高尿酸血症（HUA）是指体内嘌呤代谢紊乱，血尿酸水平持续升高（男性420 μmol·L-1，女性360 μmol·L-1）的一种常见代谢性疾病。血尿酸浓度增高，不仅可形成尿酸盐晶体诱发痛风，晶体沉积还可导致尿石症、尿酸性肾病［1］。高尿酸血症亦是高血压、脑卒中、糖尿病等疾病的独立致病因素［2-4］。目前我国高尿酸血症患病率达8.4%~13.3%，呈高流行、年轻化趋势［5］，成为危害人类健康的第二大代谢性疾病。尿酸生成和排泄的动态平衡是机体维持尿酸稳态的关键因素。90%以上的HUA源于尿酸排泄不足［6］。体内多余的尿酸2/3经肾脏排泄，1/3经肠道排泄。基因编码的尿酸转运蛋白表达异常是尿酸排泄障碍的重要原因［7］，如肾脏近端小管上皮细胞中的尿酸阴离子转运体1（URAT1/SLC22A12）、葡萄糖转运体9（GLUT9/SLC2A9）等尿酸转运蛋白主要调控肾脏对尿酸的重吸收和分泌过程［8］。肠道三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G（ABCG2）是调控肠道尿酸排泄的重要转运蛋白［9］。ABCG2基因突变，蛋白功能异常，与高尿酸血症密切相关［10-11］。肠道尿酸排泄不足，使肾脏代偿性排泄增加，导致“肾脏超载型”HUA［12］，肾脏更易受损［13］。促进肾脏尿酸尿酸排泄是目前治疗高尿酸血症的主要手段。苯溴马隆、丙磺舒等药物通过抑制肾脏URAT1和GLUT9表达，减少尿酸重吸收，达到促进尿酸排泄的目的。然而，肾脏尿酸排泄增加，肾小管尿酸浓度过高导致的尿酸盐结晶沉积可损伤肾脏。尿酸性肾病也限制了该类药物的应用。促进肠道尿酸排泄成为治疗高尿酸血症的新途径［14］。以肠道ABCG2为靶点，通过上调该基因表达，促进肠道尿酸排泄不仅可降低血尿酸水平，更可以减轻肾脏尿酸排泄负荷达到保护肾功能的目的。四妙丸源自清代《成方便读》，为现代中医治疗高尿酸血症及痛风的常用方剂，由苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁组成，具有清热祛湿、逐瘀通经之功。现代药理学研究发现，四妙丸既可通过抑制肾脏URAT1、GLUT9表达，减少尿酸重吸收［15］，也可上调肾脏ABCG2表达，促进尿酸排泄［16］。四妙丸是否能上调肠道ABCG2表达促进肠道尿酸排泄尚无相关研究。本研究旨在观察四妙丸对高尿酸血症大鼠血尿酸、肠道尿酸、小肠ABCG2蛋白和mRNA表达的影响，进一步探讨四妙丸降低尿酸的机制。1 材料1.1　实验动物SPF级5~6周龄雄性SD大鼠48只，体质量140~160 g，购买于斯莱克实验动物公司，饲养于上海中医药大学动物实验中心［许可证号SYXK（沪）2020-0009］。大鼠分笼饲养，自由进食及饮水。室温维持26 ℃，湿度50%。本研究经上海中医药大学动物福利与伦理委员会批准（伦理编号PZSHUTCM191122001）。1.2　药品与试剂中药方剂由四妙丸由苍术、黄柏、薏苡仁、牛膝组成。购买于上海同济堂药业，批号分别为200201、191201、191101、191202。根据2020年版《中华人民共和国药典》四妙丸制备方法，由上海中医药大学附属光华医院购进，称取苍术（125 g）、黄柏（250 g）、薏苡仁（250 g）、牛膝（125 g）。将全部中药饮片混合碾碎，加水煎煮，过滤收集药液；将药渣再次加水煎煮，收集药液。混合2次药液，减压浓缩蒸发、真空干燥，得浸膏粉261.62 g，提取率为34.88%（W/W），冷冻备用。苯溴马隆片（宜昌东阳光长江药业，批号H20040348），氧嗪酸钾、次黄嘌呤（美国Sigma公司，批号分别为H9733、156124），异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号20082602），TRIzol试剂（美国Invitrogen公司，批号15596018），ABCG2兔单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号42078S），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（美国Proteintech公司，批号60004-1-Ig），DyLight 800山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G荧光二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠/兔二抗、柱式法组织总蛋白提取试剂盒、抗原修复液（20×） 乙二胺四乙酸（EDTA） pH 9.0、免疫组化（IHC）抗体稀释剂（美国Immunoway公司，批号分别为RS23910、RS0011、RS0024、YS0004、YS0001、K1622），强效实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）预混液（美国Thermo Scientific公司，批号4368577），显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-8000），NC膜（美国Millipore公司，批号HATF00010）。1.3　仪器ADVIA2400型全自动生化分析仪（德国西门子公司），TDL-5000CR型冷冻离心机（上海安亭科学仪器），PTHW5000ML型恒温电热套（郑州科泰实验设备），F-114型旋转蒸发仪套（瑞士Buchi公司）；DZF-6210型真空干燥箱（上海一恒科学仪器），ViiA 7型Real-time PCR仪（美国ABI公司），Odyssey型红外荧光成像系统（美国Licor公司），DM2500型显微镜荧光拍照系统（德国Lecia公司）；SpectraMax M5E型酶标仪（美国Molecular Devices公司），trans-blot SD Cell型半干转仪、Mini Trans-Blo型电泳转膜槽、Mini-Protean型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），HY-BM1150型包埋机（金华惠友仪器设备有限公司）。2 方法2.1　动物分组、造模方与给药48只雄性SD大鼠适应性喂养后随机分为正常组、模型组、苯溴马隆组（4.7 mg·kg-1）、四妙丸高、中、低剂量组（2 260.6、1 130.3、565.2 mg·kg-1），每组8只。除正常组外，以氧嗪酸钾（100 mg·kg-1，腹腔注射）联合次黄嘌呤（500 mg·kg-1，灌胃）造模，每日1次，连续21 d，复制HUA模型。第8天予相应药物灌胃干预，每天1次，持续14 d，正常组和模型组予等容积溶媒。2.2　样本采集和检测指标实验第7天给药后2 h，以眼眶取血采集血样1.5 mL，检测血尿酸以判断模型是否成功。实验第21天给药后2 h再次以眼眶取血采集血样1.5 mL，检测血尿酸、血肌酐、血尿素氮。所有大鼠处死前禁食24 h。第21天以异氟烷呼吸麻醉安乐死大鼠，剖开腹腔，于小肠中段切取长约20 cm的肠段。肠液样本收集参考文献方法［17］。切取前先用组织钳夹住肠段两端以防肠液流失，肠段取出后以生理盐水10 mL冲洗肠道内壁，收集冲洗液即肠液样本，检测肠道尿酸水平。最后将所取小肠段周围肠系膜及脂肪组织清理，小肠组织分别标本置于液氮和4%多聚甲醛保存待后续检测。2.3　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠小肠组织ABCG2蛋白表达蛋白提取按组织蛋白提取试剂盒说明书进行。采用BCA法测定蛋白浓度。配制10%分离胶，5%浓缩胶，浓缩胶70 V恒压，至溴芬蓝进入分离胶后改110 V恒压，电泳至溴芬蓝刚出凝胶下端。200 mA恒流转膜90 min。用含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭2 h，TBST洗膜5 min，3次。孵育一抗ABCG2（用含5%脱脂牛奶TBST按1∶1 000稀释）和内参GAPDH（用含5%脱脂牛奶的TBST按1∶5 000稀释），4 ℃孵育过夜，第2天室温孵育20 min，TBST洗膜5 min，3次。加入5%脱脂牛奶TBST稀释的二抗山羊抗小鼠IgG（1∶1万），37 ℃孵育2 h，TBST洗膜5 min，3次。ECL显影反应2 min，Odyssey双色激光成像系统扫描成像。Image J软件测定条带灰度值，以GAPDH为内参对照，计算ABCG2/GAPDH值。2.4　Real-time PCR检测大鼠小肠组织ABCG2 mRNA表达肠组织总RNA提取采用TRIzol法。去除基因组DNA，加入gDNA Eraser Buffer（5×）2.0 µL，gDNA Erase 1.0 µL，RNA 150 ng，无核酸酶的dH2O补至10 µL，混匀，42 ℃反应2 min。根据反转录剂盒说明书进行反转录，加入上一步的反应液10 µL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 µL，RT Primer Mix 1.0 µL，PrimeScript Buffer 2（5×）4.0 µL，RNase Free dH2O 4.0 µL，混匀，37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。引物的设计与合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。ABCG2上游引物5'-T CATCAGCTCAGATGGATTG-3'，下游引物5'-GGC AAGAACCTCATAGGTAG-3'，片段长度333 bp；GAPDH上游引物5'-CCCATTCTTCCACCTTTGAT-3'，下游引物5'-CAACTGAGGGCCTCTCTCTT-3'，片段长度200 bp。Real-time PCR反应体系为20 µL，包含SYBR Green Premix （2×） 10 µL，上游引物（10 μmol·L-1）0.4 µL，下游引物（10 μmol·L-1）0.4 µL，cDNA模板1.0 µL，无核酸酶dH2O补至20 µL。扩增条件为94 ℃预变性5 min，1循环；95 ℃变性3 s，60 ℃退火/延伸30 s，40循环。Real-time PCR结果用2-ΔΔCt计算，以相对值表示。2.5　免疫组化法检测大鼠小肠组织ABCG2蛋白表达和定位将石蜡包埋的小肠组织切成4 μm厚组织切片。切片在60 ℃下烘烤1 h，二甲苯脱蜡、水化。PBS洗涤5 min×3次，用TRIS-EDTA of pH 9.0以高压法法修复抗原3 min，自然冷却20 min。PBS洗涤5 min×3次，在暗匣中用3%H2O2-甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶活性10 min。PBS洗涤5 min×3次，加入5%山羊血清封闭室温30 min。滴加一抗ABCG2（1∶100），室温孵育60 min。PBS洗涤5 min×3次，滴加二抗山羊抗兔/小鼠多克隆抗体HRP（1∶1 000），室温湿孵30 min。PBS洗涤5 min×3次，DAB显色，室温湿盒显色3 min后终止显色。苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Lecia显微镜荧光拍照系统下采集图像，各组织切片随机选取5个互不重叠的视野拍摄。Image Pro Plus 6.0分析免疫组化染色结果分析，测定阳性颗粒积分吸光度IA和阳性表达面积（Area）。2.6　统计学方法采用Prism 8.2.1软件处理数据，计量资料用x¯±s表示，方差齐者采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较，组间两两比较采用Tukey检验，方差不齐者采用Brown-Forsythe and Welch ANOVA比较，组间两两比较采用Dunnet's T3检验，P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对HUA大鼠血尿酸、肠道尿酸、肾功能水平的影响造模7 d，与正常组比较，模型组血尿酸显著升高（P0.01）；与模型组比较，苯溴马隆组、四妙丸各剂量组血尿酸水平差异无统计学意义；干预后21 d，与正常组比较，模型组血尿酸、血肌酐、血尿素氮显著升高，差异有显著统计学意义（P0.01）；与模型组比较，四妙丸各剂量组和苯溴马隆组大鼠血尿酸水平均显著降低（P0.01），四妙丸中、低剂量组肠道尿酸明显升高（P0.05，P0.01），苯溴马隆组血肌酐显著升高（P0.01），四妙丸低剂量组血尿素氮明显降低，差异有明显统计学意义（P0.05）；四妙丸低剂量组与苯溴马隆组血尿酸水平比较差异无统计学意义。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.T001表 1四妙丸对HUA大鼠血尿酸、肠道尿酸、肾功能水平影响 （x¯±s，n=8）Table 1Effect of Simiaowan （SMW） on serum uric acid， intestinal uric acid and renal function in HUA rats （x¯±s，n=8）组别剂量/mg·kg-1血尿酸/mol·L-1肠道尿酸/g血肌酐/mol·L-1血尿素氮/mmol·L-17 d21 d正常组131.0±32.083.8±24.074.5±12.126.5±1.86.1±0.4模型组709.2±227.72）546.6±196.32）67.9±11.631.9±3.32）14.4±5.92）苯溴马隆组4.7794.2±92.82）261.1±112.24）68.4±4.438.2±2.34）11.7±2.0四妙丸高剂量组2 260.6892.5±196.32）290.6±109.54）72.5±12.430.6±3.510.7±2.1四妙丸中剂量组1 130.3830.4±180.92）290.5±123.84）87.9±13.03）32.3±3.010.5±2.0四妙丸低剂量组565.2887.9±112.32）210.9±133.64）97.8±16.14）29.4±3.49.3±1.03）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2-表4同）3.2　对HUA大鼠小肠组织ABCG2蛋白的表达的影响与正常组比较，模型组ABCG2蛋白表达显著下降（P0.05）。与模型组比较，四妙丸中、低剂量组能够提高HUA大鼠小肠组织ABCG2蛋白表达水平（P0.05，P0.01），四妙丸高剂量组及苯溴马隆组呈升高趋势，但差异无统计学意义。见图1、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.F001图 1大鼠小肠ABCG2蛋白表达电泳Fig.1Electrophoresis of ABCG2 protein in intestine of rats注：A.正常组；B.模型组；C.苯溴马隆组；D.四妙丸高剂量组；E.四妙丸中剂量组；F.四妙丸低剂量组（图2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.T002表 2四妙丸对HUA大鼠小肠ABCG2蛋白表达水平影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of SMW on ABCG2 protein expression levels of intestine in HUA rats （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1ABCG2/GAPDH正常组0.650±0.074模型组0.255±0.0481）苯溴马隆组4.70.534±0.144四妙丸高剂量组2 260.60.538±0.193四妙丸中剂量组1 130.30.607±0.1243）四妙丸低剂量组565.20.775±0.0604）3.3　对HUA大鼠小肠组织ABCG2蛋白的表达组织病理学影响定位免疫组化染色显示，阴性对照切片无免疫反应，阳性对照切片可见肠组织内金棕色阳性染色颗粒。ABCG2主要分布于肠绒毛，部分可见绒毛顶端强阳染，肠腺周围少量分布，在肠绒毛中主要位于绒毛的肠上皮细胞膜和细胞核周围。半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组ABCG2蛋白表达的Area和IA呈下降趋势，但差异无统计学意义。与模型组比较，四妙丸高、中、低剂量组ABCG2蛋白的Area明显增加（P0.05，P0.01），IA明显增加（P0.05，P0.01）。见图2、表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.F002图 2四妙丸对HUA大鼠小肠ABCG2蛋白表达的影响（免疫组化，×100）Fig.2Effect of SMW on ABCG2 protein expression levels of intestine in HUA rats （IHC，×100）10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.T003表3四妙丸对HUA大鼠小肠ABCG2蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of SMW on ABCG2 protein expression levels of intestine in HUA rats （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1Area（×105）IA（×104）正常组1.59±0.385.65±2.05模型组0.74±0.171.89±0.86苯溴马隆组4.71.00±0.162.73±0.45四妙丸高剂量组2 260.61.84±0.371）7.84±1.841）四妙丸中剂量组1 130.32.30±0.422）8.34±2.072）四妙丸低剂量组565.22.17±0.542）7.38±2.651）3.4　对HUA大鼠小肠组织ABCG2 mRNA表达的影响与正常组比较，模型组、苯溴马隆组ABCG2 mRNA表达呈下降趋势，但差异无统计学意义。与模型组比较，四妙丸中、低剂量组ABCG2 mRNA表达明显升高（P0.05）。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221601.T004表4四妙丸对HUA大鼠小肠ABCG2 mRNA表达水平影响 （x¯±s，n=8）Table 4Effect of SMW on level of ABCG2 mRNA expression levels of intestine in HUA rats （x¯±s，n=8）组别剂量/mg·kg-1ABCG2正常组0.62±0.32模型组0.41±0.15苯溴马隆组4.70.45±0.19四妙丸高剂量组2 260.60.82±0.29四妙丸中剂量组1 130.31.01±0.441）四妙丸低剂量组565.21.05±0.331）4 讨论四妙丸可降低HUA大鼠血尿酸，改善肾功能。氧嗪酸钾联合次黄嘌呤复制HUA大鼠模型是常用的造模方法，具有成功率高、模型稳定的优点。造模后，除正常组大鼠外，其余各组大鼠血尿酸显著升高。干预后，苯溴马隆组和四妙丸各剂量组血尿酸显著下降，干预有效，其中苯溴马隆组、四妙丸低剂量组与正常组比较，差异无统计学意义，提示低剂量四妙丸与苯溴马隆效果相当，可使血尿酸水平接近正常。苯溴马隆组血肌酐较模型组显著升高，肾功能进一步受损，可能与其促进肾脏尿酸排泄，肾脏尿酸负荷增加有关。四妙丸低剂量组血尿素氮显著低于模型组，提示四妙丸可能通过调控其他尿酸排泄途径以减少肾脏尿酸排泄负荷，达到保护肾功能的作用。魏瑶等［18］采用氧嗪酸钾联合腺嘌呤灌胃建立高尿酸血症小鼠模型，给与加味四妙丸灌胃后，高尿酸血症大鼠尿酸、肌酐、尿素氮水平显著降低，并且组织切片显示其改善了高尿酸血症小鼠的肾脏及肠道组织病理变化，提示加味四妙丸可能通过改善肾脏与小肠功能促进尿酸的排泄。本实验证实，四妙丸低剂量组肠道尿酸排泄明显高于模型组和正常组，说明低剂量四妙丸能促进肠道尿酸排泄。四妙丸不仅能促进肾脏尿酸排泄，还可促进肠道尿酸排泄，体现了中医药多靶点多途径的优势。四妙丸上调肠道ABCG2表达促进肠道尿酸排泄。ABCG2是一种腺苷三磷酸结合“半转运体”蛋白，广泛分布于全身各组织，尤以肾和小肠表达较高［19-20］。作为一种保护性通道蛋白，ABCG2可将尿酸排出体外。一项5/6肾脏切除术的大鼠实验研究发现，大鼠切除5/6肾脏后，尿尿酸、尿酸清除率等指标明显下降，但血尿酸水平并未升高，同时肠道ABCG2呈过表达状态［21］。TAKADA等［22］在ABCG2 mRNA敲除小鼠的肠道中发现，尿酸转运蛋白数量明显减少，肠道尿酸水平下降，血尿酸显著升高。表明肠道ABCG2水平在尿酸排泄及代偿方面具有重要作用。张志明等［23］发现高尿酸血症小鼠模型的回肠组织中ABCG2的水平显著降低，研究结果表明四妙散降低尿酸水平可能与上调回肠组织ABCG2的表达和抑制GLUT9的表达相关。在本实验中同样发现高尿酸血症小鼠的ABCG2蛋白表达呈下降趋势。Western blot检测显示，四妙丸中、低剂量组大鼠ABCG2蛋白表达较模型组显著上调。Real-time PCR检测ABCG2 mRNA表达结果与Western blot趋势一致。免疫组化蛋白半定量分析与Western blot、Real-time PCR检测结果在趋势上大致类似。上述结果提示，中、低剂量四妙丸可以上调小肠ABCG2表达水平，促进肠道尿酸排泄。研究发现，ABCG2是促炎细胞因子的靶点，当促炎细胞因子刺激时，ABCG2的表达和功能降低［24］。VON WEDEL-PARLOW等［25］发现，白细胞介素-1β（IL-1β）能在6 h内迅速降低猪脑毛细血管内皮细胞中ABCG2 mRNA表达水平，并导致ABCG2蛋白表达持续下降。LU等［26］发现IL-1β不仅能直接降低ABCG2的功能活性，还可以通过核转录因子-κB（NF-κB）活化部分降低ABCG2蛋白和mRNA表达水平。网络药理学发现，四妙丸可作用于IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）等靶点，调控NF-κB、IL-17等信号通路，从而发挥抗炎、抗氧化应激等作用［27］。因此推测四妙丸可能通过其抗炎作用，抑制IL-1β、NF-κB信号通路，从而上调人肠道细胞系ABCG2表达达到促进肠道尿酸排泄的作用。本研究证明了四妙丸可以调控肠道尿酸转运蛋白ABCG2水平来促进肠道尿酸的排泄，同时可保护肾功能，进一步丰富了四妙丸降尿酸药的作用途径，也为研究以肠道作为降尿酸靶器官的药物研究提供了新思路。然而ABCG2表达受多种转录因子的调控，并且其转运活性也受多种因素影响。四妙丸调控肠道ABCG2表达的具体机制及对ABCG2的功能影响需要进一步研究，并且肠道尿酸排泄也会受到肠道菌群的影响，下一步可能会选择ABCG2基因敲除小鼠，基于信号通路、细胞水平、肠道菌群等方面进行研究。