自然流产（SA）与人工流产相对应，是指未经人工的干预，因自然因素而导致的流产。自然流产的发病过程复杂，病理因素较多，其发病机制至今未明，普遍认为是由基因遗传、解剖因素、感染因素、激素失衡、母体内分泌失调、母胎免疫功能失常和环境因素相互影响的结果［1-4］。近来研究发现，自然流产与母胎免疫失衡和异常炎症反应等密切相关，辅助性T细胞1/辅助性T细胞2（Th1/Th2）的失衡影响母胎免疫耐受，是诱导自然流产的重要原因之一，其发病率呈现逐年递增的趋势［5-8］。而其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是导致炎症发生的关键信号通路，p38 MAPK也是MAPK信号大家族的重要成员之一，p38 MAPK活化能诱导大量炎症细胞因子的表达，诱导Th1细胞分化，调控Th1/Th2的平衡，在母胎免疫调节和炎症反应中发挥着关键调节作用［9］。中医药治疗流产历史悠久，对于妊娠保胎疗效显著，先前大量的动物实验研究均可表明中医药可以通过生殖内分泌的功能调节、免疫因子的功能调节、改善胎盘微循环障碍等方面来干预自然流产。而在自然流产中血热型较为常见，中原庞氏妇科流派认为“热”贯穿妊娠病的全过程。结合女性妊娠期间的特殊生理以及病理特点，将体质与病症相结合，中原庞氏妇科流派创立了“庞氏安胎止血汤”，强调以“清热安胎”为治疗大法，兼以理气、健脾、补肾，达到“清热止血、养血安胎”的治疗效果。初步研究表明，庞氏安胎止血汤治疗热证自然流产能明显降低流产率，其作用机制与母胎界面T细胞亚群CD4+、CD8+的表达水平密切相关［10］，同时庞氏安胎汤可通过对先兆流产大鼠血清免疫因子水平的调节，使Th1/Th2值偏向Th2［11］。本实验希望在前期研究的基础上，更加深入研究庞氏安胎止血汤治疗热证自然流产的效应机制，通过建立热证自然流产大鼠模型，揭示庞氏安胎止血汤通过调控p38 MAPK介导的炎症信号通路的激活，抑制免疫炎症因子的释放，调节Th1/Th2的平衡，继而达到安胎的作用。1 材料1.1　动物SPF级雌性未产大鼠100只，8~10周龄，体质量（262±20.12） g，SPF级雄性大鼠50只，8~10周龄，体质量（260±20） g，均由郑州大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（豫）2015-0005，本研究经河南中医药大学动物伦理委员会批准，批准号DWLL202010161。1.2　药物及试剂庞氏安胎止血汤由黄芩10 g（批号1908221）、知母30 g（批号1911192）、金银花30 g（批号191004）、蒲公英30 g（批号190801）、荷叶10 g（批号1909192）、旱莲草30 g（批号1907132）、藕节30 g（批号1903092）、升麻6 g（批号1911131）、紫苏梗15 g（批号1911292）、白术10 g（批号191007）、山茱萸30 g（批号1909023）、白芍10 g（批号191001）、甘草4 g（批号191006）组成；附子10 g（批号191015）、干姜10 g（批号200701）、肉桂10 g（批号皖20160095）；以上药材均由安徽人民中药饮片有限公司生产，由河南中医药大学第一附属医院中药饮片房提供，经河南中医药大学药学院王磊主任鉴定，符合2020年版《中华人民共和药典》相关规定；米非司酮片（武汉九珑人福药业有限公司，批号07201001）；地屈孕酮片、阿司匹林片（拜耳医药保健有限公司，批号分别为363433、BJ60888）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，批号C1210422B1）；水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，批号H37022673）；苏木素染色液、伊红染色液（福州飞净生物科技有限公司，批号分别为190805、20211009）；人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）测定试剂盒（北京冬歌博业生物科技有限公司，批号20200410A）；P、E2测定试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，批号分别为AD1795Mo、AD3212Mo）；IFN-γ、IL-4测定试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号分别为CSB-E04579r、CSB-E04635r）；兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、GATA结合蛋白3（GATA3）、T盒转录因子（T-bet）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-0637R、bs-0636R、bs-1452R、bs-1104R）。1.3　仪器KZ-Ⅱ型研磨仪、D1008E型掌上离心机、MS-PB型磁力搅拌器（武汉赛维尔生物科技有限公司）；RT-6100型酶标仪（美国Rayto公司）；6300型化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。2 方法2.1　动物分组、模型复制及给药参考文献［12］方法制备热证自然流产大鼠模型。发现阴道栓或精子者定为妊娠第1天，并将受孕大鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组、地屈孕酮组、庞氏安胎止血汤低、中、高剂量组7组，每组10只。将1.2项的中药材加入12倍蒸馏水并浸泡60 min，加热至沸腾，微沸煎煮60 min后过滤煎液，再加6倍蒸馏水，如前操作，滤出煎液，合并2次滤液并浓缩成相当于庞氏安胎止血汤生药量1.5 g·mL-1（体积120 mL）。按照人和动物间体表面积折算系数换算，分别以庞氏安胎止血汤临床给药剂量的1、2和4倍换算，分别设为庞氏安胎止血汤低、中、高剂量组（1.5、3、6 g·mL-1）。正常组孕1~12 d每天上午灌服4 mL蒸馏水，其余各组灌服4 mL附子、干姜、肉桂水煎剂（1 g·mL-1生药，附子-干姜-肉桂1∶1∶1）；下午正常组和模型组灌服蒸馏水，中药低、中、高组分别15 mL·kg-1·d-1的庞氏安胎止血汤灌胃大鼠，阿司匹林组按照5.25 mg·kg-1·d-1剂量灌胃阿司匹林溶液；地屈孕酮组按照3.02 mg·kg-1·d-1剂量灌服地屈孕酮溶液。孕13 d，除正常组外，其余各组分别灌服米非司酮3.75 mg·kg-1·d-1。2.2　样本采集各组大鼠在灌胃米非司酮溶液24 h后，给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL·kg-1）大鼠，采腹主动脉血5~6 mL，于室温内静置2 h后使用离心机以3 000 r·min-1离心20 min（离心半径10 cm，下同），并将上面血清吸取后置于微型离心管中，-20 ℃冰箱中冻存。采血后迅速打开腹腔，在无菌操作下切开孕鼠子宫，分离蜕膜组织等，观察胚胎大小、出血以及吸收情况等，计数存活胚胎数和死胎数。2.3　ELISA检测血清β-HCG、P、E2、IFN-γ、IL-4水平采用ELISA检测大鼠血清中β-HCG、P、E2、IFN-γ、IL-4的水平，按照试剂盒说明书进行检测。2.4　苏木素-伊红（HE）染色观察组织病理学变化将新鲜蜕膜组织洗净，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脱水，常规制备石蜡包埋切片，进行HE染色，光学显微镜下观察蜕膜组织病理学变化。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测p38 MAPK及其磷酸化、GATA3、T-bet蛋白表达水平将蜕膜组织块用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2~3次，处理后置于匀浆管中，将10倍组织体积的裂解液加入，设置匀浆程序进行匀浆；匀浆后，放置冰上裂解液30 min，每隔5 min震荡一次以确保组织完全裂解；12 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液。将蛋白经过SDS-PAGE电泳后进行转膜，随后将其放入装有TBST的孵育槽中，快速涮洗1次，然后加入脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30 min；按说明书进行一抗稀释后，4 ℃孵育摇床过夜；用TBST快速涮洗膜3次，再加入TBST，每次5 min，快速洗脱3次，曝光匣两层薄膜之间放置PVDF膜的蛋白，将混合好的ECL溶液加入充分反应1~2 min，残液去净后开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。对胶片进行扫描并存档，采用Photo Shop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的灰度值。2.6　统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计处理，所有数据以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对SA大鼠激素水平的影响与正常组比较，模型组血清β-HCG、P、E2水平均显著降低（P0.01）；与模型组比较，除阿司匹林组的P、E2值，其余组别的血清β-HCG、P、E2水平均明显升高，差异有明显统计学意义（P0.05）。与阿司匹林组比较，地屈孕酮组β-HCG显著降低（P0.01），地屈孕酮组、庞氏安胎止血汤高、中、低组P、E2显著升高（P0.01）；与庞氏安胎止血汤中剂量组比较，地屈孕酮组、庞氏安胎止血汤低剂量组、阿司匹林组β-HCG、P、E2显著降低，差异有显著统计学意义（P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.T001表 1庞氏安胎止血汤对SA大鼠血清β-HCG、P、E2水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of Pangshi Antai Zhixue decoction on β-HCG， P and E2 levels in serum of SA rat （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1β-HCG/U·L-1P/μg·L-1E2/ng·L-1正常组1.90±0.080.15±0.021.26±0.05模型组1.32±0.062）0.08±0.012）0.59±0.062）阿司匹林组5.251.74±0.074）0.06±0.013）0.60±0.04地屈孕酮组3.021.53±0.084，6，8）0.10±0.014，6，8）0.80±0.094，6，8）庞氏安胎止血汤高剂量组11 0001.82±0.044）0.09±0.016，8）1.03±0.164，6）庞氏安胎止血汤中剂量组22 0001.88±0.114，6）0.14±0.0242，6）1.11±0.044，6）庞氏安胎止血汤低剂量组44 0001.77±0.064，8）0.10±0.013，6，8）0.82±0.104，6，8）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01；与阿司匹林组比较5）P0.05，6）P0.01；与庞氏安胎止血汤中剂量组比较7）P0.05，8）P0.01（表2-表4同）3.2　对SA大鼠蜕膜组织病理形态的影响正常组结构清晰、无明显异常、无炎症细胞浸润；模型组组织坏死、不连贯，上皮细胞脱落，有较多炎性细胞浸润，内膜下的小血管有部分迂曲、增粗、充血；阿司匹林组结构较规整，间质部有轻度水肿、较致密，细胞分布较均匀，偶见微血管扩张、充血，损伤较模型组轻；地屈孕酮组可见较少炎症细胞浸润，未见明显渗血、渗液，内膜损伤明显减轻；庞氏安胎止血汤高剂量组间质部有水肿、较致密，微血管扩张、充血，损伤较模型组轻；庞氏安胎止血汤中剂量组子宫内膜损伤未见明显渗血、渗液及坏死，细胞浸润基本消失，炎症程度明显减轻；庞氏安胎止血汤低剂量组间质部有轻度水肿，少许微血管扩张、充血，内膜损伤明显减轻。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.F001图 1庞氏安胎止血汤对SA大鼠蜕膜组织病理形态的影响 （HE，×400）Fig. 1Effect of Pangshi Antai Zhixue decoction on pathological morphology of decidual tissues in SA rats （HE，×400）注：A.模型组；B.正常组；C.阿司匹林组；D.地屈孕酮组；E.庞氏安胎止血汤高剂量组；F.庞氏安胎止血汤中剂量组；G.庞氏安胎止血汤低剂量组（图2同）3.3　对SA大鼠胎鼠情况的影响与正常组比较，模型组活胎数显著降低，流产数及流产率显著升高（P0.01）；与模型组比较，经药物干预后，各组活胎数均有升高，流产数及流产率均显著降低（P0.01）；与阿司匹林组比较，庞氏安胎止血汤中剂量组大鼠活胎数显著升高（P0.01），流产数及流产率明显降低（P0.05，P0.01）。与庞氏安胎止血中剂量组比较，庞氏安胎止血汤高剂量组地屈孕酮活胎数显著降低（P0.01），地屈孕酮组、庞氏安胎止血汤高、低剂量组流产数及流产率明显升高（P0.05）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.T002表 2庞氏安胎止血汤对SA大鼠胎鼠情况的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of Pangshi Antai Zhixue decoction on fetal in SA rats （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1活胎数/个流产数/个流产率/%正常组11.71±1.600.43±0.533.51±4.41模型组3.43±0.982）7.57±1.132）68.78±2.882）阿司匹林组5.257.71±1.254）2.29±1.254）22.27±12.104）地屈孕酮组3.028.14±1.224，8）2.29±1.384，7）20.49±8.814，7）庞氏安胎止血汤高剂量组11 0006.00±1.164，5，8）2.57±0.984，8）29.68±8.994，8）庞氏安胎止血汤中剂量组22 00010.29±1.114，6）1.00±0.824，5）8.98±7.834，6）庞氏安胎止血汤低剂量组44 0009.00±1.294）2.29±0.954，7）20.30±7.844，7）3.4　对SA大鼠血清FN-γ、IL-4水平的影响与正常组比较，模型组中IFN-γ水平显著升高（P0.01），IL-4水平显著降低（P0.01）；与模型组比较，其余各组中IFN-γ水平显著降低，IL-4水平显著升高（P0.01），其中庞氏安胎止血汤中剂量组最显著；与阿司匹林组比较，地屈孕酮组及庞氏安胎止血汤中剂量组IFN-γ水平显著降低（P0.01），地屈孕酮组、庞氏安胎止血汤高、中组IL-4水平显著升高（P0.01）；与庞氏安胎止血汤中剂量组比较，低剂量组IFN-γ显著升高（P0.01），地屈孕酮组、高、低剂量组IL-4显著降低（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.T003表 3庞氏安胎止血汤对SA大鼠血清FN-γ、IL-4水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of Pangshi Antai Zhixue decoction on FN-γ， IL-4 levels in SA rat serum （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1IFN-γIL-4正常组0.99±0.1911.26±0.91模型组3.77±1.172）1.66±0.862）阿司匹林组5.252.12±0.284）4.61±0.524）地屈孕酮组3.020.99±0.134，6）3.01±0.534，6，8）庞氏安胎止血汤高剂量组11 0001.47±0.114）6.05±0.544，6，8）庞氏安胎止血汤中剂量组22 0000.87±0.254，6）10.67±1.234，6）庞氏安胎止血汤低剂量组44 0001.68±0.094，7）4.91±0.354，8）ng·L-13.5　对SA大鼠蜕膜组织p38 MAPK及其磷酸化、GATA3、T-bet蛋白水平的影响与正常组比较，模型组脱模p-p38 MAPK、T-bet蛋白水平表达显著升高，GATA3蛋白水平表达显著降低，差异具有统计学意义（P0.01）。与模型组比较，地屈孕酮片组、阿司匹林组、庞氏安胎止血汤高、中、低剂量组脱模组织中p-p38、T-bet蛋白表达显著降低，GATA3蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义（P0.01）。与阿司匹林组比较，庞氏安胎止血中剂量组蜕膜组织中p-p38 MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义，T-bet、GATA3蛋白水平表达显著降低（P0.01）；与庞氏安胎止血汤中剂量组比较，高、低剂量组p-p38 MAPK、T-bet蛋白表达水平升高（P0.01），GATA3蛋白水平表达显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。见表4和图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.T004表 4庞氏安胎止血汤对SA大鼠蜕膜组织p38 MAPK及其磷酸化、GATA3、T-bet蛋白水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 4Effect of Pangshi Antai Zhixue decoction on p38 MAPK and its phosphorylation， GATA3 and T-bet protein levels in decidual tissue of SA rats （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1p-p38 MAPK/p38 MAPKGATA3/β-actinT-bet/β-actin正常组0.32±0.030.31±0.020.24±0.03模型组0.72±0.072）0.08±0.012）0.71±0.062）阿司匹林组5.250.48±0.034）0.52±0.044）0.34±0.014）地屈孕酮片组3.020.46±0.034）0.47±0.034，6）0.26±0.044，5）庞氏安胎止血汤高剂量组11 0000.57±0.064，6，8）0.43±0.024，6，8）0.54±0.124，6，8）庞氏安胎止血汤中剂量组22 0000.44±0.064）0.47±0.024，6）0.25±0.024，6）庞氏安胎止血汤低剂量组44 0000.57±0.064，6，8）0.18±0.014，6，8）0.46±0.084，6，8）10.13422/j.cnki.syfjx.20221101.F002图 2各组大鼠蜕膜组织p38 MAPK及其磷酸化、GATA3、T-bet蛋白水平电泳Fig. 2Electrophoresis of p38 MAPK and its phosphorylation， GATA3 and T-bet protein levels in decidual tissue of rats4 讨论《景岳全书·妇人规》曰：“凡胎热者，血易动，血动者，胎不安。”，中医内外因学说认为，血热型自然流产的内因为素体阳盛血热，或阴虚内热，或肝郁化热，外因为孕后过食辛辣，或因孕后感受热邪，热扰冲任，伤及胎元，而至胎元不固［10，13］。早于清·乾隆五十年（1785年），便出现了中原庞氏妇科，因善用“清热祛湿”之法而著称，其中“庞氏安胎止血汤”则为“清热安胎”思想的代表方剂。庞氏妇科认为妇人胎前易生热；妊娠气必滞；胎前之虚，主要责之肾、胃、脾、肝；形成妊娠病的主要发病机制［14-15］。其中“热”贯穿妊娠病的全过程。在保胎治疗中，结合体质与病症，中原庞氏妇科流派以“清热止血、养血安胎”为治则，兼理气、健脾、补肾，创立了“庞氏安胎止血汤”［10］。方药：黄芩10 g，金银花30 g，蒲公英30 g，荷叶10 g，升麻6 g，紫苏梗15 g，知母30 g，白芍10 g，白术10 g，山茱萸30 g，藕节30 g，旱莲草30 g，甘草3 g。庞氏安胎止血汤配伍巧妙，用药精准灵活，且自乾隆年间至今相传久远，临床上对于热证自然流产的治疗效果显著［16-17］。根据分泌细胞因子优势效应的不同，Th细胞可分为Thl和Th2型细胞［18］。Th1、Th2的分化受需要特异性转录因子的活性［19］，其中T-bet、GATA3最为关键［20］。T-bet是转录因子T-box家族的成员，在初生CD4+T细胞中的表达使其分化为Th1细胞，进而产生非常重要的细胞因子，如IFN-γ、IL-1和肿瘤坏死因子（TNF），帮助诱导细胞免疫应答［21］。IFN-γ是Th1的特征细胞因子，促进巨噬细胞活化，诱导淋巴细胞介导的细胞免疫和细胞增殖抑制作用，促进炎症反应的发生［22］。T-bet在调节IFN-γ的产生中起重要作用［23］。GATA3，是锌指转录因子家族中的一员，是胸腺和周围组织中Th2细胞分化的主要激活因子，部分是通过产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13，其中IL-4是Th2细胞的一种信号细胞因子，是抗寄生虫免疫和过敏性疾病中宿主反应的关键因素，被鉴定为Th2发育的关键调控因子［24-25］。主要介导体液免疫，促进抗体形成，抑制免疫炎症。由此可见，T-bet/GATA3比值可调节Th1/Th2的平衡［26］，可作为准确反映Th1/Th2失衡与漂移的指标［27］。从本实验研究结果中可见，与正常组比较，模型组中IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显降低；与模型组比较，其余各组中IFN-γ水平明显降低，IL-4水平明显升高，其中庞氏安胎止血汤中剂量组最显著。结果提示经药物干预后，尤其是庞氏安胎止血汤中剂量组，通过调节Th1/Th2比值向Th2偏移。既往研究与本文研究一致［11］。同时大鼠蜕膜组织中Th1亚群特异性核转录因子T-bet蛋白水平经庞氏安胎止血汤干预后表达降低，Th2亚群特异性核转录因子GATA3蛋白水平表达升高，来调控T细胞向Th2亚群偏移。研究发现，母胎免疫炎症反应伴随MAPK等的活化及磷酸化，之后转移至细胞核内调控炎症细胞因多种基因和蛋白的表达［28］。广泛存在于细胞中的MAPK信号传导通路，包括p38 MAPK、细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶（JNK/SAPK）和ERK5，参与细胞生长、发育、分裂分化等多种过程［29-31］。近期研究发现，MAPK信号通路是促进炎症发生的关键信号通路，而p38 MAPK是MAPK信号家族的主要成员之一，为双磷酸化三肽模体“T-G-Y”结构，在细胞内具有生物进化的高度保守性，受到理化因素、症性因子应激等外界刺激时发生磷酸化而激活，从而参与多种生物学效应，如调控炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等［32-33］。本研究发现，与正常组比较，模型组脱模p-p38 MAPK、T-bet蛋白水平表达显著升高，GATA3蛋白水平表达显著降低，差异具有统计学意义。与模型组比较，地屈孕酮片组、阿司匹林组、庞氏安胎止血汤高、中、低剂量组脱模组织中p-p38 MAPK、T-bet蛋白表达显著降低，GATA3蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义。与阿司匹林组比较，庞氏安胎止血中剂量组蜕膜组织中p-p38 MAPK蛋白水平表达无明显差异，T-bet、GATA3蛋白水平表达显著降低。结果显示，庞氏安胎止血汤调节p38 MAPK通路抑制热证模型诱导的胎膜组织的炎症反应。其中p38 MAPK活化能诱导大量炎症细胞因子的表达，如IFN-γ等，通过调控Th1/Th2的平衡，在母胎免疫调节和炎症反应中发挥着关键调节作用［34］。综上所述，本研究提示，庞氏安胎止血汤保胎效果显著，其可能通过调控p38 MAPK介导的炎症信号通路的激活，缓解病理损伤，下调p-p38 MAPK、T-bet蛋白水平的表达，抑制Th1细胞水平（IFN-γ），上调GATA3蛋白水平的表达，增强Th2细胞水平（IL-6）、逆转诱导调节Th1/Th2的平衡，从而达到安胎的作用。