代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）曾命名为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。MAFLD由代谢综合征驱动，并与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和高脂血症相关，该病能进一步转化成脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，而MAFLD是世界上许多地区增长最快的肝细胞癌的病因［1-2］。此外，生物钟的改变也已经成为肥胖、心血管疾病和代谢相关脂肪性肝病等全球健康问题的主要驱动因素。肝脏的代谢由昼夜节律生物钟驱动［3］，生物钟的破坏会增加人体对代谢性疾病的易感性［4］，而人体代谢的改变也会影响生物钟基因的表达［5］，因此维持肝脏代谢和生物钟驱动之间的稳态非常重要。中医药具有多途径、多靶点及不良反应小的特点，在改善MAFLD方面有独特优势。降糖消脂片是中国中医科学院西苑医院内分泌科名家魏子孝的临床经验方，由女贞子、黄芪、黄连、姜黄、荔枝核和昆布6味中药组成，后经制剂工艺改进成院内制剂，以临床实践为基础，广泛用于治疗2型糖尿病及代谢相关疾病［6-7］。前期的临床、动物实验研究表明，降糖消脂片治疗糖脂代谢紊乱相关疾病如2型糖尿病、肥胖和非酒精性脂肪性肝病疗效明显［8］，但对其治疗MAFLD具体的作用机制尚不明确，故本实验从生物钟相关基因角度出发，探讨降糖消脂片发挥代谢调控作用的机制，为降糖消脂片改善MAFLD的研究提供新的实验依据。1 材料1.1　动物50只SPF级C57BL/6J雄性小鼠，4周龄，体质量13~15 g，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0008。动物饲养于中国中医科学院西苑医院基础医学研究所SPF级动物实验室。本文所涉及的动物实验经中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会批准，批准编号2021XLC001-2。1.2　饲料小鼠普通饲料购自于北京科澳协力饲料有限公司，批号19083213，成分为玉米、豆粕等。小鼠60 kcal%高脂饲料购自于美国Research Diets公司，货号D12492，批号19072201HS2.5，成分为猪油、豆油、蔗糖等。1.3　药品降糖消脂片由中国中医科学院西苑医院基础研究所提供，批号1906271，规格2.5 g。组成：女贞子1 000 g，黄芪500 g，黄连250 g，荔枝核500 g，昆布375 g，姜黄375 g；本品每1 g含女贞子以特女贞苷（C31H42O17）计不得少于4.64 mg。奥利司他胶囊，批号85190302，规格0.12 g，购自山东新时代药业有限公司。1.4　试剂甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（英国Cohesion Biosciences公司，批号分别为CAK1086、CAK1116、CAK1002、CAK1004）；总蛋白定量（BCA）法测试盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20201026、20201028、20201028）；马松（Masson）三色染色液（广州维格斯生物科技有限公司，批号19061701）；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、饱和油红O染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20191215、20191107）；RIPA裂解液、通用型抗体稀释液、TBS/Tween缓冲液（10×）、无蛋白快速封闭液（5×）（上海雅酶生物科技有限公司，批号分别为01491050、014A1090、03481020、013C1200）；内参β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Immunoway公司，批号B9901）；昼夜运动输出周期基因（CLOCK）抗体、脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白1基因（BMAL1）抗体、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab3517、ab3350、ab28481）；孤儿核激素受体（REV-ERB）α、β抗体、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α、γ（Affinity Biosciences公司，批号分别为DF12430、DF13195、AF5301、AF6284）。1.5　仪器IEC-CL31R型高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；ES-1100型电子天平（长沙湘平科技发展有限公司）；TP-213型精密电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Echo MRI-100&A10型清醒动物体成分分析仪（美国Echo MRI公司）；SYNERGY-4型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；LAbOSPECT-003型全自动生化分析仪（日本日立公司）；Tissue-TEK TEC型生物组织包埋机（日本樱花公司）；RM2235型组织切片机、ST5020型全自动多功能染色机、CV5030型全自动封片机（德国徕卡公司）；Olympus-Bx53型光学显微镜（美国奥林巴斯公司）。2 方法2.1　动物分组与处理4周龄的C57BL/6J雄性小鼠50只，经过1周适应性饲养后，随机分为正常组（10只）与模型组（40只），正常组饲喂正常饲料，模型组饲喂高脂饲料。根据HE、油红O染色等病理观察，发现模型组小鼠肝细胞中出现大小不等的脂肪空泡、脂滴较多、肝细胞肥大、肝小叶结构破坏、汇管区炎细胞浸润及少量纤维组织增生，判断模型复制成功。4周后将模型组随机分为4组，每组10只，即模型组，降糖消脂片高、低剂量（12.5、6.25 g·kg-1）组、奥利司他组（70 mg·kg-1），各组开始持续按照20 mL·kg-1灌胃给予药物8周，正常组和模型组给予相应体积的灭菌纯水，每日1次。每周定时记录各组小鼠的体质量和摄食量。实验结束后，所有动物禁食过夜，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。摘眼球取血，室温放置30 min，3 000 r·min-1离心15 min（离心半径8.4 cm，下同），收集小鼠上层血清保存于-80 ℃，用于后续检测。收集动物肝脏组织和附睾脂肪，取相同部位肝脏和附睾脂肪经4%多聚甲醛固定；其余部分经液氮快速冷冻后转移至-80 ℃保存。2.2　小鼠血清指标检测血清样本保存于-80 ℃，使用时置于4 ℃融化，采用全自动生化分析仪器测定血清中的生化指标，包括TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT和AST。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清FFA和瘦素，具体实验步骤按照试剂盒说明书进行。2.3　HE染色观察小鼠肝脏组织和附睾脂肪病理形态学变化将小鼠附睾脂肪和肝脏组织用石蜡包埋，随后进行HE染色，在200倍光学显微镜下拍摄各组小鼠组织的病理照片。2.4　Masson染色观察小鼠肝脏组织病理形态学变化将肝脏组织的石蜡切片进行Masson染色，并于100倍光学显微镜下拍照分析。2.5　油红O染色观察小鼠肝脏组织病理变化将肝脏组织经常规脱水石蜡包埋和脱蜡处理以后进行油红O染色，甘油明胶封片，于200倍光学显微镜下进行各组组织切片病理观察分析及拍照。2.6　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织相关蛋白的表达称取小鼠肝脏组织20 mg，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，充分裂解后离心，4 ℃、14 000 r·min-1离心5 min，BCA法测定总蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，膜封闭及抗体反应，按说明书配置抗体浓度，β-actin（1∶1 000）、CLOCK（1∶200）、BMAL1（1∶200）、REV-ERBα（1∶1 000）、REV-ERBβ（1∶1 000）、SREBP1（1∶1 000）、PPARα（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、二抗（1∶2万）。采用Image J软件分析各条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。2.7　免疫组化检测肝组织CLOCK、BMAL1、SREBP1和PPARγ蛋白表达将包埋好的肝脏蜡块切片，进行脱蜡、水化的操作，采用高压热进行抗原修复，修复后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，然后进行避光室温封闭、加一抗（CLOCK 1∶200，BMAL1 1∶200、SREBP1 1∶100，PPARγ 1∶50）孵育、加二抗、显色的一系列操作，最后复染，封片。结果分析用PBS替代一抗作为阴性对照，阳性细胞为细胞胞浆或胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒，整张切片均进行观察，然后在高倍镜下拍摄3个视野，用Image-pro Plus 5.1对采集到的图像进行分析，以测量阳性信号的积分吸光度IA作为该指标表达的定量数值。2.8　统计学方法数据采用SPSS 23.0统计软件分析，以x¯±s表示。若方差齐且符合正态分布，采用单因素方差分析，组间比较采用最小显著性差异法（LSD）；若不满足方差齐性采用Dunnett-T3检验；当各组不满足正态分布时，采用秩和检验；P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对小鼠体质量的影响与正常组比较，模型组小鼠体质量显著升高（P0.01）；与模型组比较，第6周起，JTXZT-H组和奥利司他组小鼠的体质量明显降低（P0.05），第8周起，JTXZT-L组小鼠体质量明显降低（P0.05）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T001表1降糖消脂片干预对代谢相关脂肪性肝病小鼠体质量的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet intervention on body weight in mice with MAFLD （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1体质量/g0周2周4周6周8周10周12周正常组16.53±0.5821.50±0.6623.53±0.8824.48±0.8625.66±0.8623.99±1.1227.23±0.92模型组16.33±0.9123.29±0.781）26.27±0.932）28.70±1.502）30.92±1.692）31.63±1.682）35.88±1.912）JTXZT-H组12.515.38±0.9122.30±0.7824.82±0.9325.44±1.503）26.64±1.693）25.92±1.683）27.92±1.913）JTXZT-L组6.2516.11±0.7922.41±1.1125.16±1.7025.56±1.1927.12±1.793）26.56±2.303）29.03±2.743）奥利司他组0.0716.05±0.6422.89±0.5425.58±0.4225.52±0.903）27.28±0.493）26.28±0.773）28.42±0.643）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2-表7同）3.2　对小鼠血清指标的影响3.2.1　对小鼠脂质代谢的影响与正常组比较，模型组小鼠血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA和瘦素的含量显著升高（P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组小鼠血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA和瘦素含量明显降低（P0.05，P0.01），JTXZT-L组小鼠血清的TG、FFA和瘦素水平明显降低（P0.05，P0.01），奥利司他组也能明显下调小鼠的血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA和瘦素水平（P0.05，P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T002表2降糖消脂片干预对代谢相关脂肪性肝病小鼠脂质代谢的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet intervention on lipid metabolism in mice with MAFLD （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1FFA/μmol·L-1瘦素/μg·L-1正常组3.11±0.220.25±0.042.36±0.150.36±0.09567.91±29.364.70±0.33模型组4.67±0.232）0.66±0.232）3.55±0.242）0.66±0.902）706.75±42.812）6.90±0.332）JTXZT-H组12.54.06±0.643）0.29±0.094）3.14±0.553）0.54±0.123）629.34±34.574）5.17±0.264）JTXZ-L组6.254.37±0.600.33±0.104）3.53±0.330.60±0.13661.55±33.273）5.18±0.274）奥利司他组0.074.25±0.264）0.43±0.123）3.12±0.224）0.47±0.654）643.92±26.134）5.14±0.254）3.2.2　对小鼠肝功能的影响与正常组比较，模型组小鼠血清的ALT和AST水平明显升高（P0.05，P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组可以显著下调小鼠血清的ALT和AST水平（P0.01），JTXZT-L组显著下调小鼠的血清ALT和AST水平（P0.01），奥利司他组小鼠血清的ALT水平差异无统计学意义，但能显著下调小鼠血清的AST水平（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T003表3降糖消脂片干预对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝功能的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet intervention on liver function in mice with MAFLD （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1ALTAST正常组43.60±10.17151.00±22.61模型组61.20±12.011）175.80±20.642）JTXZT-H组12.531.10±4.634）144.30±17.064）JTXZ-L组6.2531.70±3.274）132.50±16.334）奥利司他组0.0748.20±4.16146.00±19.024）U·L-13.3　对小鼠肝脏组织病理变化的影响HE染色结果显示，正常组小鼠肝脏组织结构如常，肝索围绕中央静脉呈放射状分布，排列整齐有序，肝窦充盈；模型组肝组织结构略显紊乱，肝细胞出现明显气球样变性，伴随灶性小泡性脂肪变，肝细胞肥大致肝窦不明显，枯否细胞增生，肝小叶内有炎细胞聚集灶，汇管区出现炎细胞浸润及少量纤维组织的增生；JTXZT-H组肝脏组织结构较正常，散在肝细胞气球样变性，变性程度及范围较模型组明显减轻，肝窦压迫明显减轻，汇管区炎细胞浸润及纤维组织增生不明显；JTXZT-L组肝组织结构轻度不规整，少量肝细胞气球样变性，变性程度及范围较模型组减轻，见小灶脂肪变性区域，肝窦压迫减轻，肝小叶炎细胞灶可见，汇管区炎细胞浸润及纤维组织增生不明显。奥利司他组肝组织结构较正常，小灶见肝细胞气球样变性及脂肪变性区，肝窦压迫不明显，见极少量散在炎细胞灶，未见明显汇管区炎细胞浸润及纤维组织增生。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F001图1降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织病理变化的影响 （HE，×200）Fig. 1Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on pathological changes of liver tissue in mice with MAFLD （HE，×200）注：A.正常组；B.模型组；C.JTXZT-H组；D.JTXZT-L组；E.奥利司他组（图2-图11同）3.4　对小鼠附睾脂肪病理变化的影响与正常组比较，模型组小鼠的脂肪细胞显著增大；与模型组比较，JTXZT-H各剂量组和奥利司他组小鼠脂肪细胞面积相对减少，但也大于正常组。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F002图2降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠附睾脂肪组织病理变化的影响 （HE，×200）Fig.2Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on pathological changes of epididymal adipose tissue in mice with MAFLD （HE，×200）3.5　对小鼠肝脏组织纤维化的影响与正常组比较，Masson染色显示出模型组小鼠肝脏出现纤维化，与模型组比较，给予降糖消脂片和奥利司他干预后小鼠肝脏纤维化减轻。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F003图3降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织纤维化的影响 （马松，×100）Fig.3Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on liver fibrosis in mice with MAFLD （Masson，×100）3.6　对小鼠肝脏组织脂质变化的影响油红O染色结果显示，正常组小鼠肝细胞未见明显红色脂滴；模型组小鼠肝细胞脂滴较多，肿胀及脂肪变性明显；JTXZT-H组、JTXZT-L组、奥利司他组小鼠细胞浆内可见散在分布的红色脂滴，肝细胞结构稍显紊乱，存在少许肝细胞脂肪变性，病变程度较模型组明显减轻，其中JTXZT-H组减轻最显著。见图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F004图4降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织脂质变化的影响 （油红O，×200）Fig.4Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on lipid changes in liver tissue in mice with MAFLD （oil red O，×200）3.7　对小鼠肝脏脂质合成基因SREBP1、PPARα和PPARγ蛋白表达的影响Western blot结果显示，与正常组比较，模型组小鼠SREBP1和PPARγ蛋白表达显著增加（P0.01），而PPARα蛋白表达明显减少（P0.05）；与模型组比较，JTXZT各组和奥利司他组鼠SREBP1蛋白表达显著减少（P0.01），JTXZT各组小鼠PPARα蛋白显著增加（P0.01），PPARγ蛋白表达明显减少（P0.05，P0.01）。见图5、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F005图5各组小鼠肝脏组织SREBP1、PPARγ、PPARα蛋白表达电泳Fig.5Electrophoresis of SREBP1， PPARγ， PPARα protein expression in liver tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T004表4降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织SREBP1、PPARγ、PPARα蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on protein expression of SREBP1， PPARγ and PPARα in liver tissue in mice with MAFLD （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1SREBP1/β-actinPPARγ/β-actinPPARα/β-actin正常组0.21±0.121.04±0.460.62±0.19模型组0.59±0.072）6.17±2.022）0.28±0.121）JTXZT-H组12.50.25±0.084）1.11±0.234）0.68±0.064）JTXZT-L组6.250.22±0.094）1.16±0.353）0.68±0.104）奥利司他组0.070.19±0.074）2.54±1.610.47±0.33免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组小鼠SREBP1蛋白表达显著增加（P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组、JTXZT-L组和奥利司他组小鼠SREBP1蛋白表达均明显减少（P0.05）。与正常组比较，模型组小鼠PPARγ蛋白表达显著增加（P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组、JTXZT-L组和奥利司他组小鼠PPARγ蛋白表达均明显减少（P0.05）。见图6和图7、表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F006图6降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织SREBP1 免疫组化的影响 （免疫组化，×200）Fig.6Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on SREBP1 immunohistochemistry in liver tissue in mice with MAFLD （IHC，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F007图7降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织PPARγ免疫组化的影响 （免疫组化，×200）Fig.7Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on PPARγ immunohistochemistry in liver tissue in mice with MAFLD （IHC，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T005表5降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织SREBP1和PPARγ蛋白表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 5Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on expression of SREBP1 and PPARγ protein in liver tissue in mice with MAFLD （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1SREBP1/IAPPARγ/IA正常组868.33±50.10503.00±72.26模型组1 070.00±100.282）699.17±66.172）JTXZT-H组12.5958.50±57.073）564.83±97.843）JTXZT-L组6.25934.33±105.063）611.33±50.163）奥利司他组0.07943.00±82.583）606.00±65.353）3.8　对小鼠肝脏生物钟相关基因CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达的影响与正常组比较，模型组小鼠CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达明显减少（P0.05，P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组小鼠CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达均明显增多（P0.05，P0.01），JTXZT-L组小鼠BMAL1和REV-ERBβ蛋白表达均显著增多（P0.01），CLOCK和REV-ERBα蛋白表达差异无统计学意义，奥利司他组小鼠BMAL1和REV-ERBα蛋白表达明显增多（P0.05，P0.01），CLOCK和REV-ERBβ蛋白表达差异无统计学意义。见图8和图9、表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F008图8各组小鼠肝脏组织CLOCK、BMAL1蛋白表达电泳Fig.8Electrophoresis of CLOCK， BMAL1 protein expression in liver tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F009图9各组小鼠肝脏组织REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达电泳Fig.9Electrophoresis of REV-ERBα，REV-ERBβ protein expression in liver tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T006表6降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on expression of CLOCK， BMAL1， REV-ERBα and REV-ERBβ protein in liver tissue in mice with MAFLD （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1CLOCK/β-actinBMAL1/β-actinREVERBα/β-actinREVERBβ/β-actin正常组0.12±0.010.60±0.171.94±1.010.55±0.14模型组0.08±0.031）0.17±0.062）0.50±0.151）0.21±0.011）JTXZT-H组12.50.16±0.034）0.36±0.103）2.68±0.444）0.61±0.093）JTXZT-L组6.250.13±0.080.33±0.034）1.09±0.260.63±0.074）奥利司他组0.070.11±0.060.37±0.014）2.63±1.803）0.30±0.07免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组小鼠CLOCK和BMAL1蛋白的表达显著降低（P0.01）；与模型组比较，JTXZT-H组小鼠CLOCK和BMAL1蛋白的表达显著升高（P0.05），JTXZT-L组和奥利司他组小鼠CLOCK和BMAL1蛋白的表达明显升高（P0.05，P0.01）。见图10和图11、表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F010图10降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织CLOCK免疫组化的影响 （免疫组化，×200）Fig.10Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on CLOCK immunohistochemistry in liver tissue in mice with MAFLD （IHC，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.F011图11降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织BMAL1免疫组化的影响 （免疫组化，×200）Fig.11Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on BMAL1 immunohistochemistry in liver tissue in mice with MAFLD （IHC，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20221844.T007表7降糖消脂片对代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏组织CLOCK和BMAL1蛋白表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 7Effect of Jiangtang Xiaozhi tablet on expression of CLOCK and BMAL1 proteins in liver tissue in mice with MAFLD （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1CLOCKBMAL1正常组830.83±85.65762.00±76.91模型组662.33±70.412）569.67±65.332）JTXZT-H组12.5789.50±95.383）671.00±78.123）JTXZT-L组6.25780.33±98.493）658.00±41.674）奥利司他组0.07768.50±85.353）650.50±48.414）4 讨论在过去的几十年中，生活方式的改变已将全球范围内的医疗重点从传染性疾病转移到了代谢性疾病，MAFLD作为一种代谢性疾病，患病率逐年增加，并呈现出年轻化的趋势，更重要的是20%~25%的脂肪肝患者会进展为脂肪肝炎，而这是肝硬化和肝细胞癌患者的病因［9］，严重威胁着人们的身体健康，因此寻找和开发用于MAFLD治疗的药物尤为迫切。降糖消脂片由女贞子、黄芪、黄连、姜黄、荔枝核和昆布6味中药组成，具有益气养阴、化痰祛瘀的功效，能显著降低血糖、血脂水平，改善糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗。降糖消脂片治疗2型糖尿病疗效明显，还能显著改善肥胖［10-11］，同时该片剂不良反应低，具有较好的应用前景。本实验结果显示，降糖消脂片能明显降低MAFLD小鼠体质量，说明降糖消脂片对MAFLD小鼠的肥胖具有明显的改善作用；脂质检测结果表明，高脂喂养会引起小鼠出现脂质代谢紊乱，而降糖消脂片干预对小鼠脂质代谢紊乱有明显改善作用，能减少MAFLD小鼠血清的脂质堆积。小鼠肝组织的HE病理结果、油红O染色结果表明，降糖消脂片对MAFLD小鼠的肝脏脂肪变性和堆积有明显改善作用；小鼠肝脏Masson染色结果表明，高脂喂养的MAFLD小鼠可进一步发展为肝纤维化，而降糖消脂片的干预对肝纤维化有明显改善作用。因此，本实验结果表明降糖消脂片对高脂喂养的MAFLD小鼠具有良好的改善作用。MAFLD主要由肝脏不能有效代谢碳水化合物和游离脂肪酸引起，具体是脂肪细胞FFA的供给、肝脏脂质从头合成、FFA通过线粒体β-氧化利用、酮体的生成与最终利用极低密度脂蛋白（VLDL）运输肝脏合成的TG之间不平衡的结果［12-13］。TG在肝脏中过度蓄积是MAFLD发生的原因之一，TG作为人体重要的脂质，肝脏和脂肪等组织可以合成TG，并存储于脂肪；同时，大部分组织可以利用TG分解产生脂肪酸供给能量。TG的合成与分解平衡对于维持体内脂质代谢平衡非常重要，SREBP1、PPARs都是TG代谢过程中起关键作用的基因［14］，并与下游基因脂肪酸合成限速酶乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶等共同调控TG合成与分解网络［15-16］。SREBP1作为TG合成过程的关键基因，可以优先调控脂肪酸合成中相关基因的表达，SREBP1表达过度，其下游脂肪酸合成酶（FAS）等酶的合成增加，引起血清中合成TG的速率加快，并可以加快肝脏中脂质的沉积，引起肝脏脂肪变性。本实验发现，降糖消脂片可以通过促进MAFLD小鼠PPARα的表达，抑制SREBP1、PPARγ的分泌，减轻肝脏和血清TG、TC、FFA和肝脏脂肪堆积，进而缓解MAFLD。说明降糖消脂片可能通过调控SREBP1与PPARs的表达发挥治疗MAFLD。另外，生物钟基因调控着每个组织中最突出的一些生理功能，肝脏是具有多种功能的代谢核心组织，包括脂质合成与代谢过程、胆汁酸的新陈代谢等过程都受到生物钟相关基因的调控。如SREBP1的活性受到生物钟相关基因REV-ERBα的调节［17］。PPARα是调节脂肪酸氧化的重要因子，而生物钟相关基因CLOCK/BMAL1可以活化PPARα，活化的PPARα可以激活与脂肪代谢有关的蛋白质或酶促进TG分解［18］，减轻脂质堆积［19］；而PPARγ途径能加速MAFLD的发展［20］。TUREK等［21］发现CLOCK基因突变的小鼠生物钟紊乱，出现过度摄食、肥胖和肝脂肪变性，并引发一系列代谢紊乱。SHIMBA等［22］通过敲除BMAL1基因发现小鼠的TG、游离脂肪酸水平及肝脏脂质积累增加。同时，机体的进食行为和代谢的改变反过来也会影响生物钟系统，越来越多的研究表明食物可以作为授时因子，重置或改变外周生物钟系统［23］。例如，长期高脂饮食使小鼠肝脏CLOCK、BMAL1、PER2、CRY2和PPARα表达的节律性和幅度降低，同时还能改变核受体转录活性调控的脂代谢相关基因胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）、低密度脂蛋白受体、脂蛋白脂酶和二酰甘油酰基转移酶等的活性［24］。在高脂饮食喂养小鼠引起肥胖的过程中，肥胖小鼠的生物钟相关基因及其调控的下游钟控基因的水平和振幅发生改变，导致生物钟紊乱［25］；而紊乱的生物钟系统又可通过对下游相关代谢过程的调控最终影响疾病的发生发展。本实验结果显示高脂喂养MAFLD小鼠的生物钟相关基因表达发生改变，CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白表达显著减少，说明了高脂喂养MAFLD小鼠的生物钟发生紊乱，而给予降糖消脂片后可以在一定程度上恢复生物钟相关基因的表达，进而调控脂质代谢在一定程度上的恢复，达到治疗效果。综上所述，本实验结果提示，JTXZT对高脂饮食引起的小鼠代谢相关脂肪性肝病具有显著的改善作用，可能通过上调CLOCK、BMAL1、REV-ERBα和REV-ERBβ蛋白的表达，来调控下游相关脂质代谢蛋白（如SREBP1、PPARγ、PPARα）的表达，达到治疗代谢相关脂肪性肝病的作用，有关该药更深入的分子作用机制有待今后更深入研究。