肺纤维化是一种进行性肺间质性炎症性疾病，也是2019年新型冠状病毒肺炎重症患者的后遗症之一［1］。西医在治疗此类型疾病中可供选择的药物较少，尼达尼布和吡非尼酮是美国食品药品监督管理局推荐用于治疗肺纤维化的仅有的2种已知药物，然而这些药物不仅价格昂贵，且临床疗效不确切，常在临床应用过程中产生一些不良反应，最常见的是胃肠道疾病，包括腹泻，恶心和呕吐［2］。因此，发掘有效、安全的治疗药物，具有重要的临床价值和意义。中医药治疗肺纤维化历史悠久，治疗以辨证论治为主，具有低毒、多层次、多靶点等优点，在临床应用中具有独有的优势［3-4］。保肺康颗粒以生脉散合当归贝母苦参丸加减化裁而来，是首都国医名师武维屏教授在临床上治疗肺纤维化的多年临床经验方［5］，全方益肺肾、化痰瘀、通肺络，可治疗肺肾虚寒，水泛为痰，痰瘀阻络，或年迈阴虚，血气不足，外受风寒，咳嗽、喘逆多痰。本课题组前期临床研究表明，较单纯西医治疗慢阻肺-特发性肺纤维化合并患者相比，保肺康颗粒合西医治疗能明显改善患者的肺功能和动脉血氧分压，从而提高患者的肺功能和生活质量［6］。基础实验中本研究通过气道内注射博莱霉素建立肺纤维化大鼠模型，染色观察发现保肺康颗粒可以显著改善大鼠肺组织内纤维化程度，但其作用的机制与靶点尚不明确。本研究拟采用中药网络药理学方法，预测保肺康颗粒治疗肺纤维化的潜在核心成分、作用的关键靶点和相关分子通路；通过拟肺纤维化大鼠模型进行动物验证，阐明保肺康颗粒治疗肺纤维化的潜在机制，以期为保肺康颗粒治疗肺纤维化的作用机制提供方法和理论依据。1 材料1.1　动物鼠龄为4~5周的雄性SD大鼠24只，体质量约120 g，购买于北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0010。饲养于北京中医药大学屏障环境动物室，自由饮水进食。本实验通过了北京中医药大学伦理委员会审查批准，批号BUCM-4-2019030702-1080。1.2　药物保肺康颗粒组成为党参30 g、五味子10 g、麦冬10 g、清半夏9 g、当归15 g、浙贝母10 g、苦参10 g、连翘12 g、皂角刺10 g、前胡10 g、紫苏子10 g、红景天15 g（北京康仁堂药业有限公司，批号分别为130675322、130675012、130675419、130675178、130675347、130675303、130675369、130675146、130675295、130675358、130675373、130675209）；醋酸泼尼松片（山东新华制药股份有限公司，批号1907088）；硫酸博来霉素（美国Bioruler公司，货号H73019-10MG）。1.3　试剂一抗兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体、小鼠抗大鼠蛋白激酶B（Akt）抗体（Proteintech公司，货号分别是60225-1-lg、10176-2-AP）；柠檬酸盐修复液（pH 6.0）、兔二步法检测试剂盒、DAB试剂盒、苏木素-伊红（HE）试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号分别为ZLI-9064、PV-9001、ZLI-9018、BSBA-4025）；磷酸盐缓冲液（PBS）、中性树胶（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为P1010、G8590）。1.4　仪器VIP-6型脱水机（日本樱花科技有限公司），KD-BM型组织包埋机（中国科迪仪器设备有限公司），RM2016型病理切片机（德国徕卡公司），KPJ-14型烤片机（天津爱华医疗器械有限公司），BX60型正置显微镜（日本Olympus公司）。2 方法2.1　保肺康颗粒药物活性成分和靶点收集①将党参、五味子、清半夏、当归、浙贝母、苦参、连翘、皂角刺、前胡、紫苏子作为关键词分别输入中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18作为条件［7］，筛选出这些中药全部的活性成分和相对应的靶基因。使用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）和计算机Perl语言处理获得筛选后活性成分相对应的靶基因名称。②麦冬、红景天作为关键词输入中药分子机制生物信息学分析网络（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）［8］，检索条件为score cutoff≥20，Pvalue cutoff0.05，筛选出中药的核心成分与对应的靶基因。③将以上所有得到的筛选结果合并，从而收集得到保肺康颗粒所有药物活性成分和靶点基因。2.2　肺纤维化疾病的靶点收集在人类基因数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传靶点数据库（OMIM，https：//db.idrblab.org/ttd/）、遗传药理学与药物基因组学数据库（PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org）、药物作用靶点数据库（DrugBank，https：//www.drugbank.ca）和治疗靶标数据库（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd）中以“idiopathic pulmonary fibrosis”为关键词进行检索，获得肺间质纤维化的疾病靶点。2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及关键基因筛选利用R软件（4.1.1）查找保肺康颗粒和肺间质纤维化的重合靶点基因，绘制韦恩图。将保肺康颗粒靶基因-肺纤维化靶基因导入STRING（https：//string-db.org），选择最高等置信度为0.900，获得PPI文件进行分析。将下载的文件导入Cytoscape，使用cytoNCA插件计算中介中心性（BC）、接近中心性（CC）等关键值，值越高，说明该节点在PPI网络中越核心［9-10］。根据其中位值筛选，得到PPI网络核心基因。2.4　“保肺康颗粒关键活性成分-核心靶基因”网络构建将保肺康颗粒关键活性成分和关键靶基因对应关系导入Cytoscape软件，构建“保肺康颗粒关键活性成分-核心靶基因”网络，使用CentiScape计算活性成分度值（DC）。Strawberry Perl软件对DC值前10位的有效成分作为关键活性成分与PPI筛选出的核心靶基因进行处理，得到保肺康颗粒关键活性成分-核心靶基因对应关系。2.5　基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将保肺康颗粒和肺间质纤维化的重合靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG通路分析及GO富集分析，获得与保肺康颗粒治疗肺间质纤维化显著富集的相关通路和生物学过程，P0.05表示差异具有统计学意义。利用R软件（4.1.1）绘制饼状图和柱状图。2.6　肺纤维化大鼠模型的制备及其分组适应性饲养1周后，采用随机数字表法将24只SD大鼠随机分为4组：正常组、肺纤维化模型组、保肺康颗粒组、醋酸泼尼松组。拟肺纤维化大鼠模型采用气管内滴注硫酸博莱霉素溶液（5 mg·kg-1）的方法制备［11］，给予2%戊巴比妥钠液腹腔注射麻醉（麻醉剂量50 mg·kg-1），将大鼠仰卧固定于鼠板，将板头侧抬高45～60°，左手拉紧大鼠舌头，右手持16号套管，延其弧度紧贴上颚行气管插管。插管成功后在导管连接处连接注射器，注入硫酸博来霉素溶液0.2 mL，正常组大鼠气管插管后注入生理盐水。通过HE染色观察肺组织的纤维化程度，并结合大鼠的饮食、活动及呼吸困难等情况来评估模型制备的成功率。密切监测大鼠的生命状态，待大鼠清醒后常规饲养。保肺康颗粒组予最佳剂量27.18 g·kg-1·d-1灌胃［12］，醋酸泼尼松组给予1.17 mg·kg-1·d-1灌胃，正常组和肺纤维模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续21 d。2.7　HE染色检测相关病理变化实验结束后准备取材，常规麻醉后，取每组6只大鼠以多聚甲醛心脏灌注固定用于病理染色，随后将固定的左侧肺组织行冠状面取材、修块、脱水、石蜡包埋。对肺组织的石蜡块进行连续冠状切片，片厚约4 μm，然后对切片进行HE染色。光学显微镜下观察和记录细胞形态的变化。2.8　免疫组化（IHC）检测相关蛋白表达常规切片后选片进行IHC染色。烤箱脱蜡、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、PBS水洗、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断剂孵育、封闭血清封闭、一抗孵育4 ℃过夜（PI3K 1∶200、Akt 1∶300），辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、DAB显色（镜下观察至棕色）自来水终止染色，然后苏木素复染，常规脱水、透明、树胶封片、SPOT（5.0）高级显微技术软件镜下观察。Image-pro Plus 6.0医学图像分析蛋白的相对表达水平，以染色阳性信号平均吸光度AA作为免疫阳性表达强度的评价标准，即单位面积的积分吸光度IA，AA= IA sum/Area。2.9　数据统计分析应用SPSS 22.0软件统计，统计学数据以x¯±s表示。数据方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；方差不齐时，采用非参数检验进行比较。P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　网络药理学结果3.1.1　保肺康颗粒活性成分与潜在靶点筛选结果通过TCMSP和BATMAN-TCM平台及相关文献补充，通过UniProt数据库转换为统一基因名称，将全部化学成分及靶点经规范、合并、删除重复项后共得到有效核心活性成分193个，对应靶基因2 072个。保肺康颗粒中的有效成分包括甘油醇、连翘脂素、连翘醇、远志酮、菜豆素、氧化苦参碱等，根据活性成分的OB值排序。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221322.T001表1保肺康颗粒前10位核心活性成分Table 1Top 10 core active ingredients of Baofeikang中药有效成分ID药效成分OB/%DL苦参MOL006596Glyceollin97.270.76连翘MOL003330（-）-Phillygenin95.040.57前胡MOL013098［（9R）-8，8-dimethyl-2-oxo-9，10-dihydropyrano［6，5-h］chromen-9-yl］ （Z）-2-methylbut-2-enoate87.480.37连翘MOL003306ACon1_00169785.120.57连翘MOL003322FORSYTHINOL81.250.57连翘MOL003370Onjixanthone I79.160.3苦参MOL000456Phaseolin78.20.73苦参MOL001484Inermine75.180.54苦参MOL004941（2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl） chroman-4-one71.120.18前胡MOL013101rutarin_qt70.10.23.1.2　肺间质纤维化的疾病靶点以及药物-疾病交集靶点通过在GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等数据库检索，并结合相关文献取并集，共得到肺间质纤维化疾病相关人类靶点共3 741个，肺间质纤维化疾病相关人类靶点见增强出版附加材料。利用R软件提取保肺康颗粒与肺间质纤维化之间的共同靶点279个，这些靶点被认为是保肺康颗粒治疗肺间质纤维化的潜在核心靶点，保肺康颗粒治疗肺间质纤维化的交集靶点见增强出版附加材料。3.1.3　PPI网络的构建及关键基因筛选将279个共同靶点导入STRING数据库，将结果以文本形式导出，然后导入Cytoscape软件中，利用软件中的CytoNCA插件得到各参数，根据各参数中位值进行首次筛选，分别为DC5，BC156.050 426 1，CC0.301 031 07，特征向量中心性（EC）0.019 079 680 5，网络中心性（NC）2.5，局部边连通性（LAC）1.916 666 666 5，结果显示共有55个中心节点和325个周边节点。再次筛选阈值为DC10，BC18.319 075 29，CC0.514 285 714，EC0.101 124 726，NC5，LAC4，第二次筛选结果为18个中心节点和97个周边节点，核心靶基因分别是核蛋白类癌基因（MYC）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）重组蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、核心结合因子2（RUNX2）、转录因子激活蛋白-1（AP-1）家族成员JUN、CTNNB1基因、核蛋白转录因子（FOS）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、抑癌基因（TP53）、抑癌基因（RB1）、MAPK14、表皮生长因子受体（EGFR）、Akt1、雌激素受体1（ESR1）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、核转录因子（NF）-κB转录因子家族（RELA），蛋白质互作（PPI）网络构建和核心靶基因筛选见增强出版附加材料。其中Akt1介导的有丝分裂体有助于肺泡巨噬细胞凋亡抵抗，是促进肺纤维化形成的重要影响因子［13］。3.1.4　“保肺康颗粒关键活性成分-核心靶基因”网络将PPI得到的核心靶基因与保肺康颗粒相关药物的活性成分和对应靶基因使用Strawberry Perl软件进行数据处理，得到与保肺康颗粒治疗肺间质纤维化相关的43个有效核心活性成分，将网络拓扑学分析得到的关键43个活性成分与18个核心靶基因对应关系文件，再次导入至Cytoscape，构建“保肺康颗粒关键活性成分-核心靶基因”网络见增强出版附加材料。3.1.5　保肺康颗粒和肺间质纤维化重合靶点GO与KEGG通路富集分析通过基因本体数据库GO分析，关键靶基因共富集3 179个细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物学过程（BP），根据校正后P进行排序，分别选择其前10个进行条形图展示，GO功能富集分析保肺康颗粒治疗肺间质纤维化的关键靶点见增强出版附加材料。保肺康颗粒主要参与四吡咯化合物结合、核受体的结合、配体激活的转录因子活性、DNA结合转录因子结合、蛋白酶结合、儿茶酚胺结合等分子功能。参与机体对药物、脂多糖、氧含量、细菌源分子、金属离子、氧化应激、活性氧代谢、营养水平、细胞外刺激的反应等生物学过程。关键靶基因与KEGG通路进行映射，共富集177条通路，根据校正后P值进行排序，选择前30个进行气泡图展示，见增强出版附加材料。KEGG通路富集显示，保肺康颗粒治疗肺间质纤维化主要涉及脂质和动脉粥样硬化信号通路、PI3K/Akt、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-17（IL-17）、HIF-1α信号通路、松弛素、神经组织的配体-受体相互作用等信号通路。PI3K/Akt通路的激活可以通过调节其下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），HIF-1α等来参与肺纤维化，正是由于PI3K/Akt在调节受体介导的信号转导中的重要作用，使得靶向抑制PI3K/Akt成为治疗IPF的新策略［14］。3.2　动物实验结果3.2.1　保肺康颗粒对大鼠肺组织形态学的影响正常组大鼠肺组织内可见气道黏膜上皮结构完整，无明显坏死及脱落，肺泡结构大致正常，肺泡隔较薄，间质未见纤维组织增生。肺纤维化模型组气道黏膜上皮结构存在破损，气道管腔狭窄，平滑肌增生，伴有部分黏膜下层充血、水肿；肺泡壁较正常组有明显增厚，肺泡腔缩小，肺泡数量增多，表明肺纤维化大鼠模型建模成功。与模型组比较，保肺康颗粒组及醋酸泼尼松组肺组织纤维化增生、气道狭窄、肺泡壁增厚等病理学改变程度均有不同程度的减轻。见图1、图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221322.F001图1保肺康颗粒对大鼠肺组织气道形态学的影响 （HE，×400）Fig. 1Effect of Baofeikang granules on morphological changes in atmospheric tract of rats （HE，×400）注：A.正常组；B.肺纤维化模型组；C.保肺康颗粒组；D.醋酸泼尼松组（图2-图4同）10.13422/j.cnki.syfjx.20221322.F002图2保肺康颗粒对大鼠肺组织肺泡形态学的影响 （HE，×400）Fig. 2Effect of Baofeikang granules on morphological changes in alveolar of rats （HE，×400）3.2.2　保肺康颗粒对大鼠肺组织内PI3K、Akt蛋白表达水平的影响对大鼠肺组织进行IHC染色后可见正常组大鼠肺泡结构正常，肺组织中可见少量PI3K、Akt蛋白的表达。除正常组外的各组肺泡间隔均明显增厚，肺泡有不同程度的结构破坏，肺间质可见大量纤维化团块增生。测定各组大鼠肺组织中阳性区域的IA进行比较，与正常组比较，模型组肺组织中PI3K、Akt蛋白的表达量显著增加（P0.01）；与模型组比较，保肺康颗粒组与醋酸泼尼松组PI3K、Akt蛋白的表达量均显著降低（P0.01）。见表2、图3、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221322.T002表2保肺康颗粒对大鼠肺组织中PI3K、Akt蛋白的影响Table 2Effect of Baofeikang granules on IA values of PI3K and Akt proteins组别剂量/mg·kg-1PI3KAkt正常组34.29±1.6851.88±1.74模型组562.09±2.641）91.32±3.051）保肺康颗粒组27.18×10348.30±1.713）82.48±2.462）醋酸泼尼松组1.1743.97±1.973）67.88±3.763）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.0110.13422/j.cnki.syfjx.20221322.F003图3保肺康颗粒对大鼠肺组织内PI3K蛋白阳性表达 （IHC，×400）Fig. 3Effect of Baofeikang granules on expression of PI3K protein in lung tissue of rats （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20221322.F004图4保肺康颗粒对大鼠肺组织内Akt蛋白阳性表达 （IHC，×400）Fig. 4Effect of Baofeikang granules on expression of Akt protein in lung tissue of rats （IHC，×400）4 讨论肺纤维化最常见的形式是IPF，这是一种起源不明的慢性肺部疾病，由于治疗无效、预后差给患者的生活质量以及生命健康带来了严重危害，肺纤维化的特征是成纤维细胞的增殖和细胞外基质重塑，导致呼吸功能不全［15］。IPF的发病机制涉及许多机制，如上皮细胞损伤伴组织间充质细胞炎症活化，成纤维细胞增殖伴细胞外基质胶原沉积［16］，但是引起这种渐进性和破坏性疾病的机制仍不完全清楚。随着研究的深入，PI3K/Akt信号通路近年来被视为IPF的主要调节因子，且与其他通路协同作用促进肺纤维化的形成［14］。博莱霉素曾被用作抗肿瘤药物，但现在认为其可引起剂量依赖性肺间质纤维化。在啮齿类动物的肺中气管内使用博莱霉素已被证明会导致肺泡细胞损伤、炎症反应、上皮-间充质转化（EMT）、成纤维细胞增殖和随后的细胞外基质沉积［17］。因此博莱霉素诱导的肺纤维化常用于疾病发病机制的研究和治疗药物的研发。肺纤维化在中医病名归属“肺痿”“肺痹”或者“喘证”等范畴。张仲景《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治》曰：“或从汗出，或从呕吐，或从消渴，小便利数，或从便难，又被快药下利，重亡津液，故得之。”其突出内亡津液而伤火燥，津枯则痿。本病虽在肺，但与脾肾密切相关，起病多因反复外感致卫气宣发不固，邪滞气道，肺络损伤，或因饮食情志所伤，内生痰瘀阻肺，日久肺脾肾气虚、阴虚或气阴两虚，总以“气阴两虚、肺络瘀阻”为病机关键［18］。崔红生教授认为肺间质纤维化早期以络脉痹阻，气血不通为基本病机特点；慢性迁延期则属本虚标实，虚实夹杂，肺痹与肺痿并存［19］，总以“益气养阴、祛瘀通络”为基本治则，方以保肺康颗粒加减治疗。保肺康颗粒中“党参、麦冬、五味子”取生脉散之意养阴生津润肺，“当归、浙贝母、苦参”取当归贝母苦参丸之功润枯燥湿、益阴化痰。连翘、皂角刺配伍可以解热毒、散郁结、化痰结；前胡、紫苏子降气平喘，祛痰止咳，加以红景天补益肺气，养阴清热、活血通络，全方祛邪扶正，兼顾虚、痰、瘀、毒，共奏益气养阴、化瘀通络、解毒散结祛痰之功，临床疗效较显著［20］。课题组前期动物实验研究表明保肺康颗粒能够减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化，其可能通过抑制Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路发挥改善肺通气功能作用［21］。本研究采用网络药理学方法系统分析保肺康颗粒治疗肺间质纤维化的潜在作用机制。成分分析结果可知，连翘的汉黄芩素、苦参的芒柄花黄素、前胡的紫花前胡苷等是该方发挥治疗PF的主要化学成分。GO富集分析得到保肺康颗粒有效成分对应靶点的分子功能，其中DNA转录因子结合对应的基因靶点数目最多，其是转录大多数促炎分子所需的重要生物学过程，包括黏附分子、酶、细胞因子和趋化因子［22］，这一结果同样可以证实保肺康颗粒对肺纤维疾病的调控作用。KEGG筛选出的信号通路中，与保肺康颗粒有效靶点关联度最高的是脂质和动脉粥样硬化信号通路，其次是PI3K/Akt信号通路。核心靶基因中特别是Akt1、HIF-1α，可促进肺泡上皮细胞向成纤维上皮细胞转换以及介导EMT过程［23］。既往研究认为博莱霉素可以通过PI3K/Akt通路上调胶原蛋白表达和细胞增殖，直接诱导肺组织纤维化［24］。有动物实验证实PI3K抑制剂治疗可减少成纤维细胞增殖，改善肺功能［25］。为了验证网络药理学的分析结果，本研究选择博来霉素诱导拟肺纤维化大鼠模型，对保肺康颗粒治疗肺纤维化是否是通过调控PI3K/Akt信号通路发挥作用进行动物实验验证。HE结果表明与模型组比较，保肺康颗粒组的肺组织纤维化增生、气道狭窄、肺泡壁增厚等病理学改变程度均有不同程度的减轻，且免疫组化结果显示保肺康颗粒组PI3K、Akt蛋白的表达量较模型组相比均显著降低。综上，本文基于网络药理学方法构建“保肺康颗粒-成分-靶点-肺纤维化”网络，以期获得保肺康颗粒对IF的具体作用靶点及机制，通过动物实验对所获得的重要靶点及相关PI3K/Akt通路进行验证，结果表明保肺康颗粒能够抑制大鼠肺部纤维化进程，可能是通过降低PI3K、Akt阳性蛋白表达水平，从而干预其下游的效应细胞来参与抑制肺纤维化进展，达到改善肺功能的作用。本实验通过体内动物实验验证了网络药理学的预测结果，为保肺康颗粒治疗肺纤维化提供了科学依据，对研究保肺康颗粒抗肺纤维化的药理机制具有一定的参考价值。