中药九里香具有行气止痛、活血散瘀的功效，常用于治疗胃痛、风湿痹痛、牙痛，也是中成药“三九胃泰”的主要原料之一。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收载其来源为芸香科九里香属植物九里香Murraya exotica或千里香M. paniculata的干燥叶和带叶嫩枝［1］。九里香主要成分为香豆素类［2］，而千里香为多甲氧基黄酮类［3-4］，九里香与千里香植物的化学成分组成和含量差异较大［5-6］，目前市场中九里香药材的主要来源为千里香的干燥叶和带叶嫩枝。对九里香基原进行鉴定，有助于保障含九里香药材的中成药批间稳定性，确保用药的安全性和有效性。分子鉴别标记不受生物体发育阶段、器官组织差异的影响，具有操作简便、稳定性强的特点，已广泛用于鉴定药用动植物［7-11］、中药种子种苗［12-13］、中药饮片［14-16］，甚至可鉴别中成药［17］、中药配方颗粒［18-21］原料的真伪。邢建永等［22］基于内转录间隔区（ITS）2序列开发了可用于九里香及其同属近缘种鉴别的DNA条形码，通过该DNA条形码可对九里香和千里香进行鉴别。但为实现对九里香药材的所有基原进行快速鉴别，还需建立一种通过一次聚合酶链式反应（PCR）即可同时鉴别九里香和千里香的方法。多重位点特异性PCR可同时扩增和检测多个目的片段，可以节省检验时间、提高实验效率。该方法已成功用于地龙［23］、海龙［24］、石斛［25］等多基原中药的鉴别，以及人参、三七和西洋参的掺杂鉴别［26］。本文基于多重位点特异性PCR技术，建立了一种快速、准确的九里香药材基原鉴别方法。1 材料收集来自广东、广西、四川、云南不同地区的九里香植物样本12批、千里香植物样本15批，共27批，标本保存于中国中医科学院中药资源中心标本馆。九里香、千里香药材来自华润三九医药股份有限公司，各10批。药材样品经中国中医科学院中药资源中心金艳副研究员鉴定，见表1。基因组数据来自本课题组前期测序组装的不同产地九里香、千里香样本的叶绿体基因组。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.T001表1九里香、千里香样本信息Table 1Information of Murraya exotica and M. paniculataNo.物种类型拉丁学名产地数量/批1九里香植物Murraya exotica广东省惠州市12九里香植物M. exotica广东省江门市13九里香植物M. exotica广东省肇庆市14九里香植物M. exotica广西壮族自治区百色市15九里香植物M. exotica广西壮族自治区崇左市16九里香植物M. exotica广西壮族自治区贵港市17九里香植物M. exotica广西壮族自治区桂林市18九里香植物M. exotica四川省宜宾市29九里香植物M. exotica云南省普洱市110九里香植物M. exotica云南省西双版纳傣族自治州211九里香药材M. exotica广东省广州市112九里香药材M. exotica广东省河源市113九里香药材M. exotica广东省揭阳市214九里香药材M. exotica广东省茂名市115九里香药材M. exotica广东省清远市116九里香药材M. exotica广东省云浮市217九里香药材M. exotica广东省湛江市118九里香药材M. exotica广东省肇庆市119千里香植物M. paniculata广东省云浮市320千里香植物M. paniculata广西壮族自治区百色市221千里香植物M. paniculata广西壮族自治区崇左市222千里香植物M. paniculata广西壮族自治区桂林市323千里香植物M. paniculata广西壮族自治区河池市224千里香植物M. paniculata广西壮族自治区贺州市125千里香植物M. paniculata广西壮族自治区柳州市126千里香植物M. paniculata广西壮族自治区玉林市127千里香药材M. paniculata广东省河源市128千里香药材M. paniculata广东省茂名市129千里香药材M. paniculata广东省清远市130千里香药材M. paniculata广东省韶关市131千里香药材M. paniculata广东省云浮市132千里香药材M. paniculata广东省肇庆市133千里香药材M. paniculata广西壮族自治区河池市234千里香药材M. paniculata广西壮族自治区贺州市135千里香药材M. paniculata贵州省黔南布依族苗族自治州1DNeasy® Plant Mini Kit（上海凯杰企业管理有限公司，批号69106）；2×M5 Super FastTaq PCR MasterMix（北京聚合美生物技术有限公司，批号MF164-01）；2×Taq PCR Master Mix（北京艾德莱生物科技有限公司，批号PC0902）； LA Taq HS、SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶（日本Takara公司，批号分别为RR042A、RR070A）；10 000×CelRed in water核酸染料（北京兰博利德生物技术有限公司，批号CR001）；Trans2K DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号BM101）。Verti 96型、GeneAmp® 9700型PCR仪（美国Applied Biosystem公司），TC-512型PCR仪（上海Techne公司），PTC-100™型PCR仪（美国Gene公司），NanoDrop® ND-1000型微量紫外-可见分光光度计（美国Thermo Scientific公司），PowerPac Basic型电泳仪、Bio-Rad凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　引物设计本课题组前期基于九里香、千里香叶绿体基因组和IdenDSS软件，筛选出九里香、千里香的单核苷酸多态性（SNP）位点，使用Primer Premier 5.0软件［27］设计特异性鉴别引物，得到能特异性鉴别九里香的鉴别引物对P03-EF/P03-R、千里香的鉴别引物对P04-PF/P04-R，见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.T002表2九里香、千里香特异性鉴别引物Table 2Specific primerof Murraya exotica and M. paniculata靶向物种引物名称序列（5'-3'）长度/bp九里香P03-EF上游ATTCTCCCGTTGCAATCGTC330P03-R下游CTGGTACCAAGATCGAGCCC千里香P04-PF上游CCGGGTCGGCAAATTA230P04-R下游CGGGTTTTGGTTCACACGAC注：T为人为引入的错配碱基2.2　基因组DNA提取将样品研磨成粉末，取粉末约20 mg放入2 mL离心管，按照DNeasy® Plant Mini Kit说明书提取总DNA，并使用NanoDrop® ND-1000型微量紫外-可见分光光度计测定浓度，判断DNA质量。DNA放入-20 ℃冰箱保存备用。2.3　多重PCR扩增条件的确定使用上述2对鉴别引物对九里香、千里香总DNA模板进行扩增，初始PCR反应体系25 μL，包含2×M5 Super FastTaq PCR MasterMix 13 μL，九里香特异性鉴别引物上、下游各0.2 μL，千里香特异性引物上下游各0.4 μL，DNA模板1.5 μL，双蒸灭菌水9.3 μL。PCR反应结束后，取反应产物5 μL点样于CelRed核酸染料染色的2.0%琼脂糖凝胶上，200 V电压条件下电泳30 min，置BIORAD凝胶成像系统观测。使用九里香、千里香鉴别引物对九里香和千里香样品DNA进行扩增，分别考察了①退火温度58、60、62、64 ℃；②PCR循环次数31、33、35、37个循环；③九里香P03与千里香P04鉴别引物比（引物总量为上下游各0.6 μL），2∶1、1∶1、1∶2、1∶3；④Taq酶种类，2×M5 Super FastTaq PCR MasterMix、2×Taq PCR Master Mix、TAKARA LA Taq HS、SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶；⑤PCR仪型号GeneAmp® 9700型、TC-512型、PTC-100™型、Verti 96型。最终确定的25 μL PCR反应体系为2×M5 Super FastTaq PCR MasterMix 13 μL，九里香特异性引物上下游各0.2 μL，千里香特异性引物上下游各0.4 μL，DNA模板1.5 μL，双蒸灭菌水9.3 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min；94℃ 变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，31个循环；产物末端72 ℃延伸5 min。2.4　方法适用性考察采用上述条件考察后所确定的最佳反应体系和反应条件参数，进行九里香、千里香多重特异性PCR鉴别的适用性实验考察，对收集的12批九里香和15批千里香植物样本，及各10批九里香、千里香来源药材样品进行检测鉴别，考察该体系的适用性。3 结果与分析3.1　PCR鉴别条件的确定3.1.1　退火温度设置PCR反应退火温度分别为58、60、62、64 ℃进行考察，结果表明，退火温度在58~60 ℃时，九里香和千里香样本均可分别获得330、230 bp的特异性条带，空白对照均无条带，见图1。确定九里香药材多重特异性PCR鉴别退火温度为60 ℃。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F001图1退火温度对九里香药材多重特异性PCR鉴别的影响Fig.1Influence of annealing temperature on Murrayae Folium et Cacumen of specific identification注：M.Trans2K DNA Marker；1~5.九里香；6~10千里香；11.空白（双蒸灭菌水）（图2-图5同）3.1.2　循环次数当PCR反应循环为31~37个时，所有样本均可见对应条带，空白对照均无条带。但35~37个循环时，部分九里香样本出现230 bp假阳性条带，见图2。为保证结果的准确性，确定PCR循环次数为31个循环。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F002图2循环次数对九里香药材多重特异性PCR鉴别的影响Fig.2Influence of thermo cycles number on Murrayae Folium et Cacumen of specific identification3.1.3　引物浓度比九里香P03和千里香P04引物比为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3时，九里香和千里香均可分别获得330、230 bp的特异性条带，空白对照均无条带，见图3。增加千里香鉴别引物比例可在一定程度上提高千里香特异性条带亮度，而对九里香的特异性鉴别结果影响较小，综合两者特异性条带的亮度，确定PCR反应体系中两者引物比为1∶2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F003图3引物比对九里香药材多重特异性PCR鉴别的影响Fig.3Influence of primers ratio on Murrayae Folium et Cacumen of specific identification3.2　方法耐受性实验考察3.2.1　Taq酶种类考察使用2×M5 Super FastTaq PCR MasterMix，2×Taq PCR Master Mix进行扩增均可获得特异性鉴别结果，不同酶表现出的扩增条带亮度有差异。使用高保真的LA Taq HS DNA聚合酶可特异性鉴别九里香，而无法鉴别千里香。使用高保真的SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶时所有样本除出现对应特异条带外均出现另一假阳性条带，见图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F004图4Taq酶种类对九里香药材多重特异性PCR鉴别的影响Fig.4Influence of different kinds of Taq polymerases on Murrayae Folium et Cacumen of specific identification3.2.2　PCR仪考察分别用GeneAmp® 9700型，TC-512型，PTC-100™型，Verti 96型PCR仪进行扩增，所有样品均可得到特异性鉴别条带，空白对照无条带，表明以上4种PCR仪均能进行鉴别，见图5。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F005图5不同PCR仪对九里香药材多重特异性PCR鉴别的影响Fig.5Influence of thermocyclers on Murrayae Folium et Cacumen of specific identification3.3　适用性考察使用确定的最优PCR体系和条件对不同地区的九里香、千里香植物样本和药材样本进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现九里香样本均出现约330 bp的特异性鉴别条带，千里香均出现约230 bp的特异性鉴别条带，不同地区来源的样品结果一致，表明该体系能准确鉴别九里香和千里香，见图6。10.13422/j.cnki.syfjx.20221012.F006图6九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别Fig.6Multiplex allele-specific PCR identification results of Murrayae Folium et Cacumen注：M.Trans2k DNA Marker；1~12.九里香样品；13~22.九里香药材样品；23~37.千里香样品；38~47.千里香药材样品；48.空白（灭菌双蒸水）4 讨论本文对九里香、千里香叶绿体基因组进行比对分析，筛选SNP位点设计特异性PCR鉴别引物，并分别对影响PCR扩增的体系及条件进行优化和考察，确定最佳PCR体系和条件，建立九里香药材的多重位点特异PCR鉴别方法。DNA模板量及其质量也是影响多重PCR扩增的重要因素之一。经测定，本文提取的九里香样品DNA浓度为3.5~29.1 mg·L-1，千里香样品DNA浓度为2.6~19.2 mg·L-1。在本文的25 μL PCR反应体系中，九里香DNA样本使用5~44 ng均可获得特异性扩增条带，千里香DNA样本使用4~29 ng均扩增获得特异性结果。此外，由于部分九里香样本易在180~200 bp处出现模糊暗条带，在琼脂糖凝胶浓度较低及电泳时间较短时，与230 bp千里香特异性鉴别条带分离度不好，容易对千里香的鉴别结果产生误判，因此选择2.0%琼脂糖凝胶，电泳30 min对PCR产物进行检测。使用本文建立的多重特异性PCR鉴别方法进行检测，九里香样品凝胶电泳图谱均可见约330 bp的特异性鉴别条带，千里香样品则可见约230 bp的特异性鉴别条带，样品的特异性PCR鉴别结果与形态学鉴别结果一致，表明方法具有可靠性和稳定性。该多重位点特异性PCR鉴别方法操作简便、准确性好、特异性高，通过一次PCR反应即可鉴别九里香、千里香。多基原现象在中药中十分常见，但药材的多基原鉴别仍然是中药鉴定的一大挑战。建立合适的多基原药材鉴别方法，有助于科学、客观解决中药长期存在的同名异物问题，逐步实现“一药一名一标准”［28］。当前2020年版《中国药典》收载了144种多基原药材，仅有75种记载了其多基原鉴别方法，其中70种收载了性状鉴别方法，30种收载有显微鉴别方法，6种有理化鉴别方法，1种有分子鉴别方法［29］。与传统鉴别方法相比，分子鉴定准确性好、灵敏度高，在药材的多基原鉴别中具有广阔的应用前景，且已在砂仁［30］、泽泻［31］、老鹳草［32］等药材的多基原鉴别中得到应用。本文建立的九里香药材不同基原鉴别方法也可为多基原药材的鉴别提供补充。