男性不育症为临床常见病，其已成为当今困扰全世界医者的难题。在工作压力增加、社会节奏加快、环境污染加重等诸多有害因素的共同作用下，男性生殖功能普遍遭受损害，其中以男性精子质量下降最为明显［1］。我国男性的精液质量每年以1%的速度下降，少弱精子症已成为男科门诊常见病、多发病，占男性不育病因的50%左右，且其发病机制尚未完全清楚，已成为男科生殖系统疾病的研究热点和难点，严重影响男性生殖健康和人类自然繁衍［1-2］。目前西医治疗少弱精症，主要是通过调节激素、降低精子氧化及提高精子活动力，多为经验性用药，且这些药物对于特发性男性不育少弱精症临床效果不佳［3］。中医药以其多成分、多靶点、多途径的独特优势，在少弱精症的治疗上发挥优势。淫羊藿始载于《神农本草经》，主要功效为补肾壮阳，祛风除湿［4］。成都中医药大学附属医院男科常德贵教授团队自1995年开始对弱精症进行研究，初期根据文献检索和专家临床经验总结出增精1号、增精2号、增精3号处方，经过多年临床筛选最终确定增精1号处方，从散剂到口服液最终形成片剂，申报成院内制剂强精片，由人参、当归、枸杞子、淫羊藿等7味中药组成。临床研究表明，应用强精片治疗少弱精症患者，每日3次，每次5片，1月为1疗程，共观察3个疗程。结果显示，强精片可通过增加少精子症患者精子密度、提高精子活力及正常形态精子率，以改善少精子症患者的生精功能［5-6］。强精片还可显著改善弱畸精子症患者DNA碎片率、核蛋白不成熟度及卵胞浆内单精子显微注射受精率［7-8］。报道采用淫羊藿颗粒治疗精液异常不育症患者，对照组采用五子衍宗丸进行治疗，治疗后两组患者精液量比较差异无统计学意义，淫羊藿颗粒治疗组患者的精子密度和活动率优于对照组，淫羊藿颗粒治疗组总有效率明显高于对照组，表明淫羊藿用于治疗精液异常男性不育症的疗效显著，值得进一步广泛应用［9］。采用自拟生精种子汤加减，方中以淫羊藿填精益髓，临床取得满意疗效［10］。自拟含淫羊藿复方生精汤治疗少弱精子症60例，以左卡尼汀为对照组，结果显示治疗组精子各项指标明显提升［11］。以上研究表明，淫羊藿对男性生殖系统疾病有较好治疗效果，但其药效物质基础和分子机制尚不明确［12］。网络药理学以药理学和药效学为角度，整合组学、药理学、系统生物学等，高通量筛选获得药物-基因-靶点-疾病的协同效应和潜在机制，探讨中医药多成分、多靶点、多途径的药理机制，了解特定疗效的潜在作用机制［13-14］。本研究基于网络药理学、分子对接技术及实验验证多角度解析淫羊藿治疗少弱精症的作用靶点及作用机制，以期为淫羊藿治疗少弱精症的作用机制提供思路和理论基础。1 材料1.1　淫羊藿化学成分及相关靶点筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，检索淫羊藿的化学成分及其对应靶点，借助UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）将所得靶点转化成对应基因名。1.2　少弱精症相关靶点获取以“oligoasthenotspermia”少弱精症为关键词，挖掘基因名片数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.omim.org）中少弱精症的潜在靶点。将所有筛选结果合并去重后得到少弱精症的相关基因。使用Venny 2.1.0将淫羊藿靶基因与少弱精症靶基因取交集得到淫羊藿治疗少弱精的靶基因，用于后续研究。2 方法2.1　药物-活性成分-基因靶点-疾病网络的构建将上述获得的淫羊藿治疗少弱精症的活性成分及相关靶点通过Cytoscape 3.9.0软件构建淫羊藿-活性成分-靶点-疾病网络图，初步研究淫羊藿治疗少弱精症的药理作用和机制。2.2　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建为了研究靶点蛋白的相互作用，确定淫羊藿作用靶点群，将药物靶点基因上传至在线STRING 11.5（https：//string-db.org），构建由导入基因表达产物组成的PPI网络互作图。2.3　淫羊藿-少弱精症靶点功能与通路的富集分析将淫羊藿治疗少弱精症的靶点录入DAVID数据库，研究淫羊藿靶点基因本体（GO）生物过程富集分析；再进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集分析，诠释淫羊藿靶点抗少弱精症的生物过程，Metascape中列表与背景选择“Homo Sapiens”操作。利用微生物平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对数据进行可视化。2.4　分子对接基于2.1项的分析结果选取6个淫羊藿核心化合物，导入TCMSP数据库中筛选得化合物分子结构，以MOL2格式导出并保存。根据PPI网络筛选得到6个核心靶蛋白，通过蛋白结构数据库（PBD）获得蛋白3D结构，以PBD格式导出并保存。采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接工作，在对接开始之前，使用PyMOL 2.5对所有受体蛋白进行处理，包括去除水分子，盐离子及小分子。并使用PyMOL插件center_of_mass.py定义对接盒子的中心，并使对接盒子包裹蛋白活性位点。此外，使用ADFRsuite 1.0将所有处理好后的小分子及受体蛋白转换为AutoDock Vina 1.1.2对接必须的PDBQT格式。对接时，全局搜索的详尽度设为20，其余参数保持默认设置。输出的打分最高的对接构象被认为是结合构象，最后使用PyMOL 2.5对对接结果进行可视化分析。2.5　实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测SD大鼠睾丸组织中核心靶蛋白mRNA2.5.1　实验动物SPF级健康雄性SD大鼠，体质量180~220 g，30只，4~7周龄，由成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号SCXK（川）2015-030。实验前动物适应性饲养1周。动物实验按照成都中医药大学实验动物学部福利和伦理原则操作。2.5.2　仪器与试药qTOWER3G型Real-time PCR（德国耶拿公司），SSA-Ⅱ型精子质量分析仪（北京穗加）；淫羊藿苷（四川科斯腾生物科技有限公司，批号CONST210202，纯度≥98%）；环磷酰胺（江苏恒瑞医药有限公司，批号20092225）；大鼠肿瘤蛋白P53（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶（Caspase）-3、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（ERBB2）、Caspase-9引物，由华大基因公司设计并合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参进行荧光定量实验，利用PCR扩增仪进行扩增反应，95 ℃预变性4 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃扩增30 s，40 个循环。每一个实验样品进行3个生物学重复，实验数据以2-ΔΔCt法进行计算，引物序列详见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T001表1引物序列Table 1Primers sequences引物序列（5′-3′）长度/bpTP53上游CTTCTCAAAAGTCTAGAGCCAC389下游GCCGGTGTAGGAGCTGCTGEGFR上游AACTCATGCCCTATGGTTGC102下游GTTCATGCCCTTTGCAATCTPTGS2上游TGCCTGGTCTGATGATGTATG280下游GGGGTGCCAGTGATAGAGTGCaspase-3上游TGGGACTGATGAGGAGA125下游ACTGGATGAACCACGACERBB2上游GCGGTTCACCCACCAGAGTG395下游CCCTGCTGGGGTACCAGATACaspase-9上游GCTTCTCTGCCACTGTACTACTGA339下游GGAAGAATTAGCCCTTCTGGTAACGAPDH上游CACCCACTCCTCCACCTTTGA186下游TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC2.5.3　动物分组与给药将30只SD雄性大鼠按随机数字表分为3组，每组10只，即空白组、模型组、淫羊藿苷组。模型组及淫羊藿苷组进行腹腔注射环磷酰胺50 mg·kg-1，连续注射7 d，空白组注射等量生理盐水。造模成功标准参考文献［15］，造模前后，使用电刺激法收集小鼠精液标本，若是造模后小数的精液密度及活力较造模前明显下降且数据具有统计学意义（P0.05），即为造模成功。参考文献［16］淫羊藿苷组环磷酰胺处理后给予淫羊藿苷（3.6 g·kg-1·d-1）灌胃，该剂量可有效改善雄性生殖系统，连续30 d，每天1次。2.5.4　精子常规检测利用数码彩色精子质量检测系统对大鼠精子密度、精子活力、精子活率等指标进行测定。采用GraphPad Prism 7.00软件进行统计学显著性分析。2.5.5　Real-time PCR检测mRNA表达情况取睾丸组织保存于RNAsafer中，使用匀浆机破碎组织。使用总RNA提取E.Z.N.A. Total RNA Kit Ⅰ（美国OMEGA公司，货号R6834-01 50 preps）提取组织中总RNA，使用RT reagent Kit（日本Takara公司，货号RR037A）将RNA逆转录为模板cDNA，使用SYBR green master mix试剂盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号11201ES03］进行Real-time PCR反应。以GAPDH为内参基因，实验数据以2-ΔΔCt法进行计算。3 结果3.1　淫羊藿活性成分及靶点的获取利用TCMSP数据库检索淫羊藿，共得到130个化合物，设置OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，获得23个活性化学成分，包括22，23-二氢菜子甾醇、三溴乙酸乙酯、食脂素、金圣草黄素、木犀草素、谷甾醇、β-谷甾醇、24-表氨酯、8-异戊烯醇、C-高海桐素，1，6-二脱氢-3，15，16-三甲氧基-，（3β）、淫羊藿苷、脱水甘油3-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚、乙酸亚油醇脂、脱水淫羊藿素、淫羊藿C、淫羊藿A、淫羊藿E、槲皮素、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮、1，2-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）丙烷-1，3-二醇、6-羟基-11，12-二甲氧基-2，2-二甲基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1H-异色素no［3，4-h］异喹啉-2-鎓、橄榄树脂素、淫羊藿苷A7。利用TCMSP数据库得到23个活性成分所对应的潜在靶点蛋白，并在Uniprot数据库中对靶点蛋白进行校正和去重后，共筛选出218个靶点，见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T002表2淫羊藿有效化学成分Table 2Effective ingredients of Epimedii Herb编号化合物名称OB/%DLYYH122，23-二氢菜子甾醇24-epicampesterol37.580.71YYH2三溴乙酸乙酯linoleyl acetate42.100.20YYH3β-谷甾醇poriferast-5-en-3beta-ol36.910.75YYH4食脂素DFV32.760.18YYH5金圣草黄素chryseriol35.850.27YYH68-异戊烯醇8-isopentenyl-kaempferol38.040.39YYH7谷甾醇sitosterol36.910.75YYH8山柰酚kaempferol41.880.24YYH9olivil62.230.41YYH10脱水淫羊藿素anhydroicaritin45.410.44YYH11C-高海桐素，1，6-二脱氢-3，15，16-三甲氧基-，（3β）C-homoerythrinan，1，6-didehydro-3，15，16-trimethoxy-，（3.beta.）-39.140.49YYH12淫羊藿AYinyanghuo A56.960.77YYH13淫羊藿C yinyanghuo C45.670.50YYH14淫羊藿E yinyanghuo E51.630.55YYH156-羟基-11，12-二甲氧基-2，2-二甲基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1H-异色素no［3，4-h］异喹啉-2-鎓 6-hydroxy-11，12-dimethoxy-2，2-dimethyl-1，8-dioxo-2，3，4，8-tetrahydro-1H-isochromeno［3，4-h］isoquinolin-2-ium60.640.66YYH168-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮8-（3-methylbut-2-enyl）-2-phenyl-chromone48.540.25YYH17脱水甘油3-O-α-L-鼠李糖苷anhydroicaritin-3-O-α-L-rhamnoside41.580.61YYH181，2-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）丙烷-1，3-二醇 1，2-bis（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）propan-1，3-diol52.310.22YYH19淫羊藿苷icariin41.580.61YYH20淫羊藿苷A7 icariside A731.910.86YYH21木犀草素 luteolin36.160.25YYH22橄榄树脂素magnograndiolide63.710.19YYH23槲皮素quercetin46.430.283.2　少弱精症的作用靶点及淫羊藿活性成分关键靶点筛选利用GeneCards数据库、OMIM数据库检索少弱精症靶蛋白，整合去重后得到少弱精症相关靶蛋白770个。将23个淫羊藿活性成分对应的潜在靶蛋白与少弱精症相关蛋白匹配后取交集，得到50个重复靶点对应21个淫羊藿活性成分，表明这些靶点与淫羊藿治疗少弱精症密切相关，见增强出版附加材料。3.3　淫羊藿活性成分-基因靶点-少弱精症网络构建利用Cytoscape 3.9.0软件，构建淫羊藿活性成分-少弱精症靶点网络图。结果显示，淫羊藿通过21个活性成分作用于50个淫羊藿-少弱精症共同靶点，这50个蛋白靶点可能与淫羊藿治疗少弱精症相关，该网络由442个节点和221个条边构成，表明淫羊藿治疗少弱精症多成分、多靶点的特征。图中浅蓝色长方形代表少弱精症，浅红色倒三角代表淫羊藿，绿色椭圆代表淫羊藿活性成分，橘色椭圆代表淫羊藿-少弱精症共同靶点，见增强出版附加材料。3.4　PPI网络构建将50个与淫羊藿治疗少弱精症关键靶点导入STRING数据库中，隐藏1个无相互作用的节点，得到PPI网络。将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.0软件中，结果显示49个蛋白发生相互作用，产生864个节点，432个蛋白之间相互作用的边。根据Degree值筛选出排名前30的核心靶蛋白，Y轴为基因名，X轴为相应基因邻接节点数目。在NCBI上查阅这30个基因的空间表达模式，选取在睾丸中高量表达的6个核心靶蛋白进行功能注释，分别为细胞肿瘤抗原P53（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、Caspase-3、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（ERBB2）、Caspase-9。蛋白质分子之间的相关性结果表明，这6个蛋白质可能是淫羊藿改善少弱精症精子质量的关键靶点。见增强出版附加材料。3.5　GO功能富集分析利用DAVID数据库对淫羊藿治疗少弱精症的50个核心蛋白靶点进行在线GO富集分析，设定筛选标准P0.01。结果显示，50个核心蛋白富集到298个生物过程（BP），59个分子功能（MF），25个细胞组成（CC），据此绘制GO term BP、CC、MF三合一二级分类柱状图，Y轴为富集基因数目，X轴表示富集通路，每个通路按照基因数目由多到少排序。按照P值升序排列，筛选前20个GO注释，见表3和增强出版附加材料。结果显示，16个与生物过程相关，1个与细胞组成，3个与分子功能相关。富集的GO功能主要包括酶结合、一氧化氮生物合成正调控、同蛋白结合、有毒物质反应、细胞增殖负调控、药物反应、抗生素反应、凋亡、凋亡负调控等。结果表明淫羊藿通过多种机制治疗少弱精症。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T003表3淫羊藿治疗少弱精症潜在靶点GO条目Table 3GO functional enrichment analysis of common targets分类生物过程基因数/个%P分子功能酶结合enzyme binding1632.71.20×10-14生物学过程一氧化氮生物合成正调控positive regulation of nitric oxide biosynthetic process816.32.90×10-11分子功能同蛋白结合identical protein binding1632.71.20×10-9生物学过程有毒物质反应response to toxic substance816.34.10×10-9生物学过程细胞增殖负调控negative regulation of cell proliferation1224.51.10×10-8生物学过程药物反应response to drug1122.41.20×10-8生物学过程抗生素反应response to antibiotic612.22.90×10-8生物学过程凋亡apoptotic process1326.54.50×10-8生物学过程凋亡负调控negative regulation of apoptotic process1224.54.70×10-8生物学过程xenobiotic metabolic process714.38.70×10-8分子功能heme binding816.31.10×10-7生物学过程positive regulation of transcription，DNA-templated1224.51.60×10-7生物学过程intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage612.22.20×10-7生物学过程response to estradiol714.32.20×10-7生物学过程positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter1530.63.70×10-7生物学过程cellular response to organic cyclic compound612.26.90×10-7生物学过程positive regulation of gene expression918.46.90×10-7生物学过程cellular response to lipopolysaccharide714.37.90×10-7生物学过程response to glucocorticoid612.21.10×10-6细胞组成extracellular space1632.71.10×10-63.6　KEGG信号通路富集分析为了揭示淫羊藿治疗少弱精症的相关通路，对50个靶点通过DAVID数据库进行KEGG分析，得到与淫羊藿改善少弱精症精子质量的83条相关通路。根据基因富集数筛选前20条途径绘制气泡图，包括癌症的途径、microRNA与癌症、HIF-1信号通路、癌症中的蛋白多糖、前列腺癌、PI3K/Akt信号通路、P53信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、膀胱癌、大肠癌、凋亡等。见增强出版附加材料。3.7　淫羊藿活性成分与少弱精症相关核心蛋白的分子对接利用分子对接技术对网络药理学结果进一步分析。根据淫羊藿活性成分-基因靶点-少弱精症网络筛选得到6个活性成分，分别为槲皮素、淫羊藿苷、山柰酚、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮、脱水淫羊藿素、8-异戊烯醇。根据PPI结果，选取度值排名前10的蛋白，再跟进各个蛋白在精巢中的表达情况，选取6个蛋白，分别为TP53、EGFR、PTGS2、Caspases-3、ERBB2、Caspases-9，作为对接靶蛋白，见表4。结果显示，活性成分与靶点蛋白的结合能介于-6.2~-9.2 kcal·mol-1（1 cal≈4.186 J），结合能越低，表明活性成分与少弱精症核心蛋白靶点之间亲和力越高见增强出版附加材料。对结果进一步分析发现，淫羊藿苷、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮、8-异戊烯醇3个活性成分与核心蛋白结合能力较强。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T004表4淫羊藿主要活性成分与核心靶点的分子对接评分Table 4Core targets and molecular docking results of main active ingredients成分TP53PTGS2ERBB2EGFRCaspases-9Caspases-38-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮-7.6-9.2-7.0-7.1-7.4-7.78-异戊烯醇-10.6-9.5-6.9-7.4-6.6-7.6脱水淫羊藿素-8.5-8.0-7.0-7.5-6.6-7.3淫羊藿苷-8.6-8.7-7.3-8.5-7.9-9.2槲皮素-7.7-8.7-6.6-7.1-6.2-7.5山柰酚-7.8-9.0-6.6-8.0-6.4-7.5kcal·mol-13.8　淫羊藿苷对环磷酰胺诱导的少弱精症模型大鼠睾丸中TP53、EGFR、PTGS2、Caspase-3、ERBB2、Caspase-9 mRNA表达量的影响根据上述结果，选取结合能力较优良的化合物单体淫羊藿苷，通过对各组大鼠精子质量比较，检测淫羊藿苷对大鼠精子质量的影响。结果显示，少弱精症模型组和淫羊藿苷组的精子密度、精子活率及精子活力均明显低于空白组（P0.05）；淫羊藿苷组大鼠精子密度、精子活率和活力均明显高于模型组（P0.05），见表5。由结果可知，淫羊藿苷可改善少弱精症模型大鼠的精子质量。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T005表5各组大鼠精液质量比较 （x¯±s，n=10）Table 5Comparison of semen quality （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg密度（×106 个/mL）精子活率/%精子活力/%空白组42±4.3560.55±5.1241.22±5.34模型组0.050215±3.761，2）25.63±4.311）15.04±4.271）淫羊藿苷组3620±6.781，2）29.32±6.611，2）20.40±3.981，2）注：与对照组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05与空白组比较，模型组大鼠睾丸组织内，6个核心靶基因TP53、EGFR、PTGS2、Caspases-3、ERBB2、Caspases-9的mRNA表达量均显著上调（P0.01）；与模型组相比，淫羊藿苷组大鼠睾丸组织中TP53、EGFR、PTGS2、Caspase-3、ERBB2、Caspase-9的mRNA表达量均显著下调（P0.01），见表6。以上结果表明，淫羊藿苷可通过调控上述6个核心基因表达改善少弱精症大鼠精子质量。10.13422/j.cnki.syfjx.20220712.T006表6淫羊藿苷对核心靶点基因表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of icariin on expression of core targets （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1TP53Caspase-9Caspase-3ERBB2EGFRPTGS2空白组0.617±0.0200.599±0.0130.606±0.0080.568±0.0040.292±0.0210.040±0.016模型组0.0501.052±0.2251）1.280±0.0881）1.156±0.0281）0.958±0.0541）0.593±0.0231）0.126±0.0051）淫羊藿苷干预组360.808±0.0162）0.946±0.0461，2）0.953±0.0491，2）0.765±0.0211，2）0.464±0.0472）0.080±0.0031，2）注：与空白组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.014 讨论男性不育为男科常见疾病之一，近20年由于自然和社会环境变化，和诸多不良因素的影响，男性不育患者发病率呈上升趋势。临床上导致男性不育常见病因主要是少弱精症，表现为精子密度和精子活力低，少弱精症占男性不育患者的70%［17］。目前，绝大部分男性不育症患者的发病机制及病因尚不完全明确，通过西医治疗特发性男性不育的效果欠佳。近年研究表明淫羊藿中药复方在治疗少弱精症及其他男科疾病中起到了积极作用。但对于淫羊藿治疗少弱精症的机制尚不明确。本研究通过网络药理学对淫羊藿治疗男性少弱精症的机制进行研究，构建淫羊藿活性成分-关键蛋白靶点网络图，发现槲皮素、淫羊藿苷、山柰酚、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮、脱水淫羊藿素、8-异戊烯醇这6种活性物质的节点度值较高，推测这些活性物质在治疗少弱精症发挥了重要的作用。通过对50个关键蛋白基序GO功能富集和KEGG通路分析，推测淫羊藿活性成分的靶点可能是通过调控P53信号通路、癌症途径、细胞增殖和凋亡等，达到改善少弱精症精子质量的作用。通过PPI网络分析的到的6个靶点TP53、EGFR、PTGS2、Caspase-3、ERBB2、Caspase-9，其中TP53是P53信号通路的关键成分［18］。TP53是一个肿瘤抑制基因，被称为“基因组守护者”，为一段能编码393个氨基酸残基的转录因子，与基因组DNA特异性结合从而调控靶基因表达，通过多种生物学过程调控细胞凋亡［19-22］。细胞凋亡是一个细胞程序性死亡的过程，是精子正常发生所必需的。在精子发生过程中，细胞凋亡维持着生殖细胞的恒定数量，有助于实现最佳的生精细胞-支持细胞比例，并消除携带受损DNA的缺失生精细胞。因此，细胞凋亡在正常精子产量中起着重要作用。然而，生殖细胞过度凋亡往往导致男性不育［23］。人类精液研究表明，肥胖型男性精子质量下降的部分原因是Sirt1表达下调和P53乙酰化［24-27］。YAN等［28］研究表明垂体腺苷酸环化酶激活肽可通过激活蛋白激酶A（PKA）/环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）/沉默信息调节因子1（Sirt1）/P53信号通路减少生精细胞的凋亡，从而防止肥胖诱导的男性生殖损伤。LI等［29］利用比较蛋白质组学和转录组学联合分析方法表明，重离子辐射诱导的DNA损伤可通过P53信号通路介导精原细胞凋亡，导致男性不育。EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号转导的受体，与肿瘤细胞增殖、血管发生、及细胞凋亡的抑制相关。已有研究表明EGFR在人附睾中表达，通过免疫细胞化学实验显示，EGFR被定位于基底细胞、主细胞及相邻的主细胞之间。在无精子症患者中，EGFR在附睾中的表达降低［30］。生精小管壁中的饰胶蛋白聚糖具有干扰生长因子信号的能力，在精子发生受损的男性中，饰胶蛋白聚糖在短时间内可显著增加磷酸化EGFR的表达，进而诱导强烈的有丝分裂反应，表明饰胶蛋白聚糖干扰睾丸管周细胞的GFRs信号，导致人睾丸旁分泌信号通路失衡［31］。端粒缩短被认为是细胞衰老的标志，受多种信号通路调控。通过生物信息学分析显示，补充抗氧化剂可以激活精子中与端粒功能相关的分子表达，如激酶EGFR、MAPK3，转录因子CCNE1、H2AX、MYC、RB1和TP53，表明抗氧化剂对精子端粒维持相关的转录因子和激酶在男性因素不育的治疗过程中具有有益的作用［32］。Caspase以非活性酶原形式表达，并参与响应促凋亡信号而触发的级联反应。迄今为止，已有14种半胱天冬酶参与人类凋亡途径级联反应。其中，Caspase-3被认为是一种主要的执行蛋白酶。Caspase级联的适当调节在精子分化和睾丸成熟中起着重要作用。Caspase参与了多种男性疾病的发病机制，如精子发生障碍、精子活力降低和精子DNA断裂水平升高、睾丸扭转、精索静脉曲张和免疫性不孕［33-37］。本研究结果表明，较空白组，少弱精症模型大鼠睾丸组织中，靶蛋白的表达均显著上调；经淫羊藿苷干预少弱精症模型大鼠后，与空白组比较，潜在靶点的表达均显著下调，提示淫羊藿苷可下调少弱精症模型大鼠中靶蛋白的表达。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一，属于黄酮醇苷类化合物。研究表明淫羊藿苷在调节细胞凋亡、炎性反应及氧化应激等方面具有重要的作用，同时其在生殖系统疾病的治疗过程中也具有重要的药理作用。淫羊藿苷可以促进视黄酸诱导的P19细胞增殖和向生精细胞方向分化进程［36］，对酒精损伤小鼠睾丸生精细胞具有保护作用［39］。淫羊藿苷对环磷酰胺诱导产生的生精障碍大鼠睾丸生精小管结构有明显改善作用，减少生精细胞凋亡，促进精子发生，且血清中睾酮水平显著提高，推测其可能是通过抑制TP53基因的表达，抑制活性氧产生，进而抑制Caspase-3激酶的活化，达到抑制细胞凋亡的作用［40］。由此说明，淫羊藿苷治疗少弱精症的机制可能是通过淫羊藿有效化学成分通过调控与细胞凋亡相关蛋白及信号通路的表达，抑制生精细胞凋亡，达到改善少弱精症精子质量的作用。综上所述，本研究对传统补益类中药淫羊藿进行了多方面、多角度的研究，初步阐释了淫羊藿对抗少弱精作用的机制。通过淫羊藿活性成分-基因靶点-少弱精症网络预测淫羊藿治疗少弱精症的药效物质基础可能是槲皮素、淫羊藿苷、山柰酚、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮、脱水淫羊藿素、8-异戊烯醇，通过关键靶点TP53、EGFR、PTGS2、Caspase-3、ERBB2、Caspase-9在P53信号通路、癌症途径、细胞增殖和凋亡上发挥重要作用，表明淫羊藿是通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗少弱精症的作用，可为后期的作用机制研究及临床应用提供一定的参考依据。