肾病综合征（NS）是由于多种原因引起的一类肾脏疾病［1］。以往研究显示NS的临床治疗主要是以激素和免疫抑制剂，但是长时间的使用会导致免疫系统的紊乱，极易诱发并发症和感染，复发率较高［2］。氧化应激失衡在NS中发挥关键作用，在肾脏损伤患者中，血清过氧化指标与肾功能呈负相关［3］。提示调控机体氧化应激水平可能是治疗NS的重要途径。足细胞在维持肾小球滤过屏障和合成分泌血管内皮生长因子以及肾小球内皮细胞的功能完整性等方面起着重要的作用［4］。最新研究表明，晚期糖基化终末产物（RAGE）/活性氧簇（ROS）/核转录因子-κB（NF-κB）轴及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路在晚期氧化蛋白产物（AOPPs）介导的足细胞损伤中发挥着重要作用［5-6］。提示AOPPs介导的RAGE/ROS/NF-κB轴及Wnt/β-catenin信号通路可能是防治NS的新靶点。因此，从AOPPs介导的RAGE/ROS/NF-κB轴及Wnt/β-catenin信号通路出发，进一步探索传统中医药治疗NS的作用机制，对研发具有抗氧化应激、保护足细胞作用的中药复方制剂，具有重要研究价值和科学意义。中医药复方治疗NS疗效确切，而且可以从抗氧化应激、抗凋亡、抗自噬等不同机制保护足细胞，减少尿蛋白的生成［7］。右归丸出自张景岳所著《景岳全书》，具有温补肾阳、填精补血之效，可由于治疗肾脏损伤［8］。课题组前期研究表明，右归丸对糖皮质激素有增敏作用，可明显减少激素抵抗型NS大鼠24 h尿蛋白含量，降低血脂水平、提高血清蛋白含量，有效恢复足细胞裂孔隔膜相关蛋白nephrin、podocin的表达量，恢复肾小球过滤功能［9］。另外，右归丸能够通过抑制大鼠体内自由基过氧化损伤，从而改善NS肾损伤［10］。但是有关右归丸对NS肾损伤的具体分子机制尚不完全清楚。因此，本研究拟通过大鼠尾静脉注射阿霉素构建NS模型，探究右归丸能否通过AOPPs调控RAGE/ROS/NF-κB轴及Wnt/β-catenin信号改善NS。1 材料1.1　动物雄性SPF级SD大鼠60只2月龄，体质量（200±20） g，购自甘肃中医药大学，实验动物合格证号SCXK（甘）2015-002，使用许可证号SYXK（甘）2015-005。鼠房灯光模拟昼夜交替（12 h∶12 h），温度（22±4） ℃，空气湿度（42±4）%。自由进食取水，定期更换垫料，适应2周后实验。本研究经甘肃中医药大学中西医结合学院动物伦理委员会批准（批号L2015012403）。1.2　药物右归丸购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂（国药准字Z11021040，批号11030027）。所规定的右归丸方药组成剂量：熟地黄240 g、山药120 g、山茱萸90 g、枸杞子120 g、鹿角胶120 g、菟丝子120 g、杜仲120 g、当归90 g、肉桂60 g、附子60 g。由甘肃中医药大学杨扶德教授根据2015年版《中华人民共和国药典》鉴定为正品。由甘肃省中医院中药研究院提取浓缩，自制成水煎液，生药量为1.75 g·mL-1。1.3　试剂阿霉素（湖北鑫红利化工有限公司，批号LI2174）；ROS检测试剂盒、AOPPs检测试剂盒（美国Sigma公司，批号分别为RAB0311、RAB0277）；尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为C013-2-1、C011-2-1、A028-2-1、A111-1-1、A110-1-1）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G抗体、羊抗鼠IgG抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0105S、A0239、A0192、AF5001）；RAGE抗体、磷酸化（p）-NF-κB抗体、Wnt1抗体、β-catenin抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab36898、ab8805、ab38449、ab32536）。1.4　仪器TWK-FST32型组织匀浆仪（武汉泰普拓公司）；Micro17R型高速冷冻离心机、FC型全自动多功能酶标检测仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜（日本尼康公司）；1658033型电泳仪、ChemiDoc XRS+成像系统（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　动物建模与分组采用尾静脉一次性注射阿霉素的方法复制NS模型［3］，将雄性SPF级SD大鼠置于代谢笼中适应性喂养7 d，并用尿蛋白试纸检测尿蛋白无异常后开始造模。大鼠在非麻醉状态下固定于大鼠固定器内，暴露大鼠鼠尾，用75%的医用消毒乙醇对大鼠尾部皮肤进行消毒同时使鼠尾静脉血管饱满可见，从大鼠腹侧尾静脉远端1/3处进针，回抽见血后，将盐酸阿霉素（6.5 mg·kg-1）脉缓慢注入，后用生理盐水将注射器与针头中残留的阿霉素溶液冲入尾静脉内，确保无药液渗出血管或沾染针孔周围外皮肤。7 d后检测尿蛋白含量，以24 h尿蛋白100 mg作为NS成模大鼠，正常组大鼠给予等量的生理盐水注射。将造模成功的NS大鼠随机分为模型组、右归丸低、中、高剂量组分别按生药2.8、5.6、11.2 g·kg-1·d-1灌胃，泼尼松组以醋酸泼尼松6.3 mg·kg-1d-1灌胃。各用药组连续给药6周，正常组及模型组灌服等体积生理盐水。2.2　肾脏相关指标检测各组大鼠心脏取血，4 ℃，3 000 r·min-1离心15 min（离心半径6 cm），分离得到血清。按照检测试剂盒说明书对BUN、SCr、ALB、TC、TG含量进行检测。BCA法检测给药处理6周后，大鼠24 h尿蛋白含量。2.3　试剂盒检测肾脏组织ROS水平-80 ℃冰箱取出肾脏组织，组织充分碾磨，之后按照ROS检测试剂盒说明书步骤检查各组大鼠肾脏组织ROS水平。2.4　试剂盒检测血清AOPPs含量取大鼠血清，按照试剂盒说明书步骤检测各组大鼠血清AOPPs含量。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾组织RAGE、NF-κB、Wnt1及β-catenin蛋白表达取大鼠肾组织，组织碾磨；裂解；BCA法测定蛋白质浓度；凝胶电泳；湿转转膜；上样；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应RAGE抗体（1∶1 000），p-NF-κB抗体（1∶1 000），Wnt1抗体（1∶1 000），β-catenin抗体（1∶1 000）及β-actin抗体（1∶2 000），4 ℃过夜，孵育对应的羊抗兔IgG抗体或者羊抗鼠IgG抗体（1∶5 000）1~2 h，；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，然后加入显影液，显影并拍照。RAGE、p-NF-κB、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值表示。2.6　统计学分析采用SPSS 20.0软件进行分析，数据以x¯±s表示，多组均数比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对NS大鼠尿蛋白水平和肾脏病理形态的影响与正常组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白含量显著升高（P0.01）；与模型组比较，右归丸组大鼠24 h尿蛋白含量均显著降低（P0.01），且呈剂量相关性。正常组大鼠肾脏组织无明显的病理改变。模型组大鼠肾脏组织存在典型的病理改变，肾小球基底膜界限模糊，并伴有增生和肾小球囊粘连、肾小管上皮细胞空泡变性等。右归丸组大鼠肾脏损伤明显改善，肾小球基底膜增生减轻，粘连及肾小管上皮细胞变性明显缓解，且呈剂量相关性。见表1、图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.T001表 1右归丸对NS大鼠尿蛋白水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of Youguiwan on level of urine protein in rats （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-124 h尿蛋白/g·L-1正常组11.21±3.45模型组54.88±9.281）右归丸低剂量组2.830.22±8.912）右归丸中剂量组5.628.20±5.022）右归丸高剂量组11.220.39±5.302）泼尼松组0.006 321.36±6.372）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01（表2-表5同）10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.F001图 1右归丸对大鼠肾脏病理形态的影响（HE，×200）Fig. 1Effect of Youguiwan on pathological morphology of rat kidney （HE， ×200）注：A.正常组；B.模型组；C.右归丸低剂量组；D.右归丸中剂量组；E.右归丸高剂量组；F.泼尼松组（图2-图3同）3.2　对NS大鼠肾脏相关指标水平的影响与正常组比较，模型组大鼠血清BUN、SCr、TC、TG水平均显著升高（P0.01），ALB显著降低（P0.01）；与模型组比较，右归丸组大鼠血清BUN、SCr、TC、TG水平均显著降低（P0.01），ALB显著升高（P0.01），且呈剂量相关性。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.T002表 2右归丸对肾脏相关指标水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of Youguiwan on level of kidney-related indicators （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1BUNSCrTCTGALB正常组3.13±0.7544.76±10.562.01±0.710.31±0.1124.33±2.89模型组8.05±1.121）150.67±30.561）7.44±1.211）0.97±0.141）13.01±2.771）右归丸低剂量组2.85.33±1.022）78.98±18.752）4.08±0.822）0.59±0.082）18.71±2.032）右归丸中剂量组5.64.85±0.712）58.21±11.232）3.84±0.722）0.48±0.122）20.12±1.392）右归丸高剂量组11.23.76±0.692）48.99±16.012）3.21±0.542）0.40±0.072）21.12±1.882）泼尼松组0.006 33.47±0.772）50.26±17.222）3.11±0.522）0.38±0.062）22.33±2.182）mmol·L-13.3　对NS大鼠氧化应激水平的影响与正常组比较，模型组大鼠血清AOPPs、ROS水平均显著升高（P0.01）；与模型组比较，右归丸组大鼠血清AOPPs、ROS水平均显著降低（P0.01），且呈剂量相关性。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.T003表 3右归丸对NS大鼠氧化应激水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of Youguiwan on level of oxidative stress in NS rats组别剂量/g·kg-1AOPPs/pmol·L-1ROS/ng·L-1正常组37.78±5.89300.41±31.21模型组189.44±20.121）489.07±39.291）右归丸低剂量组2.8100.76±19.232）400.43±41.872）右归丸中剂量组5.680.79±14.452）380.38±42.302）右归丸高剂量组11.259.48±13.292）360.44±38.982）泼尼松组0.006 360.33±18.882）367.18±39.272）x¯±s，n=103.4　对NS大鼠RAGE/ROS/NF-κB信号轴相关蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织RAGE、p-NF-κB蛋白表达水平均显著升高（P0.01）；与模型组比较，右归丸组织大鼠肾脏组织RAGE、p-NF-κB蛋白表达均显著降低（P0.01），且呈剂量相关性。见图2和表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.F002图 2各组大鼠RAGE/ROS/NF-κB信号轴相关蛋白表达电泳Fig. 2Electrophoresis of RAGE/ROS/NF-κB signal axis related proteins expression10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.T004表 4右归丸对RAGE/ROS/NF-κB信号轴相关蛋白表达的影响Table 4Effect of Youguiwan on expression of RAGE/ROS/NF-κB signal axis related proteins （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1RAGE/β-actinp-NF-κB/NF-κB正常组0.15±0.050.11±0.03模型组0.59±0.101）0.45±0.091）右归丸低剂量组2.80.45±0.082）0.40±0.072）右归丸中剂量组5.60.40±0.062）0.25±0.052）右归丸高剂量组11.20.22±0.082）0.20±0.062）泼尼松组0.006 30.24±0.072）0.25±0.072）x¯±s，n=33.5　对NS大鼠Wnt/β-catenin信号轴相关蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织Wnt1、β-catenin蛋白表达均显著升高（P0.01）；与模型组比较，右归丸组大鼠肾脏组织Wnt1、β-catenin蛋白表达均显著降低（P0.01），且呈剂量相关性。见图3和表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.F003图 3各组大鼠Wnt/β-catenin信号轴相关蛋白表达电泳Fig. 3Electrophoresis of Wnt/β-catenin signal axis related protein expression10.13422/j.cnki.syfjx.20220706.T005表 5右归丸对Wnt/β-catenin信号轴相关蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Youguiwan on Wnt/β-catenin signal axis related protein expression （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1Wnt1/β-actinβ-catenin/β-actin正常组0.40±0.110.21±0.03模型组1.18±0.341）1.13±0.221）右归丸低剂量组2.81.09±0.152）1.00±0.142）右归丸中剂量组5.60.87±0.202）0.51±0.102）右归丸高剂量组11.20.54±0.172）0.24±0.052）泼尼松组0.006 30.28±0.072）0.26±0.062）4 讨论氧化应激在慢性肾脏疾病进展中发挥重要作用。研究表明在NS、糖尿病肾病、膜系肾病以及局灶性节段性肾小球硬化等慢性肾脏疾病患者血清中ROS水平均显著高于正常人群［11-12］。另外，在高糖诱导的足细胞凋亡中，细胞ROS水平显著升高，清除ROS能够有效降低高糖诱导的足细胞凋亡以及炎症反应［13］，表明ROS在糖尿病肾病细胞凋亡和炎症中发挥重要作用。NS作为慢性肾脏疾病中的一种，机体ROS水平的失衡同样扮演重要角色［14］。因此，通过调节慢性肾脏疾病氧化应激可能是治疗NS的关键途径。右归丸能够改善多种诱因引发的肾脏损伤，其机制与抑制肾脏组织氧化应激密切相关［15］。为探究右归丸对NS的影响，本研究首先通过阿霉素诱导NS大鼠。结果显示与正常组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白含量显著升高，表明NS模型构建成功。NS中血清BUN、SCr、TC、TG、ALB及尿蛋白含量等是反应肾功能及肾脏病变程度的关键指标［16］。为此，后续通过给予NS大鼠不同剂量右归丸灌胃处理。结果显示与模型组比较，右归丸处理组大鼠血清BUN、SCr、TC、TG水平、24 h尿蛋白含量均显著降低，ALB升高。以上研究结果初步表明右归丸对阿霉素诱导的NS大鼠具有一定的治疗作用。右归丸主要包含熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂、附子10味中药材。研究表明右归丸能够通过改善阿霉素诱导的NS，其机制与调控c-Jun氨基末端酶/p38丝裂原活化蛋白激酶（JNK/p38 MAPK）信号通路，降低肾实质细胞凋亡相关［17］。另外，右归丸能够提高甲状腺功能减退模型大鼠脂质过氧化应激能力，降低体内自由基氧化性损伤［18］。但是有关NS肾损伤中右归丸对氧化应激的调控机制尚不完全清楚。氧化应激重要调控因子ROS能够促进机体释放大量氧化因子，导致血浆白蛋白被氧化成为AOPPs［19］。血浆AOPPs会伴随血液循环沉积至肾脏组织，进而刺激足细胞RAGE表达增加［20］。另外，AOPPs能够上调还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶p47phox、NADPH氧化酶2（NOX2）和NOX4亚基的表达，激活NADPH氧化酶，诱导肾实质细胞内ROS的产生，形成恶性循环［21］。以上研究表明AOPPs在NS肾脏氧化应激损伤中发挥重要作用。因此，本研究进一步检测右归丸对NS大鼠血清AOPPs含量的影响。结果显示与正常组比较，模型组大鼠血清AOPPs含量显著升高。与模型组比较，右归丸组大鼠血清AOPPs含量显著降低，且呈剂量相关性。Wnt/β-catenin信号与细胞分化、凋亡和增殖等生理病理过程密切相关［22-23］。既往研究表明，阿霉素小鼠NS模型中，Wnt/β-catenin信号的激活明显先于蛋白尿的发生，提示Wnt/β-catenin信号通路在蛋白尿中起致病作用［24-25］。基因敲除β-catenin基因小鼠可以免受阿霉素诱导的NS损伤后诱发的蛋白尿［26］。此外，Wnt拮抗剂Dickkopf-1（DKK1）阻断Wnt/β-catenin可以减少阿霉素或血管紧张素Ⅱ给药后的蛋白尿和足细胞损伤［27］。以上研究均共同表明Wnt/β-catenin信号在调节足细胞功能障碍和蛋白尿中的作用。ROS能够刺激IκBα酪氨酸位点磷酸，并激活NF-κB，进而激活Wnt/β-catenin信号通路导致足细胞的损伤［28］。因此，氧化应激产物AOPPs可以通过一系列的下游事件激活Wnt/β-catenin信号通路，这可能是氧化应激导致足细胞损伤和蛋白尿的主要原因。为此，本研究检测了大鼠肾脏组织ROS水平以及RAGE/ROS/NF-κB与Wnt/β-catenin信号相关蛋白表达。结果显示与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织ROS水平、RAGE、p-NF-κB、Wnt、β-catenin蛋白表达均显著升高。与模型组比较，右归丸组大鼠肾脏组织ROS水平、RAGE、p-NF-κB、Wnt、β-catenin蛋白表达均显著降低。以上研究结果表明右归丸能够通过调控RAGE/ROS/NF-κB与Wnt/β-catenin信号，从而改善阿霉素诱导的大鼠NS肾损伤。但是本实验仅从动物层面上初步揭示右归丸的可能作用机制，未进行相关体外细胞实验进一步确证。因此，在后续实验研究中将进一步探究右归丸对NS足细胞损伤的影响。综上所述，本研究通过探究右归丸对阿霉素诱导的NS大鼠的影响及其作用机制。结果显示右归丸能够改善阿霉素诱导的NS大鼠肾损伤，其机制可能与降低AOPPs水平，抑制RAGE/ROS/NF-κB轴以及Wnt/β-catenin信号活化相关。基于以上研究结果为右归丸用于治疗NS提供了新的理论依据。