目前，我国将妊娠不足28周、胎儿体质量不足1 000 g而妊娠终止者定义为自然流产（SA）［1］。SA是临床最常见妊娠并发症，育龄期女性发生一次SA的概率约10%，无论是自然妊娠还是通过辅助生殖技术妊娠者，SA发生率近年呈明显上升趋势［2］，SA发展阶段分为先兆流产、难免流产、不全流产及完全流产等，反复SA严重影响到患者身心健康、家庭和睦及社会人口稳定。SA致病因素复杂，现代医学治疗SA主要有纠正内分泌异常、提高黄体功能、平衡免疫、抗凝治疗及补充维生素等，其有效性及安全性仍缺乏强有力的证据 ［1-3］。近年大量文献报道［4-5］现代医学联合中医药治疗的妊娠结局优于单纯使用黄体酮，更能发挥优势互补的疗效，可明显提高安胎成功率。SA属中医“胎漏” “胎动不安”，课题组四川省名中医曾倩教授基于《黄帝内经·素问·奇病论》“胞络系于肾”，“肾藏精……为胎孕之本”及《胎产遗论》“胎茎系于脾，犹钟之系于梁也”，“其胎即堕……气血又籍脾胃饮食化生”等中医生殖思想，结合显著的临床疗效［6-7］，提出治疗SA以“系固胞络（补肾）” “稳健胎茎（健脾）”为安胎大法，强调脾、肾在安胎的各自重要性。虽然近年来多处文献报道指出健脾、补肾法安胎作用确切，且不良反应小、安全性均获认可，且该治法已纳入《中医妇产科学》教材，遗憾的是其疗效差异及药理机制仍未明晰。课题组前期通过挖掘安胎文献，结合临床前期研究成果［7］，筛选总结出补肾法代表方为“寿胎丸”及健脾法的代表方为“举元煎”并以此作为本研究机制探索的前提，见增强出版附加材料。课题组参考ZENG等［8］方法，以SA病理学视角切入，整合“临床药效-数据挖掘-文献考证-网络分析-机制验证”路径探讨寿胎丸与举元煎拮抗SA的效应及不同生物学异同机制，为中医“同病异治”理论提供病理学客观证据，为挖掘生殖疾病新靶点、安胎中药质量标志物（Q-Marker）识别、协同方-证效应机制研究提供参考数据。1 材料1.1　数据库与分析平台GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）；Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetpredic-tion.ch/）；STRING 11.5平台（https：//cn.string-db.org/）；中国知网（CNKI）平台（https：//gb.global.cnki.net/index/）；PubMed数据库（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；Web of Science（WOS）数据库（https：//www.webofscience.com/）；Metascape分析平台（https：//metascape.org/）；BATMAN中药预测数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）；微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）。1.2　寿胎丸/举元煎药物组成“胞络系肾”补肾法代表方寿胎丸（张锡纯·《医学衷中参西录》上册》）组成为桑寄生（产地四川，批号21080132）10 g、续断（产地四川，批号20090013）10 g、菟丝子（产地宁夏，批号21080067）20 g、阿胶（批号21080037）10 g；“胎茎系脾”健脾法代表方举元煎（张介宾·《景岳全书》卷五十一）组成为人参（产地吉林，批号21050001）20g、黄芪（产地甘肃，批号21100167）10 g、升麻（产地内蒙古，批号21070166）5 g、白术（产地新疆，批号21090076）5 g、甘草5 g（产地新疆，批号21090076）。以上中药饮片从成都中医药大学附属医院药剂科处购买，由药理科李涓主任药师进行鉴定，质量控制均符合2020年版《中华人民共和国药典》要求，通过四川绿色药业科技发展股份有限公司（水提-分离-浓缩-干燥-制粒标准法）制备成配方颗粒剂，方法符合国家药监局2021年1月颁布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，编号XLS-09-MP-0013-OR01（05）。1.3　动物雌性与雄性SPF级SD大鼠各40只，8周龄，体质量为200~240 g，由成都达硕动物实验公司［动物饲养合格证号SCXK（川）2019-028］提供，于达硕动物中心SPF级动物饲养房［动物实验许可证号SCXK（川）2019-189］适应性饲养1周，温度（22±2）℃，湿度（75±5）%，清洁饮水，昼夜控制各12 h［9］。1.4　主要试剂雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受体-1（ESR-1）、孕激素受体（PGR）、D二聚体（D-Dimer）、白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-18（上海西唐生物科技公司，货号分别为F15321、F16576、F15352、F60241、F15300、F15820、F15850、F15870、F15950），苏木素、伊红染色液（武汉塞维尔公司，货号分别为CR2102133、CR2101094），B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）一抗（北京博奥森公司，货号BS-20352），血管内皮生长因子（VEGF）一抗、生物素化山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G（H+L）（英国Abcam公司，货号Ab40815、Ab6789），基质金属蛋白酶（MMP）-2、E-钙黏蛋白（E-Cad）一抗（美国Proteintech公司，货号分别为66366-1-Ig、20874-1-AP），MMP-9一抗（武汉Abclonal公司，货号A0289）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（美国Affinity公司，货号s0001）。米非司酮（Ru486）（华润紫竹公司，货号43180506），地屈孕酮片（荷兰Abbott Biologicals公司，货号363103）。1.5　仪器YZB/USA1802-2009型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），5424R型高速低温台式离心机（德国Eppendorf 公司），Synergy H1MF型酶标仪（美国BioTek公司）；ECLIPSE Ci型显微镜（日本尼康株式会社），VS200型数字切片扫描仪（日本Olympus公司）；TripleTOF5600型MASS质谱仪（美国AB SCIEX公司），Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色谱（UHPLC）仪（日本Shimadzu公司）；Q Exactive UHMR型高分辨质谱仪（美国ThermoFisher公司）。2 方法2.1　SA靶点检索通过GeneCards数据库筛选SA靶点，使用Elasticsearch 7.11进行“Spontaneous Abortion”相关基因检索范式，通过Lucene布尔模型、TF（文档Term词频）/IDF（Term逆文档频率）和向量空间模型组合分析包，收集匹配的最新文献关键词并随时对其相关性进行评分。设置相关性分数（Score）中位数以上作为SA潜在靶点［10］。2.2　SA病理过程筛选使用Metascape平台通过进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析（最小重叠数为3；P≤0.01；最小富集值为1.5）获取SA调控的生物学过程及相关通路Term，根据实验研究文献进行逐步筛选，确定主要SA病理调控表型及相关靶点。将SA病理相关靶点带入STRING平台（最低蛋白互作分数≥0.7）进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析后导出TSV格式，通过Cytoscape V3.8.0计算网络节点的连接度（Degree）、介度（Betweenness）和紧密度（Closeness）。根据CNKI、PubMed、WOS数据库平台的相关临床、实验研究报道进行二次筛选并确立SA网络中的核心靶点。2.3　高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）检测寿胎丸/举元煎化学成分选取寿胎丸/举元煎颗粒样本于冰上缓慢解冻；取寿胎丸/举元煎样本50 mg于2.0 mL离心管中，加80%甲醇800 μL，频率65 Hz，研磨90 s，涡旋振荡充分混匀；4 °C超声30 min；于-20 °C静置1 h；于4 °C，12 000 r·min-1下离心15 min，离心半径5 cm；移取上清200 μL，加入内标二氯苯丙氨酸（0.14 g·L-1）5 μL，混匀后转入进样小瓶中。使用LC-MS技术进行检测。扫描模式一级全扫描（m/z 0~1 050）与数据依赖性二级质谱扫描（参数为dd-MS2，TopN=10）；分辨率参数为70 000（一级质谱）及17 500（二级质谱）；碰撞模式为高能量碰撞解离（HCD）。2.4　寿胎丸/举元煎活性成分筛选通过Analysis Base File Converter软件将LC-MS获得的原始数据转换成ABF格式，将ABF格式文件导入MS-DIAL 4.60软件进行预处理，包括峰提取、去噪音、反卷积，峰对齐，导出CSV格式的原始数据矩阵。提取的峰信息与mz Valult、mz Cloiud数据库及参考文献进行比对，对匹配结果进行参数过滤：Area≥80 000，mzCloud Best Match或mzVault Best Match≥90。成分采用Pubchem数据库获得成分SDF结构参照范芳芳等［11］方法利用里宾斯基规则（RO5）筛选参数［12］：相对分子质量（MW）500，氢键供体数（Hdon）≤5，氢键受体数量（Hacc）≤10，脂水分配系数（lgP）≤5和可旋转键数（Rbon）≤10，同时结合有效成分结合文献报道进行综合评估，符合条件的作为潜在活性成分。2.5　寿胎丸/举元煎作用SA靶点预测通过SwissTargetPrediction数据库（预测值0）、BATMAN数据库（SCORE≥20）结合文献预测寿胎丸/举元煎对SA病理环节靶点进行评估，构建寿胎丸、举元煎的GO及KEGG（方法同2.2项）差异化富集分析，通过Cytoscape构建预测网络。2.6　寿胎丸/举元煎逆转SA大鼠妊娠结局的安胎差异机制2.6.1　SA大鼠模型建立根据阴道涂片选取动情期雌性大鼠与雄性大鼠1∶1合笼，第2天行阴道镜检查见精虫记为妊娠第1天（1.0 dpc），建立妊娠模型。于7.0 dpc予以米非司酮（Ru486）灌胃（3.75 mg·kg-1）构建为SA模型［13］，所有动物实验设计和方案均获得成都中医药大学附属医院动物伦理委员会同意和批准（伦理批号2021DL-007）。2.6.2　分组与干预处理妊娠模型建立后，分为5组（空白组、模型组、寿胎丸组、举元煎组、地屈孕酮组）。自1.0 dpc开始给药灌胃，给药剂量成人（70 kg）和大鼠（0.2 kg）体表面积折算等效剂量法计算［9］，通过前期预实验筛选最优剂量为临床等效剂量10倍，对SA大鼠分别给予同单位寿胎丸最优剂量（3.21 g·kg-1·d-1）及举元煎最优剂量（3.09 g·kg-1·d-1）配方颗粒药液灌胃处理，地屈孕酮组予以地屈孕酮（3.02 mg·kg-1·d-1）灌胃处理［14］，空白组及模型组予以同等体积的0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理，从1.0 dpc开始干预各给药组连续用药10 d。末次给药24 h后，处死大鼠并解剖分离各组孕鼠妊娠子宫，称质量并计算子宫脏器比，胚胎-蜕膜位置无菌剥离后，每只孕鼠取5个着床部位。一部分蜕膜组织用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净后用移液枪吸取装入冻存管-80 ℃保存备用；取相同部位的另一部分蜕膜组织置于4%多聚甲醛溶液或2.5%戊酸乙二醛中固定备用。2.6.3　胚胎丢失率等级评估对大鼠子宫进行纵向解剖，并计算胚胎存活率和丢失率，根据赖裕玲等［15］对子宫妊娠情况进行等级评估，每组胚胎丢失率=各组丢失胚胎数／（各组丢失胚胎数+各组存活胚胎数）×100%。2.6.4　苏木素-伊红（HE）染色研究子宫蜕膜病理改变参照课题组前期方法［16］进行检测（2.6.4至2.6.8项研究方法同），蜕膜组织于4%多聚甲醛液固定后，石蜡包埋、切片，制成4 μm厚的组织病理切片，进行HE染色、封片，比较各组大鼠滋养层、蜕膜层组织形态学差异。2.6.5　透射电镜（TEM）研究蜕膜超微结构用锋利刀片切取目标病变部位蜕膜组织块约1 mm3，不超过米粒样大小，经2.5%中性戊二醛溶液前固定2 h，按照TEM标准步骤使用电子显微镜观察子宫内膜上皮细胞（EEC）层至基质层结构、调试电镜至图像清晰，采集需要的图像。2.6.6　酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测外周血E2、P及蜕膜组织匀浆ESR-1、PGR、IL-2、IL-4、IL-6、IL-18蛋白表达按照ELISA试剂盒说明书进行操作，计算百分结合率，得出E2、P、ESR-1、PGR、IL-2、IL-4、IL-6、IL-18浓度。2.6.7　免疫组化（IHC）检测VEGF、Bcl-2表达按实验步骤进行组织标本石蜡切片脱蜡至水、使用柠檬酸盐缓冲液抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭。滴加VEGF（1∶400）、Bcl-2（1∶200）一抗，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃，30 min；PBS洗3次，每次5 min；再依次进行DAB显色、复染细胞核、脱水封片。使用显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再分别采集400倍显微图像（统一设置色温6 500，亮度40%。对比度-20%），共采集3张。使用Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。2.6.8　免疫荧光（IF）检测MMP-2、MMP-9、E-Cad表达参照杨春荣［17］IF方法进行检测，按实验步骤通过石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、血清封闭。加入MMP-2、MMP-9（1∶50）和E-Cad（1∶100）一抗，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃ 30 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加DAPI，室温孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；使用抗荧光衰减封片剂封片。使用显微摄像系统先于50倍下观察子宫组织整体，采集400倍个视野区3次。采用Image-J分析系统（V1.80）测定采集全部图像荧光强度及面积，并计算每张图像的平均荧光强度（MGV），以3张图像平均荧光强度计样本平均数。2.7　统计学分析使用SPSS V25.0软件对数据进行统计学分析，数据采用x¯±s表示，各组样本间计量资料比较采用One-way ANOVA或Kruskal-Wallis检验，事后检验采用最小显著性差异法（LSD）或Tamhane's T2分析方法，计数资料采用卡方检验，P0.05表示差异有统计学意义。生信分析结果根据富集值（Enrichment）、Count值、校正后P值（Q值）通过微生信平台和Graph Pad（V9.0）以条形图或气泡图形式输出。3 结果3.1　SA核心病理学环节筛选结果本研究共获得SA作用靶点424个（检索时间2021年4月3日），通过GO/KEGG富集分析后（检索时间2021年4月4日）获得315条生物学过程、97条分子功能、96条细胞组分、103条相关信号通路。通过CNKI、PubMed、WOS数据库文献逐步筛选考证，确定SA核心病理学过程共4条，分别为细胞黏附（GO：0022407）、细胞死亡调控（GO：1904035）、炎症反应（GO：0050727）及血管生成（GO：0045765）的调控，见表1。根据PPI分析及C-ytoHubba分析结果，剔除文献报道中与SA无关联性靶点，最终获得SA核心靶点包括VEGF-A、IL-6、TNF、MMP-2、MMP-9等共计24个，信息列表见表2，SA病理调控网络详见图1和增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T001表1SA核心病理生物学过程及解析表Table 1SA core pathobiological process and analysis tableGO号SA病理环节-lgQIn/Term对不良妊娠结局的影响文献引证0030155细胞黏附调控58.9296/760细胞黏附相关因子参与胚胎着床、蜕膜血管新生、滋养细胞侵入、子宫内膜上皮细胞与基质细胞重构等重要进程，细胞间黏附分子基因C469T多态性已明确与SA密切相关［18-20］0050727炎症反应调控39.6559/394炎症反应为母胎界面免疫调节的局部表现，固有性免疫系统与特异性免疫系统的稳态失衡造成母胎界面炎症反应变化异常，不利于母胎界面交叉对话，进而导致SA的发生［21-23］0010942细胞死亡正向调控37.1067/604SA末端表型，受相关病理因素诱导后，细胞程序性死亡（PCD）失衡状态影响母胎界面蜕膜重建、血管生成、滋养层侵袭及免疫耐受平衡进而导致SA［24-26］0045765血管生成调控21.2239/345血管生成受母胎界面促血管生成因子、低氧诱导因子、转化生长因子与其抑素网络平衡调控。SA存在蜕膜血管减少、血管内皮细胞结构破坏等重要病理变化［27-29］10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T002表2参与SA主要病理环节的核心靶点Table 2Core targets involved in main pathological links of SAGC IDSymbol相关SCORE连接度介度紧密度参与的SA病理环节文献引证07P022725IL-66.94220.047 80.923 1①②③④［22］06P076864TNF6.71190.024 00.827 6①②③④［13］06P043770VEGF-A6.58160.018 60.750 0①④［28］01M206767IL-106.28210.039 50.888 9①②③④［21］09P004985JAK-26.19110.005 70.648 6①②③［30］11M112143IL-185.10120.001 00.666 7①②［23］12M068154IFNG4.89160.013 70.750 0①②③［35］19M041301TGF-β14.89140.009 20.685 7①［31］12P112418PTPN-114.52100.011 00.631 6①［32］06P151656ESR-14.0740.000 40.545 5②［31］02M112829IL-1β3.85200.046 80.857 1①②④［33］12P006786CD43.53140.007 50.705 9①［26］04P073740CXCL-82.88150.008 40.727 3①④［34］05P132673IL-42.41160.010 00.750 0①④［35］17P034255CCL-22.32150.009 30.727 3①③［30］20P046008MMP-92.25130.004 90.666 7②③［36］16P055390MMP-22.25120.003 00.648 6①③［36］17M042313STAT-32.16230.075 90.960 0④［37］06P076821HLA-A2.0820.000 00.470 6①［38］04M122451IL-22.01160.050 80.750 0①②［39］03P159988IL-12A1.97110.002 80.648 6①③［40］02M190908STAT-11.33150.056 60.727 3④［41］04P122826FGF-21.29140.011 00.685 7④［42］12P057101IL23-A1.24120.009 40.666 7①②［43］11P018449SAA-10.9890.000 00.600 0①②［44］注：①细胞黏附调控（GO：0022407）；②细胞死亡正向调控（GO：1904035）；③炎症反应调控（GO： 0050727）；④血管生成调控（GO：0045765）10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.F001图1SA靶点调控病理网络Fig.1Network diagram of SA target regulating pathology注：A.SA涉及的主要病理学过程；B.SA靶点-病理过程网络调控图（节点大小代表SA-Score相关性评分，节点越大，相关性越强）；C.SA病理学靶点蛋白互作网络［节点大小代表度（Degree）值，节点越大，度值越大］，C中各靶点不同颜色代表不同参与的SA病理学过程，与B图病理学过程颜色相一致3.2　寿胎丸、举元煎物质鉴定结果及活性成分筛选通过LC-MS筛选，对寿胎丸、举元煎成分应用ADME性质及里宾斯基五规则进行评估，发现共同活性成分10个，以黄酮类化合物居多，包括芹菜素、金雀异黄素、柚皮素、腺苷、阿魏酸等，共得到潜在寿胎丸特异活性成分13个，以有机酸类化合物居多，包括异鼠李素、槲皮素、杜鹃花酸、L-正亮氨酸、D-（-）-奎宁酸、2-羟基肉桂酸等；健脾安胎代表方举元煎特异活性成分14个，以黄酮类化合物居多，包括白杨素、高良姜素、3，4-二甲氧基肉桂酸、3，7，4′-三羟基黄烷酮、甘草查尔酮A等，见表3和增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T003表3寿胎丸/举元煎差异活性成分信息Table 3Information list of specific active ingredients of Shoutaiwan/Juyuanjian序号CAS号活性成分分子结构m/ztR/minArea对数归属方剂离子模式中文英文1480-19-3异鼠李素isorhamnetinC16H12O7340.236.996.97寿胎丸［M+H］+2117-39-5槲皮素quercetinC15H10O7303.055.676.73寿胎丸［M+H］+3123-99-9杜鹃花酸azelaic acidC9H16O4187.095.478.45寿胎丸［M-H］-4327-57-1L-正亮氨酸L-norleucineC6H13NO2132.101.477.52寿胎丸［M+H］+536413-60-2D-（-）-奎宁酸D-（-）-quinic acidC7H12O6191.053.757.93寿胎丸［M-H］-614375-45-2（±）-脱落酸（±）-abscisic acidC15H20O4263.136.167.49寿胎丸［M-H］-714641-93-1α-乳糖α-lactoseC12H22O11387.110.849.02寿胎丸［M-H］-8451-13-82，5-二羟苯乙酸homogentisic acidC8H8O4167.032.976.87寿胎丸［M-H］-939524-08-8川续断皂苷Ⅵasperosaponin VIC47H76O18973.506.228.76寿胎丸［M-H］-1023627-87-4三叶豆苷trifolinC21H20O11447.094.968.06寿胎丸［M-H］-11905-99-7隐绿原酸cryptochlorogenic acidC16H18O9176.043.819.04寿胎丸［M-H］-12614-60-82-羟基肉桂酸2-hydroxycin-namic acidC9H8O3117.034.818.88寿胎丸［M-H］-13469-83-0咖啡醇catechinC15H14O6291.864.946.67寿胎丸［M+H］+14480-40-0白杨素chrysinC15H10O4255.064.427.23举元煎［M+H］+156665-74-3高良姜素galanginC15H10O5271.065.257.34举元煎［M+H］+162316-26-93，4-二甲氧基肉桂酸3，4-dimethyl-caffeic acidC11H12O4190.065.947.86举元煎［M+H］+1721913-99-53，4′，7-三羟基黄烷酮3'，4'，7-trihyd-roxyflavanoneC15H12O5273.074.677.07举元煎［M+H］+1858749-22-7甘草查尔酮Alicochalcone AC21H22O4339.168.917.71举元煎［M+H］+19530-59-6白芥子酸sinapinic acidC11H12O5175.043.846.71举元煎［M+H］+2035825-57-1隐丹参酮cryptotanshinoneC19H20O3297.1510.676.43举元煎［M+H］+21961-29-5异甘草素isoliquiritigeninC15H12O4255.076.149.40举元煎［M-H］-2292-61-5东莨菪内脂scopoletinC10H8O4191.034.947.03举元煎［M-H］-23548-77-6鸢尾黄素tectorigeninC16H12O6269.047.097.66举元煎［M+H］+241076-38-64-羟基香豆素4-hydroxyco-umarinC9H6O3163.045.107.12举元煎［M-H］-2580952-71-2人参皂苷R-RH120（R）-ginsen-oside Rh1C36H62O9683.446.897.91举元煎［M+H］+2684687-43-4黄芪甲苷Ⅳastragaloside ⅣC41H68O14829.467.078.31举元煎［M+H］+2773069-13-3白术内酯Iatractylenolide IC15H18O2231.1410.846.45举元煎［M+H］+3.3　寿胎丸/举元煎活性成分对SA病理环节的预测调控网络选取寿胎丸与举元煎的特异活性成分，通过BATMAN数据库（检索时间2021年4月22日）、SwissPredictionTarget数据库（检索时间2021年4月23日）结合文献报道分别预测寿胎丸、举元煎作用的核心差异靶点、调控主要的病理过程，绘制方剂-成分-靶点网络框架；通过BATMAN、SwissPredictionTarget数据库预测发现，寿胎丸中13个潜在成分可预测累计890个靶点，与SA靶点交集为70个靶点，举元煎中14个特异成分可预测累计428个靶点，与SA靶点交集为59个靶点；寿胎丸与举元煎共同10个潜在成分累计270靶点，与SA靶点交集为38个靶点，构健健脾、补肾生物学作用差异网络，以上结果证明寿胎丸、举元煎均参与细胞黏附、炎症反应、细胞凋亡、血管生成等过程治疗SA，富集值上举元煎对炎症反应（GO：0050727）的调控远高于寿胎丸，其余富集值差异较少见增强出版附加材料，需动物实验进一步验证与讨论。3.4　寿胎丸、举元煎可逆转SA模型大鼠病理进程的实验结果3.4.1　对妊娠丢失率的影响与空白组比较，模型组大鼠妊娠丢失率显著（P0.01），与模型组比较，寿胎丸组、举元煎组、地屈孕酮组大鼠妊娠丢失率均明显下降（P0.01），其中寿胎丸组、地屈孕酮组与举元煎组比较数值略低，但差异无统计学意义。在子宫脏器比研究中，与空白组比较，模型组大鼠子宫脏器比明显下降（P0.05），与模型组比较，寿胎丸组、举元煎组、地屈孕酮组大鼠子宫脏器比均明显提高（P0.05，P0.01），寿胎丸组、地屈孕酮组总体疗效略优于举元煎组。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T004表4各组大鼠妊娠丢失率、体质量、子宫重量及子宫脏器比表达 （x¯±s，n=6）Table 4Expression of pregnancy loss rate， body mass， ratio of uterine weight and uterine organ of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1各组妊娠丢失率/%入组体质量/g处死体质量/g子宫湿重/g子宫脏器比/%空白组2.59（3/116）2）203.76±15.17301.83±12.012.85±0.512）0.94±0.162）模型组0.003 7584.13（106/126）4）207.04±16.44300.17±16.421.63±0.254）0.55±0.114）寿胎丸组3.2126.47（27/103）2，4）199.42±14.03299.67±12.322.35±0.492，3）0.79±0.172，3）举元煎组3.0937.84（42/111）2，4）203.02±18.33300.83±13.422.22±0.401，3）0.74±0.111，3）地屈孕酮组0.003 0221.66（28/121）2，4）197.33±9.97301.17±12.422.42±0.572）0.80±0.192）注：与模型组比较1）P0.05，2）P0.01，与空白组比较3）P0.05，4）P0.01（表5-表7同）3.4.2　对SA大鼠蜕膜血供及细胞微观结构的影响空白组大鼠蜕膜组织的细胞质染色均匀，细胞界限清晰，可见滋养层细胞（TC）排列紧密、血管丰富。模型组大鼠子宫内膜蜕膜样变，蜕膜细胞变性、失去细胞间连接、部分细胞坏死、间质血管明显减少、细胞形态排列紊乱；与空白组比较，模型组大鼠蜕膜组织在微观结构下可见线粒体膨胀坏死、内质网增粗、有大面积细胞凋亡及坏死情况。寿胎丸、举元煎组、地屈孕酮组蜕膜组织细胞排列紧密、腺体形态完整、间质细胞排列规则、结构清晰、胞质染色均匀、血管生长良好、丰富，微观结构下仍存在内质网增粗、线粒体膨胀等情况，但情况相比模型组有明显好转，地屈孕酮组脂滴增加。寿胎丸、举元煎组、地屈孕酮组蜕膜和绒毛形态均成不同程度改变，血管数量增多，趋向空白组。以上结果证实寿胎丸、举元煎均在一定程度上可逆转SA大鼠蜕膜组织细胞黏附、连结、程序性细胞死亡以及血管生成等病理环节，见图2。选择空白组、模型组、寿胎丸组、举元煎组进行后续机制比较分析。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.F002图2各组大鼠子宫外观、蜕膜形态、蜕膜微观结构Fig.2Appearance of uterus， decidual morphology， and decidual microstructure of rats in each group注：A.空白组；B.模型组；C.寿胎丸组；D.举元煎组；E.地屈孕酮组；a.子宫外观（左侧）；b.子宫蜕膜光学下形态（HE，×50）；c.宫蜕膜光学下形态（HE，×400）；d.子宫蜕膜TEM下微观结构（TEM，×25 000）3.4.3　对E2、孕酮及其受体的表达影响与空白组比较，模型组大鼠外周血E2、孕酮以及蜕膜组织ESR-1、PGR表达均显著减弱（P0.01），D二聚体显著升高（P0.01）；与模型组比较，寿胎丸组、举元煎组外周血E2、孕酮表达以及蜕膜组织ESR-1、PGR的表达均名显上调（P0.05，P0.01），寿胎丸组D二聚体明显下调（P0.05），而举元煎组差异无统计学意义。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T005表5各组大鼠外周血D二聚体、雌孕激素以及蜕膜组织受体功能表达 （x¯±s，n=6）Table 5Expression of D2 polymer， estrogen， progesterone and decidual tissue receptor in peripheral blood of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1E2/ng·L-1孕酮/μg·L-1ESR-1/ng·L-1PGR/ng·L-1D二聚体/μg·L-1空白组67.63±4.482）5.18±0.452）141.17±20.072）144.87±21.992）154.76±45.572）模型组0.037 523.63±1.004）3.76±0.944）33.59±24.134）51.31±33.364）245.88±14.094）寿胎丸组3.2141.62±17.722） 4）4.69±0.671）127.62±47.322）119.45±32.852）175.2±57.921）举元煎组3.0937.70±11.341） 4）4.01±0.404）99.36±50.212）104.76±55.781）222.55±41.633）3.4.4　对MMP-2、MMP-9、Bcl-2、E-Cad、VEGF的表达影响通过IF及IHC检测显示，与空白组比较，模型组MMP-2（P0.05）、MMP-9（P0.01）、E-Cad（P0.01）蛋白相对表达均明显上调，而Bcl-2、VEGF均显著下调（P0.01）；与模型组比较，寿胎丸组、举元煎组MMP-2、MMP-9蛋白表达均明显降低（P0.05，P0.01），而Bcl-2表达均明显增加（P0.05）；在E-Cad蛋白变化上，相比模型组举元煎组明显（下调P0.05），寿胎丸组差异无统计学意义；在VEGF蛋白表达上，相比模型组寿胎丸组上调明显（P0.05），举元煎组差异无统计学意义。见表6和图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T006表6各组大鼠蜕膜组织MMP-2、MMP-9、Bcl-2、E-Cad、VEGF蛋白相对表达 （x¯±s，n=6）Table 6Relative expression of MMP-2， MMP-9， Bcl-2， E-Cad and VEGF in decidua of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1MMP-2MMP-9E-CadBcl-2VEGF空白组21.65±2.392）18.9±1.522）30.53±5.142）7.22±4.712）2.59±1.492）模型组0.037 530.08±3.543）27.56±4.434）40.02±6.234）1.21±1.164）0.40±0.214）寿胎丸组3.2124.67±5.231）22.45±3.431）33.68±6.235.69±4.261）1.86±1.231）举元煎组3.0922.98±4.562）22.07±4.021）31.47±4.471）6.53±3.001）1.30±0.353）%10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.F003图3各组大鼠子宫组织SA病理相关蛋白定位表达Fig.3Immunohistochemical map of uterine appearance， decidual morphology， decidual microstructure and related proteins of rats in each group注：A.空白组；B.模型组；C.寿胎丸组；D.举元煎组；a，d.MERGE（IF，×400）；b.MMP-2（红色，IF，×400）；c.MMP-9（绿色，IF，×400）；d，e.E-Cad（绿色）蛋白，DAPI（蓝色）（IF，×400）；f.Bcl-2（棕色）蛋白（IHC，×400）；g.VEGF（棕色）蛋白（IHC，×400）3.4.5　对IL-2、IL-4、IL-6、IL-18的蛋白表达影响通过ELISA检测显示，与空白组比较，模型组子宫组织IL-2与IL-6的蛋白表达均显著上调（P0.01），IL-4蛋白表达明显下调（P0.01）；与模型组比较，寿胎丸组、举元煎组可明显下调SA大鼠IL-2、IL-6蛋白表达（P0.05，P0.01），同时上调IL-4蛋白表达（P0.05，P0.01），从趋势来看，寿胎丸组在IL-2与IL-6的蛋白表达值比举元煎组更接近空白组，而举元煎组在IL-4的表达相比寿胎丸组更接近空白组；各组IL-18表达中，虽然模型组相比空白组、寿胎丸组、举元煎组有上调趋势，但差异无统计学意义。见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.T007表7各组大鼠蜕膜组织IL-2、IL-4、IL-6、IL-18的蛋白表达 （x¯±s，n=6）Table 7Protein expression of IL-2， IL-4， IL-6 and IL-18 in decidua of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1IL-2IL-4IL-6IL-18空白组49.44±12.913）7.07±3.291）113.48±42.282）28.55±8.20模型组0.037 5122.3±10.324）2.25±0.664）178.67±32.704）42.32±21.81寿胎丸组3.2163.78±26.152）5.22±1.781）122.70±23.012）28.37±7.29举元煎组3.0993.12±32.201） 4）4.15±1.773）136.94±28.091）35.64±27.31ng·L-14 讨论SA属于中医“胎动不安” “胎漏”等范畴，在临床上多以“健脾法” “补肾法”联合使用，其安胎疗效在既往研究中获得诸多报道［3-7］。但不同学派对脾、肾在安胎中的定位认识有所差异，如国家名中医尤昭玲教授提出先补肾重在“扎寨”、后健脾重在“安营”的安胎时空功能差异［6，45］，但缺乏生物学基础证据。近年来有学者提出利用网络药理学方法探索“同病异治”研究［46］，但其传统研究模式目前存在一定争议：①陈健等［47］认为物质基础筛选不应该单纯依赖中药数据库，大部分数据库中既无成分含量占比，也易与药物实际成分不符，复方组成并非数据库中单药成分简单叠加，诸多成分缺乏的调控靶点阈值缺乏证据出处；②ZENG等［8］认为传统网药“药物-疾病”靶点交集方式如过于简易、数据来源缺乏引证，既易造成核心病理靶点丢失，也易忽略中药调控病理演进过程；③课题组前期数据挖掘时发现较多数据库收录靶点与目标疾病关联缺乏临床或实验报道证据支持，与其检索策略算法局限性相关，单纯的靶点并集与交集均存在假阴性/阳性可能。因此，基于以上问题，本研究使用了整合药理学方法，通过GeneCards联合GO数据库发现SA相关生物学过程有315条，利用二次文献引证筛选其核心病理学过程涉及细胞黏附、细胞死亡、炎症反应、血管生成四大类型，进而以此为切入点，应用LC-MS技术、网络分析方法及实验验证初步探索补肾法代表方寿胎丸与健脾法代表方举元煎的“同病异治”安胎机制。4.1　健脾、补肾安胎法的共性机制逆转细胞死亡、过度炎症病理状态从本次综合药理学研究结果证实，寿胎丸与举元煎均能够逆转SA不同病理学环节达到安胎之用。寿胎丸、举元煎均可下调SA大鼠MMP-2、MMP-9、IL-2、IL-6等表达，上调ESR-1、PGR、IL-4、Bcl-2等表达。在PCD中，细胞凋亡在SA作用有大量研究报道，已证实凋亡蛋白Bcl-2家族、Fas/FasL通路、p53以及含胱天蛋白酶（Caspase）与SA有密切关系，在胚胎着床、胎盘的发育老化以及胎儿的生长发育中具关键平衡意义［24-26］。妊娠过程被认为是一种同种异体移植过程，妊娠初期时，胚泡附着于EEC，随后逐步形成的胎盘涉及滋养层侵入蜕膜的相关结构分解和重组。植入和早期胎盘形成的阶段类似于组织损伤和随后修复的过程，其中间产生剧烈的炎症波动，因此母胎界面抗炎与促炎形成的免疫稳态如辅助性T淋巴细胞（Th）1/Th2、调节性T细胞（Treg）/Th17系统平衡破坏被认为是SA发生的关键节点，SA大鼠模型IL-2、IL-6含量升高、IL-4含量降低，代表着母胎界面炎症平衡被破坏［21］。本研究发现寿胎丸、举元煎均可逆转Bcl-2遏制细胞凋亡病理状态，恢复正常炎症免疫状态。说明2种治法均参与炎症反应转换、细胞死亡等生物学过程影响SA大鼠子宫内膜蜕膜膜化、滋养层侵袭的调控力度进而安胎。4.2　健脾、补肾安胎法的差异机制补肾安胎法可能长于调控血管生成，而健脾安胎法长于调控细胞黏附寿胎丸与举元煎虽均能逆转SA部分病理学状态，但在Ru486诱导的SA总体疗效方面，寿胎丸总体疗效略优于健脾法，证实了“肾主生殖”理论的优势主导型。本结果与宁艳等［48］结果一致，通过健脾补肾法进行拆方、合方安胎实验研究，认为补肾药在防治流产过程中起主导作用。此外，本研究进一步阐释了健脾、补肾法的具体生物学异同及相互作用，明晰补肾、健脾安胎法逆转SA病理的作用差异性。“胞络”出自《黄帝内经·素问·奇病论》：“人有重身，九月而膺……胞之络脉绝也……胞络者系于肾”。胞络乃胞宫之络脉，为运气血之路，纵横交错，网络周身，无处不至。辛明蔚等［49］认为胞络为胞宫之脉络与微血管类似，见图4；方毅等［50］认为胞络络体细小迂曲，与肾气相通，“久病及肾”进而发展至“久病入络”造成胞络络气郁滞、瘀阻、绌急、瘀塞、损伤甚至络息成积以及络虚不荣，而肾虚则自然无以维系络脉，使胎无所固。本次研究发现寿胎丸调控血管生成（VEGF表达）优于举元煎，VEGF参与蜕膜血管生成级联反应过程，增加微血管的通透性并与血管内皮细胞受体（VEGF-R）特异性地结合，促进血管内皮细胞的增殖和分裂，进而导致新生血管的生成，影响子宫内膜的蜕膜转换，对妊娠的持续生长具有重要意义［27-29］。寿胎丸始载于张锡纯《医学衷中参西录》所创，以补肾固冲、养血安胎之功，为系固胞络安胎法代表方，实验结果揭示寿胎丸关键成分在系、固胞宫及血管调控可能起关键生物学作用，与“胞络”理论相契合。10.13422/j.cnki.syfjx.20221116.F004图4寿胎丸、举元煎逆转蜕膜SA病理环节的安胎差异机制及未来研究趋势Fig.4Differential mechanism of tocolysis and future research trends in reversal of pathological link of decidual SA by Shoutaiwan and Juyuanjian“胎茎”出自赵献可《邯郸遗稿》，《中华词典》对“茎”的定义为“由胚芽发展而成，下部连根，上部连叶-花-果实……茎能输送……营养到植物体各部分”，具有储藏、传输、光合、支撑、支持生长之用。而脾主“运化传导精微物质吸收转输至全身”功能，胚膜滋养层与内膜蜕膜联合部分（人体妊娠12~14周发展至胎盘），逐渐形成传输母体营养、合成、储存、防御、支持生长的功能［3］，与“茎” “脾”在功能描述上具有一定契合性。本次研究发现举元煎调控细胞黏附（E-Cad表达）相关作用优于寿胎丸：细胞黏附以不同的方式连接细胞并可以参与信号转导用于细胞检测和响应周围环境的变化，对妊娠信号传递具有重要意义，E-Cad表达的与细胞间相互聚集和黏附能力的减弱、滋养层细胞浸润、迁移有密切关系。SA模型大鼠上蜕膜细胞胞膜上E-Cad的表达降低，即造成了E-Cad依赖性的上皮之间的黏附疏松，也导致了EEC其相连接的细胞骨架发生结构等方面的变化，子宫内膜蜕膜化能力降低，减少了母胎界面交叉对话机会，最终导致SA的发生［18-20］。举元煎出自《景岳全书·卷五十一》，主益气升阳，治气虚下陷胎动不安甚滑胎者，脾在五行为土，生发万物，胚胎作为种子，植于胞宫，赖土之性生长发育。本次实验结果可阐释举元煎关键成分“胎茎系脾”的部分功能，本实验研究结果与网络分析差异并不一致，且健脾法是否能对母-胎联合部分具有直接调控作用本实验尚未证实。4.3　寿胎丸、举元煎安胎的Q-Marker差异识别2016年刘昌孝院士提出中药质量标志物（Q-Marker）科学概念，对中药质量发展、配伍意义、机制深入挖掘中具有重大意义［51］。本研究根据Q-Marker“五原则”即有效性、特有性、传递与溯源、可测性和处方配伍的基本思路方法、研究路径进行初步筛选［52］，基于LC-MS结果、“成分-效应”网络拓扑分析参数及已发表文献建立安胎关键成分识别方法，结果提示寿胎丸逆转SA病理的关键Q-Marker可能为寿胎丸中杜鹃花酸、甲亮氨酸、异鼠李素、乳糖等，举元煎逆转SA病理的关键Q-Marker可能为3，4-二甲氧基肉桂酸、3，4′，7-三羟基黄烷酮、白芥子酸等（参数详见增强出版附加材料）。本研究结果初步为安胎药物不同治法的质量控制建立及Q-Marker筛选提供参考。4.4　研究不足与展望本研究在两方面具有局限性：其一，未考虑方-证多组学联合网络。寿胎丸与举元煎所治疗的自然流产的证型不一致，不同的证型之间相关基因组、蛋白组、代谢物组网络既有差异也有交叉，在本次动物模型的差异研究不能完全反映药物作用于实际人体中相关证型情况，这也是目前网络药理学研究存在的主要问题，因此研究结果在阐释“胎茎系脾” “胞络系肾”理论和临床指导意义有一定局限性［53］；其二，网络预测结果中富集值与实际结果并不匹配，网络分析结果提示健脾中药在调节炎症反应方面更具优势，1990年代沈自尹等［54］通过实验证实健脾药是对免疫系统的直接作用，而补肾药是先作用于神经内分泌系统，进而间接影响免疫系统。但实验结果分析提示，2种治法在调节SA蜕膜组织炎症相关因子差异不大，补肾法似乎与血管调控过程更为密切，因此课题组猜测，除上述方-证网络因素以外，还需考虑复方在动物体内代谢作用以及细胞时空改变等生物学复杂问题，例如口服不同配伍的复方后，经过胃肠水解及菌群相关作用后的有效中药成分，其在门静脉血（吸收入血）、肝脏（主要代谢）和全身血（输送至身体各脏器）的原形成分暴露量和代谢产物的种类及数量区别至今尚未研究明晰［55］，因此未考虑证型、治法代谢成分活性程度的强弱改变是目前网络分析的最大瓶颈，同时统计学差异并不能完全代表生物学作用差异，仍然需要从多环节论证。此外，母胎界面病理状态PCD呈现多种形式，并非只有细胞凋亡。课题组从本研究中结合前沿报道发现蜕膜组织存在细胞焦亡［56］、自噬、程序性坏死、铁死亡［15］等PCD同样参与寿胎丸、举元煎的安胎调控模式，早期妊娠中胚胎发育与肿瘤发生时间、空间发展规律高度契合［57］，单一研究某一类PCD形态对中医药机制突破具有局限性，因此“泛凋亡（PANoptosis）”模式［58］可能是安胎机制研究的下一步重要切入点。同时在后续研究中，笔者猜测在同单位方剂干预作用下，健脾与补肾法合用是否优于单用补肾或者健脾呢。综上，本研究通过网络预测结合动物实验研究，发现健脾、补肾法治疗SA依靠不同关键成分影响不同靶标形成的复杂网络机制，其结果阐释部分“胎茎系脾” “胞络系肾”生物学基础，但同时本研究也缺乏病证结合、代谢方-证探索，因此针对以上问题与发现，课题组进一步研究思考与规划：①基于“君-臣-佐-使”对寿胎丸、举元煎生物学作用预测进行网络加权［59］；②寿胎丸、举元煎如何各自影响的SA蜕膜细胞空间结构［60］；③脾虚、肾虚型SA各自的证候基因-蛋白-代谢组差异网络如何，寿胎丸、举元煎对不同证型SA作用差异如何；④SA-细胞程序性死亡中死亡方式如何转换？寿胎丸、举元煎对其PCD网络调控模式是什么？本实验乃过渡性研究，为后续的健脾补肾协同效应、中医方证代谢组、时空组学研究提供研究方向和明确研究思路，同时亦为生殖系统新药研发提供重要切入点。