阿尔茨海默病（AD）主要发生于老年和老年前期，其起病隐匿，主要表现为进行性的认知功能损害和中枢神经系统退行性病变，是最常见的痴呆症，占所有痴呆病例的60%~80%［1］，其目前病因尚不明确，亦无有效的治愈方法［2］。AD通过损害海马组织结构功能降低患者的认知能力。随着社会人口老龄化的不断加深，AD患病率及死亡率逐年递增［3］，AD的防治成为了一个重要的研究领域。AD属于中医学痴呆症的范畴，其发病与元气亏虚密切相关，固本培元法是常见的治疗方法［4］，《景岳全书》中记载的大补元煎是固本培元法的代表方之一。研究证明大补元煎可以改善AD小鼠的学习记忆能力［5］。抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化，保护AD小鼠的神经元，缓解AD的病理进程［6］。同时研究发现，运动锻炼作为一种非侵入性的干预方法，可以抑制AD脑内β淀粉样蛋白（Aβ）的沉积，并有效减少Tau蛋白的过度磷酸化［7］。运动促进胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的活性，介导神经元中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路的激活，可能是改善AD脑学习记忆能力的机制之一［8］。但目前关于运动联合中药治疗AD的研究较少，针对运动联合大补元煎干预AD的相关研究更是未见报道。在此基础上，本课题组拟从PI3K/Akt信号通路及β-连环蛋白（β-catenin）蛋白表达的角度，建立AD大鼠模型，探讨大补元煎联合运动训练改善认知功能障碍的作用机制，为中医药研究AD提供新方案，为临床防治AD提供新思路。1 材料1.1　动物SPF级的3月龄雄性SD大鼠50只，体质量（220±20） g，由辽宁长生生物有限公司提供，合格证号SCXK（辽）2020-0001，大鼠饲养于恒温（室温22±3） ℃环境中，12 h循环光照，每5只一笼。实验过程中除麻醉术前禁水禁食12 h外，大鼠自由摄食饮水。动物饲养于湖北中医药大学老年医学研究所动物房。本实验获得湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准。1.2　药物及试剂大补元煎的组成［9］为人参6 g（批号190401）、杜仲6 g（批号180601）、山药6 g（批号210801）、山茱萸3 g（批号201201）、炙甘草3 g（批号210501）、熟地黄9 g（批号200901）、当归9 g（批号210501）、枸杞子9 g（批号210601），中药饮片购自湖北中医药大学国医堂，药材由湖北中医药大学兰洲教授鉴定均符合2020年版《中华人民共和国药典》项下标准。先用8倍于药材的纯水浸泡30 min，煮沸后加热40 min，滤出药液，再次加入6倍于药材的纯水并煮沸30 min，过滤药液后与第1次的滤液混匀。浓缩水煎液，制成含药量为0.45 g·mL-1的药液分装于离心管中，-20 ℃冰箱保存。Aβ25-35冻干粉、苏木素（美国Sigma公司，批号分别为A4559、H3136）；GSK-3β抗体、磷酸化（p）-GSK-3β抗体（美国CST公司，批号分别为Ab93926、AF2016）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体、Akt兔多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bsm-33036M、Bs-0115R）；p-Akt抗体（澳大利亚Affiity公司，批号AF0016）；B细胞淋巴癌-2（Bcl-2）鼠单抗、Bcl-2相关X蛋白（Bax）兔单克隆抗体（美国Invitrogen公司，批号分别为MA1-12246、MA5-32031）；胱天蛋白酶-3（Caspase-3）兔多克隆抗体、β-catenin抗体（武汉三鹰技术有限公司，批号分别为19677-1-AP、51067-2-AP）；辣根过氧化物酶（HPR）标记羊抗兔二抗及荧光（Cy3）标记羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G（武汉博士德生物工程有限公司，批号BA1054）。1.3　仪器ZH型蓝星脑立体定位仪、ZH型Morris水迷宫、ZH-PT型动物实验跑台（安徽正华公司）；JMF-320A型多级闪蒸器（河南金鼐科技发展有限公司）；RM 2016型轮转式切片机（德国Leica公司）；BX53型生物显微镜（日本Olympus公司）；DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYCZ-40型电转仪（北京六一仪器厂）。2 方法2.1　建立AD大鼠模型Aβ25-35充分溶于生理盐水后，于37 ℃恒温孵育7 d，获得质量浓度为2 mg∙L-1的寡聚体溶液。将AD组、运动组（EX组）、大补元煎组（TCM组）和运动+大补元煎组（EX+TCM组）的SD大鼠按3 mL∙kg-1体质量腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉。麻醉后的大鼠颅顶消毒备皮，纵向切开一约1.5 cm的切口，用H2O2溶液清理皮下组织，暴露颅顶的十字缝。将暴露十字缝的大鼠固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱向十字缝中点两侧旁开1 mm，下移1.5 mm位置各钻一孔。将微量注射器固定于脑立体定位仪上，从该孔进针2.5 mm，双侧各注射Aβ寡聚体溶液4 μL，每孔注射时间1 min，留针3 min［10］。假手术组（Sham组）注射等量生理盐水，其余操作相同。缝合创口后外敷红霉素软膏，肌注青霉素8万单位/鼠。术后休息期为1周，休息期间所有大鼠分笼饲养。2.2　分组给药造模成功后，将40只AD模型大鼠随机分为4组，分别为AD组、EX组、TCM组、EX+TCM组，每组10只。术后第8天开始给药，根据人与小鼠等效剂量折算方法确定给药量，即TCM组和EX+TCM组按照5.36 g∙kg-1的质量灌胃含药量0.92 g·L-1的大补元煎水煎液，Sham组、AD组和EX组按12 mL∙kg-1的剂量灌胃等体积的纯净水。每日灌胃1次，持续给药28 d。2.3　训练方案EX组及TCM+EX组大鼠在术后第4天开始适应性训练。正式训练时，EX组及TCM+EX组大鼠每天上午进行有氧运动，每周训练6 d，连续训练28 d，跑台速度为20 m∙min-1，坡度为0°。第1周大鼠的运动时间为15 min∙d-1，每周递增5 min直至第4周的运动时间为30 min∙d-1。有氧运动时利用大鼠趋暗的特性遮挡跑台前方的光线，制造黑暗环境引导大鼠向前跑。Sham组、AD组及TCM组不做运动干预。参照BEDFORD等［11］的运动负荷标准制订中等负荷的有氧训练计划，EX组与EX+TCM组大鼠运动时摄氧量约50 mL∙min-1，最大摄氧量约60 mL。2.4　指标检测2.4.1　Morris水迷宫检测AD大鼠空间记忆能力灌胃结束后，开始进行Morris水迷宫实验。直径1.6 m的水池中放水直至淹没平台2 cm的高度，连续进行5 d的定位巡航实验，对于逃避潜伏期超过90 s大鼠引导到平台停留60 s。定位航行结束后休息24 h，撤除平台，将大鼠放入水池中进行空间探索实验。2.4.2　苏木素-伊红（HE）染色观察海马病理形态变化行为测试结束后即刻称重，大鼠经腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛进行心脏灌注后，取出全脑固定于4%多聚甲醛溶液中。使用梯度乙醇对组织进行脱水处理、二甲苯固定后浸蜡、石蜡包埋，然后将脑组织连续冠状切片，切片入Mayer氏苏木素染液染色，自来水浸洗返蓝。再入1%水溶性伊红染液染色。风干后中性树胶封片，最后镜检。2.4.3　透射电镜观察海马超微结构变化海马组织切成1 mm3大小的组织块固定于2.5%戊二醇溶液中，4 ℃冰箱保存。0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸固定液固定3 h，再次使用磷酸漂洗液漂洗。使用乙醇与丙酮对组织进行脱水处理，纯丙酮和包埋液按比例配比后室温下包埋样品，在烘箱内固化，然后将脑组织切成50~60 nm的切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，最后透射电镜观察。2.4.4　蛋白免疫印迹法（Western bolt）检测海马PI3K/Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达将少量的剪碎的组织块置于2 mL微型离心管中，加入钢珠与去污剂裂解液放入匀浆机匀浆。匀浆完成后置于冰上充分裂解，4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min（离心半径14 cm，下同），取上清液。用将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔，每孔40 μL，加样电泳至溴酚蓝到凝胶底部，切下条带进行转膜。PVDF膜浸泡于一抗孵育液（1∶1 000）中4 ℃孵育过夜。洗去一抗后PVDF膜浸泡于1∶5万稀释的二抗37 ℃摇床孵育2 h。充分洗涤PVDF膜，滴加ECL显色液，置凝胶成像仪曝光各组条带值，采用Image J读取各条带灰度值。2.4.5　统计学方法采用统计软件SPSS 25.0分析和处理实验数据，实验数据以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对AD大鼠学习记忆的影响定位航行实验中，与Sham组比较，AD组大鼠的逃避潜伏期和游泳总路程显著延长（P0.01）；与AD组比较，EX组逃避潜伏期明显缩短、游泳总路程明显缩短（P0.05），TCM组与EX+TCM组的逃避潜伏期和游泳总路程均显著缩短（P0.01）。空间探索实验显示，与Sham组比较，AD组大鼠目标象限停留时间显著减少（P0.01）；与AD组比较，EX组和TCM组大鼠目标象限停留时间增加（P0.05），EX+TCM组目标象限停留时间显著增加（P0.01）；与EX组比较，EX+TCM组逃避潜伏期与游泳总路程显著下降（P0.01）、目标象限停留时间显著增加（P0.01）；与TCM组比较，EX+TCM组逃避潜伏期与游泳总路程缩短（P0.05）、目标象限停留时间上升（P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.T001表 1运动联合大补元煎对AD大鼠学习记忆的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of exercise combined with Dabuyuan Jian on learning memory in rats （x¯±s，n=10）组别剂量/g∙kg-1逃避潜伏期/s游泳总路程/mm目标象限停留时间/sSham组15.77±1.48287.64±32.7919.68±1.59AD组43.22±5.162）689.67±168.862）8.15±1.382）EX组30.03±3.123，6）558.22±63.493，6）13.84±1.113，6）TCM组5.3625.72±3.644，5）467.70±82.914，5）14.29±2.323，6）EX+TCM组5.3620.44±2.824）360.84±58.274）17.09±0.874）注：与Sham组比较1）P0.05，2）P0.01；与AD组比较3）P0.05，4）P0.01；与EX+TCM组比较5）P0.05，6）P0.01（表2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.F001图 1各组大鼠水迷宫运动轨迹Fig.1Trajectory of water maze for each group of rats注：A.Sham组；B.AD组；C.EX组；D.TCM组；E.EX+TCM组（图2-图4同）3.2　对AD大鼠海马形态的影响Sham组锥体细胞排列整齐，细胞结构完整，密度较大。与Sham组比较，AD组大鼠海马组织中锥体细胞排列紊乱，数量与密度明显减少，细胞固缩。与AD组比较，EX组、TCM组与EX+TCM组锥体细胞增加，细胞间隙较均匀，细胞固缩减少。与EX组与TCM组比较，EX+TCM组细胞密度增加明显，锥体细胞排列整齐，细胞形态饱满。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.F002图 2大补元煎联合运动对AD大鼠海马病理学形态的影响（HE，×400）Fig.2Effect of Dabuyuan Jian combined with exercise on pathological morphology of hippocampus in AD rats （HE，×400）3.3　对AD大鼠海马超微结构的影响Sham组大鼠海马神经元结构清晰完整，未有明显坏死结构；与Sham组比较，AD组大鼠神经元结构模糊，线粒体肿胀，脂褐素加深，髓鞘损坏；与AD组比较，EX组、TCM组与EX+TCM组的细胞结构损害减轻，线粒体结构相对完整，与EX组与TCM组比较，EX+TCM组突触结构边缘清晰，髓鞘完整，坏死结构均有改善。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.F003图 3大补元煎联合运动对AD大鼠海马神经元超微结构的影响 （透射电镜，×20 000）Fig.3Effect of Dabuyuan Jian combined with exercise on ultrastructure of hippocampal neurons in AD rats （TEM，×20 000）3.4　对AD大鼠PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表达的影响与Sham组比较，AD组大鼠海马Bcl-2、p-Akt与p-GSK-3β的表达水平显著下降（P0.01），β-catenin表达明显下降（P0.05），cleaved Caspase-3的水平明显升高（P0.05）。与AD组比较，EX组、TCM组与EX+TCM组的Bcl-2、p-Akt与p-GSK-3β的表达水平均上调（P0.05，P0.01），cleaved Caspase-3的表达水平明显下降（P0.05，P0.01）。与EX组比较，EX+TCM组p-Akt与p-GSK-3β的表达水平显著上调（P0.01），β-catenin、Bcl-2与cleaved Caspase-3蛋白表达明显增加（P0.05）。与TCM组比较，EX+TCM组p-GSK-3β、β-catenin、Bcl-2与cleaved Caspase-3的蛋白表达水平均明显增加（P0.05）。但EX组与TCM组β-catenin蛋白表达与AD组比较差异无统计学意义。见表2、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.T002表 2大补元煎联合运动对AD大鼠海马PI3K/Akt/GSK-3β水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of Dabuyuan Jian combined with exercise on PI3K/Akt/GSK-3β levels in hippocampus of AD rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g∙kg-1p-Akt/Aktp-GSK-3β/GSK-3ββ-cateninBcl-2/Baxcleaved Caspase-3Sham组1.12±0.091.23±0.051.31±0.261.20±0.041.23±0.11AD组0.88±0.032）0.88±0.032）0.87±0.031）0.60±0.022）1.96±0.041）EX组1.10±0.053，6）1.10±0.053，6）0.97±0.015）0.99±0.034，5）1.62±0.113，5）TCM组5.361.20±0.044）1.12±0.094，5）1.02±0.034）1.01±0.044，5）1.58±0.054，5）EX+TCM组5.361.23±0.054）1.20±0.044）1.12±0.053）1.09±0.034）1.50±0.034）10.13422/j.cnki.syfjx.20221501.F004图 4各组大鼠PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表达电泳Fig.4Electrophoresis of protein expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway in each group rats4 讨论神经退行性病变以进行性的认知功能障碍，神经元与髄鞘的丢失为主［12］。海马作为中枢神经系统中参与学习与记忆储存的部分，其组织的病理变化在AD中尤为突出。人β淀粉样蛋白寡聚体（Aβo）在中枢神经系统的积聚已被大量实验证明会引起学习和记忆的障碍，海马体的改变是导致AD认知功能障碍的重要机制［13］。本实验结果表明，AD组大鼠在Morris水迷宫的定位航行实验和空间探索能力均显著下降，提示学习记忆能力受损。有氧运动干预和大补元煎给药均有显著改善，其中EX+TCM组的改善效果最佳，表明氧运动结合大补元煎相较于单独运动干预或中药干预在改善AD大鼠的学习记忆方面更有优势。PI3K/Akt信号通路主要受IGF-1等上游因子和外界刺激的调控，广泛参与真核细胞生长代谢的调节。Akt蛋白磷酸化后被激活，可介导其下游因子GSK-3β，抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，参与调节细胞的增殖、分化、凋亡和自噬［14］。GSK-3β在神经退行性疾病等研究中，主要作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡［15-16］。在PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中，受Akt活化水平的调控，同时影响下游神经干细胞相关蛋白β-catenin的表达水平，该蛋白在控制神经元的增殖分化中发挥关键作用［17］。研究证实，AD脑中神经细胞增殖分化的功能受到抑制，导致记忆功能障碍，其机制与β-catenin活性下降相关。在中枢神经系统中，Akt的活化可以促进GSK-3β的磷酸化［18］。而静息状态下GSK-3β会下调β-catenin的水平并抑制神经元的增殖、分化和迁移［19］。同时，Akt下游蛋白Bcl-2与其拮抗蛋白Bax的表达水平可影响细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达。本研究发现，AD组大鼠海马p-Akt与p-GSK-3β水平显著降低，β-catenin表达水平显著下降，Bcl-2表达下降，Caspase-3水平显著升高；而经过有氧运动干预和大补元煎给药的EX组、TCM组和EX+TCM组大鼠海马p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin表达水平显著上升，Bcl-2表达增加，Caspase-3表达显著下降，与前人研究结果基本一致［5，10］。进一步通过病理形态学结果发现，AD组神经元排列疏松紊乱，出现神经元数量减少，细胞核固缩现象，而EX组、TCM组和EX+TCM组的神经元细胞排列较规则，数量增加，细胞核饱满。观察海马神经元的超微结构发现，AD组神经元结构模糊，细胞器肿胀溶解，脂褐素增加，而EX组、TCM组和EX+TCM组的细胞结构完整性均有明显改善。这些研究也提示有氧运动结合大补元煎可能是通过调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路上Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin等关键蛋白，抑制神经元凋亡，发挥保护海马神经元的作用，进而改善Aβ积聚引起的学习记忆损伤。研究发现，长期的有氧运动可以提高神经系统的调节能力，改善突触可塑性，加快神经冲动传递速度，增强神经元的存活，促进神经系统执行和认知功能等。KANG等［20］利用NSE/htau23模型小鼠研究发现，经过12周的跑台训练后，大脑皮质中PI3K和Akt的磷酸化水平上升。BAYOD等［21］研究发现，长期的跑台训练能够提高大鼠海马组织GSK-3β的磷酸化水平从而抑制GSK-3β的活性，并且降低了Tau蛋白Ser396位点的磷酸化水平。这是将运动诱发的周围改变与运动对神经发生和认知益处的潜在中心机制联系起来的重要一步。大脑海马组织中的这些良性改变对于抑制大脑认知功能衰退，提高大脑学习和记忆功能，改善AD等神经系统退行性疾病有积极作用。这些发现与笔者发现的有氧运动对大脑海马组织PI3K/Akt/GSK-3β与Wnt/β-catenin信号通路的影响相同。中医药制剂为保护神经元功能、促进神经再生提供丰富的多因子环境，在治疗退行性神经系统疾病方面具有较大的潜力。研究发现AD的发病与元气亏虚密切相关，AD患者出现多虚多损、元神失养，固本培元为中医药治疗AD的重要方法［22］。本研究中所采用的大补元煎是固本培元代表方之一。方中以人参为君大补元气，气生则血长；佐以炙甘草、山药补脾之气；当归活血养血；熟地黄、枸杞子、山茱萸、杜仲滋肝肾以益精血。张景岳在《景岳全书·新方八阵》中称其可“回天赞化，救本培元”，诸药合用，益精养血，大补元气。现代药理研究表明，大补元煎能通过抑制Tau蛋白过度磷酸化、降低自由基水平和抗神经元凋亡等方面在一定程度上保护和改善AD动物的学习记忆能力［23-24］。但中药组方成分复杂，下一步课题组将针对大补元煎组方进行组分分析以进一步明确其有效成分，并结合运动干预等非药物疗法拓宽AD的防治思路。综上所述，运动训练结合大补元煎可以改善AD大鼠的学习记忆功能，缓解海马神经元损伤，其机制可能与调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路和下游蛋白β-catenin的表达有关，且二者联合使用优于运动干预或药物干预单独使用。