，分组及操作同2.4。细胞处理完毕后，加入Fluo-4，AM荧光染料，孵育，洗涤。给予各组细胞1 Hz电场刺激后，使用多功能成像细胞分析仪记录。随机记录4个视野，曝光时间40 ms，记录20 s。每个视野随机选择10个细胞进行分析。使用Image J分析荧光强度变化值△F，通过PeakCaller软件分析检测时间内钙瞬变平均峰高［14］。2.6　Real-time PCR检测H/R损伤后NRCMs兴奋收缩耦联相关mRNA表达水平取3~5 d且生长状态良好的细胞，分组及操作同2.4，正常组、模型组、当药苷组（1、10 μmol·L-1），提取NRCMs总RNA，逆转录成cDNA。结合文献和课题组前期转录组学测序结果，采用Real-time PCR检测兴奋收缩耦联相关基因：细胞色素氧化酶6A2亚基（Cox6a2）、肌钙蛋白C1（Tnnc1）、肌钙蛋白I3（Tnni3）、肌钙蛋白T2（Tnnt2）、心肌肌动蛋白α1（Actc1）、肌球蛋白重链6（Myh6）、肌球蛋白轻链2（Myl2）和肌球蛋白轻链4（Myl4）等mRNA的表达量。各组NRCMs的RNA提取合格后，计算定量2 μg RNA所需体积及不含RNA酶的DEPC水体积，二者之和为11 μL，加入QuantiTect Reverse Transcription Kit中的5×Buffer缓冲液4 μL，RNAase抑制剂1 μL，10 mmol·L-1 dNTP混合物2 μL，反应总体积为20 μL/样本，转录条件为25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃ forever，使RNA逆转录成cDNA。再按上游引物-下游引物-SYBR 1∶1∶20进行配制混合液，将稀释10倍的cDNA按cDNA-DEPC水5∶4进行混合，反应总体积为20 μL/样本，扩增条件为95 ℃预变性10 min后，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40个循环，扩增结束后，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，使用2-ΔΔCt方法来计算相对含量变化，引物（北京六合华大基因科技有限公司）如表1所示。同时运用R包pheatmap_1.0.12对差异基因进行聚类分析。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T001表1引物序列Table 1Sequences primers引物序列长度/bpGAPDH上游ACTCCCATTCTTCCACCTTTG20下游CCCTGTTGCTGTAGCCATATTCacnb2上游AGCCTCGCCACCGCACTAG19下游ACTCGCCAGCCTCACTCCTTGCox6a2上游TGCTCGCTTAACTGCTGGATGC22下游GAGAAGGGCTTGGTTCGGATGCTnnc1上游GGCAGTGGCACAGTGGACTTC21下游ATCCGACAGCTCCTCCTCAGACTnni3上游CCACCGAGCCACATGCCAAG20下游TCCTCTGCCTCACGCTCCATCTnnt2上游GAGGCAGTGGAGGAGGAGGATG22下游GCTGGGCTTGGGTTTGGAGTCActc1上游GGCGACGGTGTGTGACTCATAACG22下游CCCGACCAGCTAGATCCAGACGMyh6上游GGACGGAGGAGCTGGGAAG21下游GAGAGGAGCACTTGGCGTTGACMyl2上游GGCGGAAGCTCCAACGTTC21下游GGCAGCAAACGTGTCCCTTAGGMyl4上游AAAGCAACGGCAGTCATGGG22下游TCCACCTCAGCCTCGCTCATC2.7　统计学分析采用SAS 8.4统计软件进行数据分析，所有数据皆以x¯±s表示，当数据符合正态分布并且满足方差齐性检验时，多组比较采用单因素方差分析，并且组间多重比较采用最小显著性差异法（LSD），P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠离体心脏I/R损伤的影响在离体心脏平衡灌流20 min时，各组血流动力学参数差异无统计学意义，具有可比性。与同期正常组比较，自结扎30 min起，模型组LVDP显著降低、LVEDP显著升高（P0.01）、LVESP明显降低（P0.05）；自再灌15 min起，模型组+dp/dtmax明显降低（P0.05），-dp/dtmax明显升高（P0.05），再灌注进一步加重了心肌损伤。与模型组比较，当药苷组、地高辛组在结扎30 min时，各指标差异无统计学意义，表示模型的结扎程度相似；与模型组比较，当药苷再灌注15、30、75 min均可以显著升高LVDP和LVESP（P0.01），与地高辛药效相近；与模型组比较，当药苷再灌注30、75 min可以明显升高+dp/dtmax和降低-dp/dtmax（P0.05，P0.01），与地高辛药效相近；当药苷和地高辛对LVEDP差异均无统计学意义。此外，地高辛再灌注15 min即可明显降低-dp/dtmax（P0.05），起效时间早于当药苷，其中，地高辛组中一只大鼠的心脏在K-H液平衡灌流时血流动力学参数出现异常，故舍弃。见表2-表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T002表2当药苷对I/R损伤大鼠心脏血流动力学参数LVDP的影响 （x¯±s）Table 2Effect of sweroside on hemodynamic parameter LVDP in rat heart subjected to I/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n平衡灌流20 min末结扎30 min末再灌注15 min末再灌注30 min末再灌注75 min末正常组674.57±8.1475.58±7.7676.30±8.3074.34±8.9072.72±9.17模型组679.17±7.2956.27±5.342）41.66±4.592）40.24±4.452）37.92±5.212）当药苷组10680.19±6.5157.39±6.7257.85±3.094）57.42±3.544）59.11±2.104）地高辛组1573.20±10.9856.99±10.5357.15±9.354）57.03±9.874）54.53±10.234）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表3-表6、表10-表12同）；1 mmHg≈0.133 kPammHg10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T003表3当药苷对I/R损伤大鼠心脏血流动力学参数LVEDP的影响 （x¯±s）Table 3Effect of sweroside on hemodynamic parameter LVEDP in rat heart subjected to I/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n平衡灌流20 min末结扎30 min末再灌注15 min末再灌注30 min末再灌注75 min末正常组66.97±1.047.94±1.088.00±1.318.16±1.408.88±1.24模型组68.70±1.8216.75±3.182）19.89±6.102）20.38±5.092）20.81±3.772）当药苷组1068.74±1.1818.02±2.7217.68±2.3818.73±2.7318.74±2.02地高辛组158.29±1.3015.01±1.9518.47±3.9618.77±3.2519.51±2.76mmHg10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T004表4当药苷对I/R损伤大鼠心脏血流动力学参数LVSEP的影响 （x¯±s）Table 4Effect of sweroside on hemodynamic parameter LVSEP in rat heart subjected to I/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n平衡灌流20 min末结扎30 min末再灌注15 min末再灌注30 min末再灌注75 min末正常组681.54±8.3383.53±7.9184.30±8.1182.51±8.7081.59±9.44模型组687.87±7.0773.03±2.461）61.55±3.462）60.62±3.082）58.73±2.712）当药苷组10688.94±6.0975.40±4.8275.53±2.444）76.15±2.454）77.85±2.144）地高辛组1581.49±11.6372.00±10.7375.62±6.634）75.80±9.314）74.03±9.514）mmHg10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T005表5当药苷对I/R损伤大鼠心脏血流动力学参数+dp/dtmax的影响 （x¯±s）Table 5Effect of sweroside on hemodynamic parameter +dp/dtmax in rat heart subjected to I/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n平衡灌流20 min末结扎30 min末再灌注15 min末再灌注30 min末再灌注75 min末正常组62 446.04±251.682 411.56±182.412 432.31±259.172 398.71±237.042 337.33±276.02模型组62 881.26±687.052 307.09±389.981 920.70±390.171）1 824.07±302.912）1 819.21±377.022）当药苷组1062 486.61±302.462 290.95±222.352 252.63±387.232 299.09±332.723）2 231.62±271.993）地高辛组152 643.61±298.322 377.28±217.892 242.09±179.192 197.23±281.373）2 079.32±308.51mmHg·s-110.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T006表6当药苷对I/R损伤大鼠心脏血流动力学参数-dp/dtmax的影响 （x¯±s）Table 6Effect of sweroside on hemodynamic parameter -dp/dtmax in rat heart subjected to I/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n平衡灌流20 min末结扎30 min末再灌注15 min末再灌注30 min末再灌注75 min末正常组6-1 867.03±180.59-1 769.02±285.06-1 767.99±317.81-1 736.43±325.33-1 603.76±294.69模型组6-2 050.67±178.17-1 659.65±144.13-1 287.18±129.221）-1 245.12±75.702）-1 205.37±24.982）当药苷组106-1 923.80±190.37-1 629.72±188.37-1 558.30±206.77-1 602.36±217.993）-1 540.95±149.974）地高辛组15-1 978.70±130.82-1 650.92±284.49-1 693.45±253.973）-1 683.25±214.684）-1 534.43±134.684）mmHg·s-1TTC染色结果显示，模型组心肌梗死面积约占全心面积的44%，在复灌时加入10 μmol·L-1当药苷，可减少心肌梗死面积至21%左右（P0.01），与地高辛药效相近。见图1、表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.F001图1当药苷对I/R损伤大鼠心肌梗死面积的影响 （TTC染色）Fig.1Effect of sweroside on size of myocardial infarction in I/R injured rats （TTC staining）注：A.正常组；B.模型组；C.当药苷组；D.地高辛组10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T007表7TTC染色测定左心室梗死大小 （x¯±s）Table 7Infract size of left ventricle from TTC staining （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1n心肌梗死面积/%正常组61.67±1.15模型组644.33±7.771）当药苷组10621.33±2.312）地高辛组1525.67±0.582）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01（表9同）3.2　对H/R损伤后NRCMs细胞活力的影响当药苷浓度在0.01~100 μmol·L-1范围内，预处理24 h对心肌细胞活力无显著影响，表明当药苷对正常心肌细胞无明显毒性作用，安全范围较宽。见表8。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T008表8不同浓度当药苷对正常NRCMs毒性影响 （x¯±s，n=5）Table 8Toxicity study of different concentrations of sweroside on NRCMs （x¯±s，n=5）组别浓度/μmol·L-1正常NRCMs细胞活力空白1.00±0.08当药苷组0.010.97±0.030.10.98±0.0410.96±0.05101.02±0.041001.02±0.08与正常组比较，经H/R处理后，NRCMs细胞活力显著下降（P0.01）；与模型组比较，1、10、100 μmol·L-1当药苷均可显著改善NRCMs细胞活力（P0.01）；0.1 μmol·L-1当药苷组对NRCMs细胞活力无显著影响。见表9。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T009表9不同浓度的当药苷对H/R损伤后心肌细胞活力的影响 （x¯±s）Table 9Different concentrations of sweroside improved viability of cardiomyocytes after H/R injury （x¯±s）组别浓度/μmol·L-1nH/R损伤后细胞活力空白正常组31.00±0.05模型组40.46±0.101）当药苷组0.150.50±0.08150.64±0.102）1050.66±0.052）10050.62±0.082）3.3　对H/R损伤后NRCMs收缩/舒张功能的影响NRCMs经H/R损伤后，细胞收缩幅度显著降低，心率显著降低，收缩时程显著升高，达峰时程显著升高，舒张时程显著升高，钙瞬变峰值显著降低（P0.01）。与模型组比较，1、10 μmol·L-1当药苷可以显著改善NRCMs收缩相关指标，表现NRCMs收缩幅度显著上升，心率显著升高，收缩时程显著降低，舒张时程显著降低，达峰时程明显下降，NRCMs钙瞬变峰值明显升高（P0.05，P0.01），促进NRCMs收缩/舒张功能的恢复。在各项指标中，1、10 μmol·L-1当药苷除去在收缩幅度和心率上有差异外（P0.05），在其他指标上均差异无统计学意义。见表10。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T010表10当药苷对H/R损伤心肌细胞收缩功能的保护作用 （x¯±s，n=3）Table 10Effect of sweroside on NRCMs systolic function after H/R （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1收缩幅度/a.u心率/Hz收缩时程/ms舒张时程/ms达峰时程/ms钙瞬变峰值空白组7 768.77±212.531.60±0.10264.37±6.80162.96±2.96102.80±5.465.31±0.39模型组5 316.35±291.642）0.89±0.112）496.97±29.622）338.51±34.162）135.76±24.202）3.71±0.062）当药苷组18 221.18±300.824）1.90±0.014）273.33±1.914）162.97±5.913）103.39±3.404）4.72±0.223）107 162.98±429.904）1.68±0.094）260.61±9.774）159.78±8.433）99.15±1.344）4.74±0.663）3.4　对NRCMs兴奋-收缩耦联相关基因的影响结合文献和课题组前期转录组学测序结果，对Cacnb2、Cox6a2、Tnnc1、Tnni3、Tnnt2、Actc1、Myh6、Myl2、Myl4等兴奋-收缩耦联相关基因表达水平进行分析。与正常组比较，模型组Cacnb2、Cox6a2、Tnnc1、Tnni3、Tnnt2、Actc1、Myh6、Myl2、Myl4的mRNA表达量均明显降低（P0.05，P0.01）。与模型组比较，经1 μmol·L-1当药苷处理后，除Cox6a2差异无统计学意义外，其他基因mRNA的表达量均明显上调（P0.05）。经10 μmol·L-1当药苷处理后，Cacnb2、Tnnc1、Tnni3、Tnnt2、Actc1、Myh6的mRNA表达量均明显上调（P0.05，P0.01），其余基因mRNA的表达量有上升趋势，差异无统计学意义。见表11和表12。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T011表11当药苷对兴奋-收缩耦联相关基因表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 11Effect of sweroside on expression of genes related to myocardial excitation-contraction coupling pathway （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1Cacnb2Cox6a2Tnnc1Tnni3Tnnt2正常组1.03±0.311.04±0.341.00±0.091.00±0.071.00±0.11模型组0.54±0.101）0.24±0.052）0.31±0.592）0.33±0.12）0.41±0.142）当药苷组11.01±0.293）0.43±0.030.85±0.94）1.01±0.14）0.83±0.073）100.97±0.043）0.58±0.170.53±0.133）0.59±0.13）0.79±0.273）10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.T012表12当药苷对兴奋-收缩耦联相关基因表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 12Effect of sweroside on expression of genes related to myocardial excitation-contraction coupling pathway （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1Actc1Myh6Myl2Myl4正常组1.00±0.371.01±0.191.01±0.131.01±0.15模型组0.22±0.002）0.31±0.202）0.16±0.072）0.47±0.102）当药苷组10.61±0.004）0.87±0.104）0.79±0.084）0.80±0.034）100.68±0.204）0.87±0.104）0.32±0.080.65±0.10上述基因的聚类热图结果显示，模型组各基因的表达均与其他3组的差异较大，而1、10 μmol·L-1当药苷给药组基因表达较为接近，并且比较于模型组，两组当药苷给药组的绝大多数基因表达更接近正常组。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221342.F002图2兴奋-收缩耦联通路基因表达的热图分析Fig.2Heat map analysis of expression of genes related to myocardial excitation-contraction coupling pathway注：A.模型组；B.正常组；C.当药苷1 μmol·L-1组；D.当药苷10 μmol·L-1组4 讨论心血管疾病是危及人类健康的主要疾病，各种类型的心脏手术造成的越来越多的心肌缺血再灌注损伤病例［15］，心肌兴奋-收缩耦联异常是缺血再灌注导致心肌细胞损伤的重要病理生理变化，研发可改善受损心肌兴奋-收缩耦联的药物具有重要的临床意义。当药苷是四妙勇安汤及其君药金银花中含量最高的环烯醚萜苷类化合物，同时也是当药、龙胆等其他中药材的主要成分，可能是这些复方及单味药改善心血管疾病的重要活性成分之一。研究表明，当药苷可改善乌头碱诱导的大鼠心律失常，抑制H9c2心肌细胞氧化应激、自噬和凋亡并改善细胞内钙异常，上调L型钙通道二氢吡啶类受体（DHPR）等基因表达［16］。另外，有研究者发现当药苷还可通过抑制Keap1/NRF2轴，从而抑制氧化应激和由炎症小体NLRP3介导的细胞焦亡来改善心肌的H/R损伤［17］，但对于心肌细胞心肌兴奋-收缩耦联的影响尚无报道。因此，本研究采用离体心脏缺血再灌注和NRCMs缺氧复氧模型，系统评价当药苷对心肌缺血再灌注损伤及其导致的兴奋-收缩耦联异常的影响。结果表明，当药苷可以显著减少I/R损伤离体心脏的心肌梗死面积，改善心肌的收缩与舒张功能，且与地高辛药效相近。同时，当药苷可以显著提高H/R损伤心肌细胞的活力，改善心肌细胞收缩、舒张功能。当心肌细胞缺血或者缺氧时，细胞外H+增加会导致细胞内Na+增加，从而促进Na+/Ca2+的交换并引发细胞内部“钙过载”，细胞运动状态表现为挛缩［18］。但心衰发生时，肌浆网异常释放Ca2+，钙容量减少，即“钙泄漏”，引起钙瞬变降低，心肌收缩力降低［19］。所以细胞内Ca2+过高或者过低，都可能引起心肌细胞收缩功能异常，而胞内Ca2+的变化被称为“钙瞬变”，是除了收缩幅度降低、收缩时程等反应收缩功能指标外，另一种可以反应心肌收缩功能的重要检测指标，可以通过荧光染料的特异性结合来观察（例如Fluo-4等）［20］。当Ca2+可通过DHPR进入细胞内，与肌钙蛋白结合，引发肌丝纤维运动，形成了心肌细胞的收缩/舒张［4］。当胞浆内Ca2+浓度降低时，心肌肌钙蛋白I抑制肌动蛋白及原肌球蛋白结合，阻止肌球蛋白与肌动蛋白结合，肌肉舒张；当细胞膜去极化时，Ca2+大量进入细胞内与cTnC结合，引起肌钙蛋白复合物的构型变化，解除了cTnI与肌动蛋白-肌钙蛋白之间的结合，cTnI的抑制作用解除，导致肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，粗细肌丝互相滑动，肌肉收缩，即兴奋-收缩耦联［21］。洋地黄类强心药地高辛可以通过抑制Na+-K+-ATP酶活性，而使细胞内Na+增多促进钠钙交换而增加Ca2+，临床上常用来治疗心血管疾病。本实验结果显示，经过H/R损伤后的心肌细胞胞内Ca2+水平显著降低，而当药苷可以把其胞内Ca2+水平调节到正常组的水平，通过调节钙瞬变发挥改善心肌细胞收缩/舒张功能的作用。有研究表明，Cacnb2是L型钙通道的β2亚单位，如果β亚基缺失，肾上腺素激动剂将难以发挥增强心肌收缩力的作用［22］。Cox6a2是线粒体呼吸链复合物Ⅳ即细胞色素c氧化酶的亚单位，Cox6a2的缺失可能会导致线粒体功能障碍，从而影响心脏等多个组织的功能［23］，在一项关于速效救心丸防治缺血性心脏病研究表明，缺血缺氧后的HL-1心肌细胞Cox6a2表达降低［24］。Tnnc1、Tnni3、Tnnt2均与肌钙蛋白的亚单位相关，Tnnc1、Tnni3、Tnnt2任何一个表达异常都会引起心脏功能异常［25-27］。Actc1与心肌肌动蛋白相关，Actc1基因的表达在先天性心脏病的心肌组织中减少，并且在心肌组织的这部分中存在明显的凋亡［28］。心肌肌球蛋白由2个肌球蛋白重链（α-MHC与-MHC）和2对肌球蛋白轻链（MLC）组成，Myh6与α-MHC相关，在成人心脏病病理肥大期间α-MHC表达下调［29］，Myl2、Myl4与肌球蛋白两条轻链相关Myl2的磷酸化是调节心肌收缩速度的枢转因子［30］。当细胞收到H/R损伤时，Cacnb2、Cox6a2、Tnnc1、Tnni3、Tnnt2、Actc1、Myh6、Myl2、Myl4基因表达下降，而当药苷可以上调这些基因的表达，提示当药苷改善H/R损伤心肌收缩、舒张功能的效应可能与调节上述兴奋-收缩耦联相关基因有关。综上所述，当药苷可能通过调节兴奋-收缩耦联相关基因，改善心肌细胞内钙瞬变，从而改善心肌细胞收缩舒张功能、发挥改善心肌细胞缺血再灌注损伤的作用，但当药苷的直接作用靶点还有待进一步研究。以上的工作，为拓展新的改善心肌缺血再灌注损伤的中草药提供了线索，并为揭示当药苷的效应及其作用机制提供了实验依据。