五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果实［1］，主产于辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古等地，习称“北五味子”［2］。其始载于《神农本草经》，被列为上品，使用历史悠久，以个大饱满、果肉丰厚、有油性及光泽者为佳，主要化学成分有木脂素类、挥发油、有机酸类、多糖类、萜类、黄酮类等［3］。药理研究表明其具有保肝、抗癌、镇咳和抗炎等功效，还可较好地保护消化系统、中枢神经系统、心血管系统、内分泌系统、免疫系统［4-5］。五味子鲜果属于浆果，果皮薄，为便于储运，采摘后多需要干制。黑龙江省的五味子采收期较晚，传统干燥方法周期长，因鲜果采摘后组织仍进行着活跃的新陈代谢，即采后生理，所以干燥周期内采后生理活动会继续消耗果实中的内含物质。本课题组前期已对使用微波、烫漂、蒸制等方法“杀青”后再干燥的五味子样品中7种木脂素类成分（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素）的含量进行了高效液相色谱法（HPLC）测定，结果发现“杀青”后五味子中这7种木脂素类成分含量的总和要高于直接晒干和50 ℃烘干的样品［6］，说明“杀青”可使五味子有效成分含量升高［7］，但考虑到五味子化学成分复杂，仅测定木脂素类成分的含量评价其品质过于单一，还应联合多组学技术对其进行整体分析。植物代谢组学是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段的技术，适合于植物尤其是传统中药等复杂体系分析［8-9］。而以氢为靶向原子核的核磁共振氢谱（1H-NMR）是一种利用不同原子核吸收辐射产生不同共振频率并将这些共振频率转化为分子化学和结构信息的光谱技术［10］。1H-NMR可以提供有机化合物中氢原子的所处位置、化学环境、相对数目、分子构型等多方面信息，是解析化合物结构的有力工具，并且该方法对样品无损伤，检测无偏向性［11-12］。目前，植物1H-NMR代谢组学技术已被广泛用于中药材的质量分析、品质评价［13］。因此，本研究拟基于1H-NMR代谢组学技术建立5种加工方法处理后五味子的1H-NMR谱图，并运用多元统计方法对各样品进行分析，从整体上表征不同样品间的代谢轮廓差异，以阐释在五味子药材产地初加工过程中加入“杀青”环节对其代谢物轮廓的影响。1 材料AVANCE Ⅲ 600 MHz型NMR波谱仪（德国Bruker公司），5415R、5424R型离心机（德国Eppendorf公司），XP205型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，BenchTop Pro 3L ES-55型冻干机（美国SP科学公司），M1-L202B型微波炉（广州美的厨房电器制造有限公司），GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），SFY-001型卤素水分测定仪（上海花潮实业有限公司）。4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸（DSS，浓度5.323 mmol·L-1，加拿大Anachro Technologies公司），水为超纯水，试剂均为分析纯。五味子鲜果于2018年9月20号采摘自黑龙江省通河县清河林业局红太阳五味子种植基地，经黑龙江中医药大学药学院吴修红教授鉴定为木兰科植物五味子S. chinensis的成熟果实。将采收的五味子鲜果分成15份（编号S1~S15），每份约200 g，每3份样品为1组，每组的鲜果采用同一种加工方式。分别采用50 ℃烘干（以下简称“烘干”）、晒干、微波“杀青”后50 ℃烘干（以下简称“微波”）、烫漂“杀青”后50 ℃烘干（以下简称“烫漂”）、蒸制“杀青”后50 ℃烘干（以下简称“蒸制”）5种方法对五味子鲜果进行初加工，具体条件见表1，干燥后备用。加工过程中间隔一定时间称取样品2.0 g，用卤素水分测定仪测定样品含水量，各样品均选择在含水量约10%时停止处理，符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）“五味子”项下水分不得过16%的要求。10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.T001表1五味子样品的不同干燥处理方式Table 1Different drying methods of Schisandrae Chinensis Fructus samples样品编号制备工艺干燥时间/d水分/%S1~S3烘干：取净五味子鲜果适量，置于50 ℃鼓风干燥箱中烘干2.710.24S4~S6晒干：取净五味子鲜果适量，常温下晒干7.09.96S7~S9微波：取净五味子鲜果适量，置于350 W微波炉中“杀青”3 min，取出后置于鼓风干燥箱中50 ℃烘干3.09.23S10~S12烫漂：取净五味子鲜果适量，置于沸水中烫漂2 min，捞出后置于50 ℃鼓风干燥箱中烘干3.010.25S13~S15蒸制：取净五味子鲜果适量，隔水蒸30 min（上汽后开始计时），取出后置于50 ℃鼓风干燥箱中烘干4.010.322 方法和结果2.1　样品制备称取各五味子样品粉末50 mg，置于2 mL具塞离心管中，加入50%甲醇1 mL，涡旋混匀1 min，4 ℃离心（13 000 r min-1，5 min，离心半径8.4 cm，下同），取上清液700 μL氮气吹干，于-80 ℃冰箱预冷冻后，使用冻干机冻干样品。测定前用水450 μL复溶，加入ACDSS 50 μL，涡旋30 s，转移至2 mL离心管中，离心，取上清液480 μL于5 mm的NMR管中，编号，待测。每种样品平行制备3份。2.2　1H-NMR检测样品在298 K（1 K≈-272.15 ℃）于NMR仪上测定，该仪器配备了反向冷冻探针，采用noesyppr1d脉冲序列，测定频率600.13 MHz，对于每个样品，使用以下参数在15 min内记录128次扫描，谱宽8 403.361 Hz，傅里叶变换0.188 Hz，脉冲间隔1 s，延迟时间5.0 s，光谱参考DSS，因此DSS的峰高（设定为0 ppm，1 ppm=1×10-6）对于所有光谱都是等效的。NMR图谱采用Chenomx NMR Suite（version 8.6）进行处理。每张NMR图谱自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，以DSS峰作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反卷积操作，调整谱图峰形，见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.F001图1五味子提取物的1H-NMRFig. 11H-NMR of Schisandrae Chinensis Fructus extract2.3　代谢物的指认将1H-NMR自由感应衰减（FID）信号导入Chenomx NMR Suite软件中，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线。选择以DSS峰作为样本全部谱图化学位移的标准。分析0~10 ppm谱峰，以0.04 ppm单位的化学位移为分段积分单元。根据1H-NMR图谱中信号的相关信息（包括化学位移、峰形、半高峰宽和耦合分裂），通过与Chenomx提供的内置数据库进行详细比较，从而指认代谢物，同时参考DSS的浓度和峰面积，确定代谢物的绝对浓度。最终指认了27个代谢产物，见表2，结果发现所得代谢产物主要为氨基酸、生物碱、糖类及有机酸，这些代谢产物主要为初级代谢产物，参与果实采后生理的能量代谢活动［14］。10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.T002表2五味子代谢产物的质量分数Table 2Mass fraction of metabolites of Schisandrae Chinensis Fructus化合物名称烘干晒干微波烫漂蒸制1丙氨酸0.100±0.0210.157±0.0320.085±0.0184）0.037±0.0062，4）0.045±0.0102，4）2精氨酸0.129±0.0300.086±0.0120.135±0.0120.156±0.0240.055±0.0123天冬酰胺20.091±2.98816.116±2.00927.348±1.6091，4）17.981±2.85117.841±1.1474甜菜碱0.039±0.0080.012±0.0020.027±0.0050.021±0.0040.028±0.0035胆碱0.427±0.0740.524±0.0800.395±0.0470.288±0.0440.375±0.0836柠檬酸37.978±5.98526.163±3.57341.449±3.2274）26.800±5.51725.472±5.2561）7甲酸0.019±0.0030.014±0.0020.019±0.0040.011±0.0020.014±0.0028果糖18.574±3.35115.588±2.83315.932±2.65912.629±2.20012.410±1.8002）9葡萄糖21.383±3.40214.405±2.04615.343±2.53112.170±1.9562）17.238±3.00710甘油0.104±0.0150.397±0.0360.160±0.0272，4）0.047±0.0052，4）0.055±0.0061，4）11甘氨酸0.213±0.0360.071±0.0090.236±0.0160.170±0.0280.321±0.05512乙醇酸0.021±0.0030.023±0.0040.042±0.0080.024±0.0030.037±0.00513胍基乙酸盐1.033±0.1770.793±0.1330.658±0.1160.662±0.1370.747±0.15114异亮氨酸0.049±0.0080.075±0.0160.027±0.0042，4）0.008±0.0012，4）0.007±0.0012，4）15亮氨酸0.077±0.0130.119±0.0150.039±0.0072，4）0.014±0.0032，4）0.015±0.0032，4）16赖氨酸0.128±0.0140.053±0.0060.068±0.0112）0.065±0.0122）0.036±0.0042）17蛋氨酸0.032±0.0060.029±0.0050.000±0.0002，4）0.000±0.0002，4）0.000±0.0002，4）18磷酸胆碱0.048±0.0050.041±0.0070.078±0.0130.035±0.0060.048±0.00419苯丙氨酸0.057±0.0050.063±0.0040.023±0.0042，4）0.000±0.0002，4）0.023±0.0042，4）20蔗糖0.560±0.0580.208±0.0351.187±0.1881，4）1.903±0.2622，4）2.597±0.4092，4）21苏氨酸0.068±0.0090.093±0.0070.026±0.0042，4）0.011±0.0012，4）0.014±0.0022，4）22葫芦巴碱0.151±0.0250.180±0.0300.135±0.0153）0.083±0.0072，4）0.134±0.0063）23酪氨酸0.029±0.0030.060±0.0020.028±0.0050.032±0.0040.021±0.00424尿苷0.020±0.0030.031±0.0020.029±0.0032）0.000±0.0002，4）0.000±0.0002，4）25缬氨酸0.058±0.0070.123±0.0180.035±0.0062，4）0.009±0.0012，4）0.010±0.0012，4）26肌醇0.054±0.0040.107±0.0130.074±0.0110.045±0.0020.000±0.00027甘油磷酰胆碱0.027±0.0020.036±0.0030.057±0.0052，4）0.074±0.0072，4）0.067±0.0052，4）注：与烘干样品比较1）P0.05，2）P0.01；与晒干样品比较3）P0.05，4）P0.01mg·g-12.4　数据分析将得到的代谢物浓度数据导入SIMCA 14.1软件中进行主成分分析（PCA），再用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）找出显著差异代谢物，并使用GraphPad Prism 8.0.2进行单因素方差分析。2.5　多元统计分析［15-16］将15批五味子的27个代谢产物含量导入SIMCA 14.1进行多元统计分析，得到PCA得分图和OPLS-DA得分图，见增强出版附加材料。结果发现各组样品间分离较好，组间差异明显，说明不同加工方法使五味子代谢产物的含量发生了改变。进一步使用OPLS-DA将烘干样品和晒干样品分别与3组“杀青”样品进行比较，得到其变量投影重要性（VIP）值和S-plot图，见图2和图3。以VIP值1，以及S-plot图中|P|0.2和|P（corr）|0.5作为条件，共筛选出17个差异代谢物，即柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油磷酰胆碱、甘油、尿苷、葫芦巴碱、天冬酰胺、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.F002图2五味子“杀青”样品与烘干样品比较的OPLS-DA得分和VIP值预测Fig. 2OPLS-DA score and VIP value prediction plots of green removing samples and dried samples of Schisandrae Chinensis Fructus注：A2、B2、C2中横坐标轴编号同表2中化合物编号（图3同）10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.F003图3五味子“杀青”样品与晒干样品比较的OPLS-DA得分和VIP值预测Fig. 3OPLS-DA score and VIP value prediction plots of green removing samples and sun-dried samples of Schisandrae Chinensis Fructus2.6　单因素方差分析将得到的17个差异代谢物的含量数据导入GraphPad Prism 8.0.2，分别以烘干样品和晒干样品为参照进行单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett检验，检验水准α=0.05，见表2和增强出版附加材料。结果发现柠檬酸是17个差异代谢物中含量最高的化合物，之后依次为天冬酰胺、葡萄糖、果糖和蔗糖；柠檬酸和天冬酰胺在微波样品中的含量最高，葡萄糖和果糖在烘干样品中的含量最高，而蔗糖在蒸制样品中的含量最高。与烘干和晒干样品比较，经过“杀青”处理的五味子样品中蔗糖和甘油磷酰胆碱2个化合物的含量均明显升高（P0.05，P0.01），缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸的含量均显著降低（P0.01）；微波处理的五味子中天冬酰胺的含量明显升高（P0.05，P0.01），而烫漂处理的五味子中葫芦巴碱和尿苷的含量均显著降低（P0.01）。3 讨论据报道，不同加工方式会影响五味子木脂素类成分的含量。例如，李旭等［17］比较了不同加工方式对五味子中成分含量的影响，采用HPLC测定样品中6种木脂素类成分的含量，结果发现55 ℃烘干样品中6种木脂素总量要高于阴干、40 ℃烘干及45 ℃烘干等加工方式。安开龙等［18］以11种木脂素类成分和5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量为指标，采用不同干燥方法对五味子鲜果进行处理，结果表明45 ℃真空干燥和50 ℃热风烘干样品中五味子醇甲含量和11种木脂素类成分总量最高、有害成分5-HMF的含量较低。因此，本文分别以烘干和传统的晒干2种方法作为对照，采用1H-NMR代谢组学技术研究“杀青”对五味子的代谢产物及代谢轮廓的影响，鉴定出的27个代谢产物绝大多数为初级代谢产物，主要为氨基酸、有机酸和糖类，而这些初级代谢产物是果实采后生理能量代谢的主要参与者［19］。果实采收后，其内部仍进行着能量代谢和其他各种代谢活动，能量代谢的水平和状态决定着果实采后的品质。本文研究发现，“杀青”会使五味子中氨基酸、有机酸和糖类成分的含量发生明显改变，大多数氨基酸类成分的含量在“杀青”样品中呈降低趋势，说明“杀青”可能影响了果实组织中的氨基酸合成和代谢，而大多数氨基酸合成的碳骨架主要来自三羧酸循环（TCA循环）中的重要中间代谢产物，如α-酮戊二酸和草酰乙酸，见图4。α-酮戊二酸是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，通过谷氨酸的转氨基作用可以生成谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸等，也可以回补产生α-酮戊二酸而达到补充此中间代谢产物的目的；草酰乙酸与α-酮戊二酸相似，既可以通过天冬氨酸生成天冬酰胺、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等，也可以将这些氨基酸转氨基回补草酰乙酸，这提示“杀青”可能干扰了五味子鲜果干燥过程中的能量代谢活动［20-21］。同时，五味子经过不同“杀青”方法处理后，蔗糖的含量均明显升高。蔗糖是高等植物光合作用的主要终产物，在植物生长发育、品质改良及逆境防御等过程中起着重要作用。蔗糖及其代谢产物不仅为植物生长提供能量基础，而且具有信号分子功能，是细胞代谢的主要调控因子［22］。结合前期实验发现，五味子鲜果采后“杀青”再干燥可以提高总木脂素、总多糖和挥发油三者含量的总和，说明五味子鲜果采摘后其有效成分可能在能量代谢等活动中被消耗、分解和（或）转化。10.13422/j.cnki.syfjx.20220357.F004图4TCA循环中的氨基酸合成和代谢Fig. 4Amino acid synthesis and metabolism in TCA cycle1H-NMR可在短时间内检测大量代谢物［23］，但其也存在一定缺陷，如灵敏度低［24］，很多含量较少的成分无法被检测出［25］，后续将采用液相色谱-质谱法（LC-MS）和气相色谱-质谱法（GC-MS）等技术对其代谢轮廓进行分析，以期为阐释五味子鲜果采后“杀青”加工的科学性提供实验依据。