非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）过程中的一种病理类型［1］，也是MAFLD发展进程中较为严重的病理阶段，其主要病理特征为肝细胞损伤、炎症增多及肝纤维化的出现［2-3］。若不加以治疗，NASH可发展为原发性肝癌、肝硬化等终末期病变。金银花是我国传统中药，是忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，性味甘寒而不伤胃，芳香透达又可祛邪，既能宣风散热，还可清热解毒［4］。目前，NASH在临床上尚无获得认可的理想治疗药物，而中药具有不良反应小等特点，同时现代药理研究也证明了，金银花及其主要活性成分具有较好的抗氧化、自由基清除、抗炎及调节心血管系统等作用［5-7］。这也说明金银花具有一定的抗炎疗效。此外，研究指出金银花醇提物能通过降低c-Jun氨基末端激酶（JNK）活化，促进细胞外调节蛋白激酶（ERK）激活来改善NASH［8］。其活性成分绿原酸（CGA）与京尼平苷合用能够改善高脂饲料诱导的NASH，但其具体机制尚不清楚［9］。同样有研究报道表明CGA改善MAFLD是通过调节肠道菌群和GLP-1实现的［10］。因此，实验采用蛋氨酸胆碱缺乏饲料（MCD）诱导小鼠NASH模型，来探讨金银花水提物（FL）对NASH的改善作用及其具体作用机制，以期为NASH治疗药物研发，临床用药提供实验依据。1 材料1.1　药材金银花（上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学吴立宏研究员鉴定，为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或带初开的花）。金银花水提物是实验室前期制备所得，具体方法见文献［11］。通过高效液相色谱（HPLC）测得金银花水提物中CGA，咖啡酸及和木犀草苷的质量分数分别为14.73%、0.17%、0.0613%，符合2020年版《中华人民共和国药典》标准。1.2　试剂与仪器蛋氨酸胆碱正常含量饲料（MCS）、MCD饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，饲料代码TP3005GS、TP3005G）；丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（NEFA）、羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20181224、20180825、20180914、20181105、20180825）；BCA试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，批号T1269577）；PrimeScript® RT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTM（宝日医生物技术有限公司，批号分别为AIF2352、AK8401）。抗体：α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、β-肌动蛋白（β-actin）（美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为#48938、#8457），热休克蛋白60（HSP60，美国Genetex公司，批号GTX110089）；过氧化物酶结合的山羊兔抗和鼠抗（美国Jackson ImmunoResearch公司，批号分别为AB_2337913、AB_2338447）。异丙醇、无水乙醇、三氯甲烷均购自中国国药集团；TRIzol（美国Life Technology公司，批号AL11815A）；SYBR green premix（翌圣生物有限公司，批号H1911331）；丽春红染色液（Ponceau S，大连美仑生物技术有限公司，货号MA0063）；苏木素-伊红（HE）、马松三色（Masson）、天狼星红（Sirius Red）（上海天贺生物科技有限公司，批号分别为SH001、SH005、SR、SH0020）。Synergy H4型酶标仪（美国BioTek公司），Centrifuge 5424 R型低温离心机（德国Eppendorf公司），QuantStudio 6 flex型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国Life Technology公司）。2 方法2.1　药物配制精确称取一定量的金银花水提物粉末混于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），配置为40 g·L-1的悬液。2.2　动物分组及给药清洁级C57BL/6小鼠（20±2）g购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养条件为温度（22±1）℃，湿度控制在65%±5%，12 h光暗周期。小鼠适应性喂养1周后进行实验。所有实验用动物均按照上海中医药大学实验动物伦理委员会批准的动物护理指南进行人文关怀（伦理号PZSHUTCM190830005）。MCD诱导的小鼠动物模型具有典型的NASH病理学特点，且造模时间短，成功率高，是国际公认的NASH模型［12-13］。将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组（MCS喂养，n=6）、模型组（MCD喂养，n=6）、FL低剂量组（MCD+0.2 g·kg-1 FL，n=6）、FL高剂量组（MCD+0.4 g·kg-1FL，n=6）。待小鼠体质量升至（25±2）g，进行过渡期饲养，除了空白组之外的其他组小鼠在第1~2天时用MCD饲料与MCS饲料以1∶2混合喂养，第3~4天用MCD饲料与MCS饲料等比例混合喂养，第5~6天用MCD饲料与MCS饲料以2：1混合喂养，从第7天开始至实验结束，所有小鼠均用MCD喂养6周（空白组除外），空白组给予MCS对照饲料。在MCD饲料正式喂养2周后，给药组小鼠每天灌胃FL（0.2，0.4 g·kg-1），空白组和模型组给予等体积的5% CMC-Na，给药4周后，将小鼠禁食后处死，收集血液和肝组织。2.3　血清ALT和AST检测将血液在室温条件下静置2 h，860 ×g离心15 min，吸取上清液移至新离心管中，然后按照试剂盒说明书测定ALT和AST。2.4　肝组织病理观察小鼠肝脏固定在4%多聚甲醛溶液中，进行石蜡包埋和切片，用HE染色后，在显微镜下观察肝组织的病理变化。用Masson染色及天狼星红染色观察肝组织胶原沉积情况。2.5　肝组织TG和NEFA检测按照检测试剂盒说明书检测小鼠肝组织中TG及NEFA的含量。2.6　肝组织HYP含量测定按照检测试剂盒说明，称取定量肝脏组织检测小鼠肝脏中HYP含量。2.7　肝组织RNA提取及逆转录称取肝组织约20 mg，加入TRIzol 1 mL，置冰上匀浆，匀浆液静置5 min。加入三氯甲烷200 μL，振荡15 s，静置2~3 min，4 ℃，12 000×g离心15 min。将上层水相移至新的离心管，加入异丙醇0.5 mL，上下颠倒充分混匀，静置10 min，4 ℃，12 000×g离心10 min，弃上清。在沉淀中加入预冷的75%乙醇1 mL，轻轻振荡洗去杂质，4 ℃，7 500×g离心5 min。吸弃乙醇，沉淀置于超净工作台内晾干，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水100 μL充分溶解，得到RNA溶液，液氮速冻后，-80 ℃保存备用。得到的RNA用PrimeScript™RT Master Mix试剂盒进行逆转录，合成cDNA。2.8　Real-time PCR实验cDNA与SYBR green premix试剂混合后置于QuantStudio 6 flex型Real-time PCR仪中进行扩增。扩增完成后，根据溶解曲线判断扩增反应的准确性。最后目标基因的相对表达量以β-actin标准化，采用2-ΔΔCt法。所用引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T001表1引物序列Table 1Primer sequence基因序列（5'-3'）长度/bpCol1a1上游TGACTGGAAGAGCGGAGAGT117下游GACGGCTGAGTAGGGAACACCol3a1上游ATGGGTTTCCCTGGTCCTAA196下游TGCCTTGTAATCCTTGTGGATGFb1上游TGCCCTCTACAACCAACACA124下游GTTGGACAACTGCTCCACCTPTGS2上游CTGTTTTGGTAGGCTGTGGAT230下游AGATGCTATCTTTGGGGAGACIL-1b上游TGTGTTTTCCTCCTTGCCTCTGAT105下游TGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATTNF-α上游CACCCCGAAGTTCAGTAGACA184下游TCCCTCCAGAAAAGACACCATICAM-1上游CTGAAAGATGAGCTCGAGAGTG141下游AAACGAATACACGGTGATGGTAβ-actin上游TTCGTTGCCGGTCCACACCC90下游GCTTTGCACATGCCGGAGCC注：Col1a1.α1-I型胶原基因；TGFb1.转化生长因子b1；PTGS2.大鼠环加氧酶2；ICAM-1.细胞间黏附分子-12.9　蛋白样本制备肝组织全蛋白样本的提取：称取肝组织20~100 mg，加入肝组织质量10倍量的含蛋白酶抑制剂的裂解液冰上匀浆，提取总蛋白。血清蛋白样本制备：量取血清样本10~20 μL，加入等量的2×Loading Buffer，振荡混匀，置煮样器99 ℃煮样10 min，制得血清蛋白。2.10　蛋白免疫印迹法（Western blot）实验制备好得蛋白样本以SDS-PAGE凝胶电泳分离，在电流作用下转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；以5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，分别加相应的抗体α-SMA（1∶1 000），β-actin（1∶1 000），HSP60（1∶1 000）于4 ℃环境过夜孵育；以含0.1%聚山梨酯-20的TBS缓冲液洗脱未结合的抗体，用与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的二抗（山羊兔抗1∶5 000，山羊鼠抗1∶1万）在室温条件下孵育1 h；洗脱未结合的二抗，以化学发光HRP底物对PVDF膜进行显色反应，置于凝胶成像仪中曝光。普通蛋白使用β-actin作为对照进行相对定量分析。血清中HSP60蛋白使用立春红染色作为对照进行相对定量分析。2.11　网络药理学2.11.1　金银花活性成分及靶点筛选利用中药系统药理学分析平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，TCMSP）获取药物主要成分及其对应靶点，根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为标准进行检索并结合文献内容进行筛选。2.11.2　NASH疾病靶点的筛选GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库覆盖面极广，是集疾病与人类基因于一体的数据库，借助GeneCards数据库，以“NASH”为关键词检索，筛选出与NASH疾病相关的基因。2.11.3　中药金银花治疗NASH核心靶点的筛选将从TCMSP中收集的金银花活性成分对应靶基因和NASH疾病相关的基因取交集，得出金银花治疗NASH的可能核心靶点。2.11.4　中药金银花治疗NASH核心靶点的筛选Metascape数据库3.5（http：//metascape.org/gp/#/main/step1）可进行基因功能注释和通路富集分析。将筛选出的作用靶点导入Metascape数据库3.5中，进行GO功能富集分析，并分析其可能参与的信号通路，筛选P0.01的条目，并对数据进行可视化处理。2.12　NAS评分NAS评分是半定量评分系统，NAS3分可以排除NASH，NAS4分即为NASH，NAS介于两者之间可能为NASH。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T002表2NAS评分细则Table 2NAS scoring rules项目评分0123肝细胞脂肪变性5%5%~≤33%34%~≤66%66%小叶内炎症（以坏死灶数计）无2个2~4个4个肝细胞气球样变无少见多见/10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T003表3FL对MCD诱导小鼠肝脏损伤的影响 （x¯±s）Table 3Effect of FL on MCD-induced liver injury in mice （x¯±s）组别剂量/g·kg-1ALT（n=6）/U·L-1AST（n=6）/U·L-1TG（n=8）/μmol·g-1NEFA（n=6）/μmol·gprot-1NAS评分/分（n=3）空白组2.90±0.6757.19±3.992.38±0.27137.75±30.951.00±0.00模型组290.74±3.63 2）218.80±19.442）3.21±0.151）214.30±22.352）7.67± 0.332）FL低剂量组0.2129.08±21.183）132.28±11.453）4.32±0.50240.84±21.153.33±0.334）FL高剂量组0.4195.08±14.463）158.67±11.724）3.28±0.20224.28±26.315.33±0.884）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表6-表9同）10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T004表4FL对小鼠肝脏中炎症及胶原沉积的影响（x¯±s）Table 4Effect of FL on hepatic inflammation and collagen deposition in mice （x¯±s）组别剂量/g·kg-1MPO （n=4）/U·g-1HYP （n=4）/mg·L-1Col1a1mRNA（n=3）Col3a1mRNA（n=4）空白组0.005±0.0010.062±0.0070.91±0.061.040±0.039模型组0.064±0.0252）0.187±0.0162）2.54±0.331）1.990±0.0272）FL低剂量组0.20.016±0.0023）0.121±0.0104）1.35±0.333）1.280±0.0033）FL高剂量组0.40.013±0.0034）0.106±0.0024）1.37±0.054）1.780±0.0684）2.13　数据处理实验数据用x¯±s表示，采用统计软件SPSS 22.0进行分析，以早因素方差分析（One-way ANOVA）方式进行方差分析，两两比较采用最小显著性差异法（LSD），P0.05为差异具有统计学意义。3 实验结果3.1　FL减轻MCD诱导小鼠NASH病变中的肝细胞损伤结果显示，给药FL（0.2、0.4 g·kg-1）后能够明显降低模型组小鼠血清中升高的ALT和AST酶活力（P0.01，P0.05），见表3。检测小鼠肝脏TG、NEFA结果发现，与空白组比较，模型组小鼠肝脏中TG、NEFA水平明显升高（P0.05，P0.01），给药FL后无明显降低，见表3。HE染色结果发现，空白组小鼠肝细胞边界清晰排列整齐且无明显脂肪空泡，与空白组比较，模型组小鼠出现大量的脂肪空泡，而给药不同剂量（0.2、0.4 g·kg-1）FL后无明显改善作用，见图1。根据肝组织病理切片染色结果观察统计得出NAS评分，评分结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肝脏NAS显著升高（P0.01），说明造模成功；给予FL（0.2、0.4 g·kg-1）的小鼠肝脏NAS评分与模型组比较显著降低（P0.01）。说明0.2、0.4 g·kg FL对MCD诱导NASH模型中肝细胞损伤有明显改善作用，但对脂肪累积的改善作用并不明显。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.F001图1FL对小鼠肝组织病理学的影响（HE）Fig.1Effect of FL on liver histopathology in mice （HE）注：A.空白组；B.模型组；C.FL低剂量组；D.FL高剂量组（图2-图4同）3.2　FL改善MCD诱导小鼠NASH病变中肝脏炎症及胶原沉积0.2、0.4 g·kg-1 FL能够明显改善MCD模型组小鼠肝组织MPO水平的升高（P0.05，P0.01）。与空白组比较，模型组小鼠肝脏中HYP水平显著升高（P0.01），0.2、0.4 g·kg-1 FL给药后小鼠肝脏HYP水平显著下降（P0.01），且能够有效降低模型组小鼠肝脏中Col1a1和Col3a1的基因表达（P0.05，P0.01）。同时Masson染色与天狼星红染色结果显示，与MCS空白组比较，MCD模型组小鼠肝脏胶原沉积显著增加，给予FL（0.2，0.4 g·kg-1）后显著降低了肝脏胶原沉积。见表4、图2和图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.F002图2FL对小鼠肝脏中胶原沉积的影响（Masson）Fig.2Effect of FL on hepatic collagen deposition in mice （Masson）10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.F003图3FL对小鼠肝脏中胶原沉积的影响 （天狼星红）Fig.3Effect of FL on hepatic collagen deposition in mice （Sirius Red）3.3　FL中活性成分的筛选上述实验结果发现FL具有改善NASH的药效，接着进行网络药理学研究，首先根据OB≥30%和DL≥0.18为标准进行检索，并结合文献内容进行筛选获得金银花的活性成分共25个，见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T005表5金银花活性成分Table 5Active ingredients in FL编号化合物名称MOL0030624，5'-retro-beta.，beta-carotene-3，3'-dione，4'，5'-didehydro-MOL003044菊苣醇MOL000006木犀草素MOL000358β-谷甾醇MOL002773β-胡萝卜素MOL002914圣草酚（黄烷酮）MOL000422山柰酚MOL001494甘露醇MOL003124木糖定MOL002707植物氟烯MOL003036ZINC03978781MOL000449豆甾醇MOL001495亚麻酸乙酯MOL0031017-epi-vogelosideMOL000098槲皮素MOL003059氪黄质MOL003128二乙基癸二糖苷MOL0030955-hydroxy-7-methoxy-2-（3，4，5-trimethoxyphenyl）chromoneMOL003014secologanic dibutylacetal_qtMOL003108蓝花苷CMOL003111centauroside_qtMOL003117ioniceracetalides B_qtMOL003006（-）-（3R，8S，9R，9aS，10aS）-9-ethenyl-8-（beta-D-glucopyranosyloxy）-2，3，9，9a，10，10a-hexahydro-5-oxo-5H，8H-pyrano［4，3-d］oxazolo［3，2-a］pyridine-3-carboxylic acid_qtMOL000414咖啡酸MOL001955绿原酸3.4　FL对NASH作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建将FL中活性成分靶点与疾病靶点取交集，共得到FL治疗NASH的潜在靶点77个。依蛋白相互作用数据库（STRING）数据库（https：//www.string-db.org/）进行PPI分析，得出中药金银花治疗NASH关键靶点PPI网络信息，并将信息导入Cytoscape 3.8.1制作PPI网络图，计算中介中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）值，值越高说明该节点在PPI网络中。根据各参数中位值进行筛选，分别为BC0.006 7，CC0.40，DC5.5，结果共显示15个核心靶点，分别是JUN、AKT1、TP53、TNF、RELA、RXRA、IL6、MAPK14、CTNNB1、ESR1、IL1B、CAV1、HIF1A、MAPK8，见表6、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T006表6FL对NASH作用核心靶点Table 6Core targets of FL treat FL编号靶基因蛋白名称1ESR1estrogen receptor 12PTGS2prostaglandin-endoperoxide synthase 23MAPK14mitogen-activated protein kinase 144RELArela proto-oncogene，NF-κB subunit5Akt1Akt serine/threonine kinase 16TNFTNF receptor superfamily member 1A7JUNJun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit8IL-6interleukin 69TP53tumor protein P5310CAV1caveolin 111CTNNB1catenin beta 112MAPK8mitogen-activated protein kinase 813RXRAretinoid X receptor alpha14HIF1Ahypoxia inducible factor 1 subunit alpha15IL1Binterleukin 1 beta10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.F004图4FL对α-SMA蛋白、血清HSP60的电泳表达Fig.4Electrophoresis of FL on α-SMA protein，HSP60 expression3.5　FL改善NASH的基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析GO功能富集分析可以对FL治疗NASH的关键交集靶点蛋白进行功能注释。KEGG信号通路富集分析，可以提示参与金银花治疗NASH的相关信号通路，因此进一步使用Metascape对这77个关键靶点蛋白进行GO和KEGG通路富集分析。分析结果表明，KEGG结果中主要包括癌症、糖尿病、炎症等多个信号通路；GOMF分子功能主要涉及细胞因子、转录因子的结合等。而临床上NASH的主要表征为肝脏的脂肪累积、持续性炎症及肝脏纤维化，因此结合富集分析结果，认为FL发挥改善NASH的作用可能与胶原等细胞外基质、炎症反应等生物过程有关，核转录因子-κB（NF-κB）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和热休克蛋白相关等信号通路也可能有参与作用。见增强出版附加材料。3.6　FL降低MCD模型小鼠肝脏中炎症因子表达NF-κB信号通路被认为是经典的炎症信号通路，结合网络药理学分析结果，推测NF-κB可能是FL改善NASH的关键信号通路之一。因此检测肝组织中NF-κB下游相关基因，如白细胞介素-1β（IL-1β）、环氧合酶2（COX2）、细胞间黏附分子1（ICAM1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA水平，结果显示：给药0.2、0.4 g·kg-1 FL后能够明显降低模型组小鼠肝脏炎症相关因子的升高（P0.05，P0.01），见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T007表7FL对炎症因子基因表达的影响 （x¯±s，n=4）Table 7Effect of FL on mRNA expression of inflammatory factors （x¯±s，n=4）组别剂量/g·kg-1TNF-αIL-1βICAM-1COX-2空白组1.13±0.340.64±0.191.06±0.221.10±0.26模型组4.66±0.791）1.24±0.111）1.68±0.221）3.78±0.512）FL低剂量组0.21.79±0.254）0.45±0.063）0.92±0.143）0.77±0.134）FL高剂量组0.42.36±0.483）0.57±0.093）1.19±0.034）1.41±0.164）3.7　FL减少MCD模型小鼠肝星状细胞（HSC）的激活活化的HSC是NASH诱导的肝纤维化中细胞外基质（ECM）产生的主要来源，网络药理学结果也提示FL可能通过减少ECM的沉积改善NASH。因此实验检测FL对HSC激活的影响，见图4；0.4 g·kg-1 FL能明显抑制模型组小鼠肝组织中α-SMA的蛋白表达的升高（P0.05，P0.01）。同时给药0.2、0.4 g·kg-1 FL后也能明显降低MCD诱导的小鼠肝脏中α-SMA及转化生长因子-β（TGF-β）基因的高表达（P0.05，P0.01），见表8。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T008表8FL对小鼠肝组织中α-SMA蛋白及α-SMA和TGF-β基因表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 8Effect of FL on α-SMA protein expression and α-SMA and TGF-β mRNA expression （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1α-SMA蛋白α-SMA mRNATGF-β mRNA空白组1.00±0.000.91±0.061.04±0.039模型组2.16±0.172）2.54±0.331）1.99±0.0272）FL低剂量组0.22.30±0.311.35±0.333）1.28±0.0033）FL高剂量组0.41.45±0.153）1.37±0.053）1.78±0.0684）3.8　FL减少MCD模型小鼠血清HSP60释放由于网络药理学结果提示热休克蛋白相关信号分子可能有一定的参与作用，HSP60也属于损伤相关分子模式的一种。因此实验检测了小鼠血清中的HSP60的释放，结果显示给药0.4 g·kg-1 FL能够明显降低模型组小鼠血清中HSP60的释放增加（P0.05），见图4、表9。10.13422/j.cnki.syfjx.20220912.T009表9FL对血清HSP60释放的影响 （x¯±s，n=3）Table 9Effect of FL on the release of serum HSP60 （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1HSP60空白组1.00±0.00模型组4.82±0.671）FL低剂量组0.24.03±1.27FL高剂量组0.42.39±0.453）4 讨论随着国内生活水平的提高，人们生活习惯、饮食方式的改变，MAFLD患者数量逐年上升，而其中10%~30%的患者可能会发展为NASH［14］。根据预测，在未来十年我国NASH患病率将比目前增加15%~56％［15-17］。关于NASH的发病机制，1998年的“二次打击”观点认为NASH是肝细胞脂肪变性基础上进一步诱发炎性反应、肝细胞坏死及肝纤维化，这也是被广泛接受的NASH发病机制的理论之一［18-20］。随着研究的进一步深入，“多重平行打击”理论认为胰岛素抵抗、炎症反应、遗传因素等都能影响NASH发病进程，并且各因素间互相影响［20］。但是到目前为止NASH发病的具体机制尚不明确，因此对NASH病因病机的深入研究有利于临床诊断和治疗。在中医辨证论治中，根据NASH的发病特点及症状体征，临床常将其归为胁痛、积聚、肝癖、痞证、积证、肥气等疾病范畴［21］，证见肝郁脾虚、湿热内蕴、气滞血瘀、痰瘀互结［22］，临床治疗多以清热利湿、疏肝理气健脾、化痰利湿降浊、活血化瘀、消积导滞等为主［23-28］。已有研究发现清热类中药可以改善NASH症状，恢复肝功能，如刘丹等［29］发现菌陈蒿汤能有效改善患者血脂血糖异常，减少肝脏损伤。麦静愔等［30］通过研究发现参葛方可明显改善患者症状，起到护肝、改善脂质代谢异常及减少肝细胞脂肪浸润的作用。上海市名中医陈建杰教授创制的以黄连、黄芩、连翘、金银花配伍组成的苍菊清肝方能够有效改善MAFLD患者临床症状［31］。金银花是清热类中药，研究表明，金银花水提物能够通过抑制HSC激活，逆转上皮细胞间充质转化（EMT）并诱导核因子E2相关因子（Nrf2）激活，减少肝脏氧化应激损伤，从而改善CCl4诱导的肝纤维化［32］。但是关于金银花水提物对NASH是否有治疗作用及其治疗机制并不明确。实验根据ALT、AST及肝脏病理切片的结果发现，FL可以对MCD诱导的肝细胞损伤有一定的改善作用，但TG和NEFA的检测结果发现FL无明显的降脂作用。在NASH中肝脏脂肪变性是病理发展的第一步，胰岛素抵抗促进脂肪组织分解，使得游离脂肪酸（FFA）在肝脏内过多累积，造成肝脏损伤［33-34］。因此推测FL改善NASH的活性与降脂无关。由于脂质的过度累积，肝脏处理FFA的能力减弱。大量的FFA会导致脂毒性，并进一步引发一系列炎症反应，具体过程涉及到免疫细胞的募集和促炎信号通路的激活，炎症反应会进一步加重肝损伤，促进肝纤维化进程。实验通过检测MPO发现FL具有一定的抗炎活性，这也提示了FL的抗炎活性可能是其改善NASH的机制之一。肝纤维化是NASH进程中较为严重的阶段，主要表现为肝脏的胶原沉积，实验研究结果也发现了FL可以减少MCD模型诱导的小鼠肝脏胶原沉积，减少肝脏纤维化。上述结果明确了FL具有改善NASH的药效活性。在明确FL具有改善NASH活性的前提下，实验进行网络药理学分析，首先筛选出FL中主要活性成分共25个，其次将其潜在靶点与NASH疾病靶点取交集，得到潜在的靶点77个，接着根据Cytoscape软件中BC、CC、DC等中位值筛选出关键的靶点如JUN、TNF、IL-1B等，并进行GO与KEGG通路分析，结果发现：FL改善NASH的作用与NF-κB、HIF-1α和热休克蛋白等信号通路有关。研究普遍认为NF-κB通路是重要的促炎信号传导途径，激活的NF-κB可以上调多种促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α）、趋化因子的表达，引发持续性炎症［35］。因此NF-κB及其下游促炎因子的表达在NASH的发展进程中扮演重要角色［36-38］。查阅文献发现，金银花的主要活性成分CGA可以通过抑制NF-κB信号通路减少炎症损伤［39］。在实验中也发现FL可以降低NF-κB下游炎症相关因子的mRNA的表达。HSP60是一种损伤相关分子模式，研究发现HSP60在血清中的释放会引起肝脏NF-κB的激活并导致过度的炎性反应［40-42］。此外，CGA能够调节HSP60改善对乙酰氨基酚诱导的肝脏损伤［43］。因此实验进一步检测了FL对NASH中HSP60的影响，结果发现，FL给药后能够改善MCD小鼠血清中HSP60的释放增加。因此推测FL可以通过减少HSP60的血清释放，降低NF-κB的激活，改善NASH。此外，网络药理学结果同样提示FL可能通过减少ECM改善NASH中的纤维化。研究认为活化的HSC是形成肌成纤维细胞的主要来源，且是纤维化进程中的重要组成部分［44］。HSC经历表型转换分化为肌成纤维细胞后会导致α-SMA表达的增加，诱导肝脏中ECM的累积，加速肝纤维化进程［45-47］。同时，TGF-β被认为是纤维化形成的关键诱导因子，且与ECM的过度产生有关［48-49］，也是已知能激活HSC的主要促纤维化因子［50-51］。因此，实验也探究了FL对NASH进程中纤维化的影响，结果显示FL减少α-SMA，TGF-β的基因表达，降低α-SMA蛋白表达，抑制HSC的活化，这提示FL可能通过减少HSC的激活改善NASH。综上所述，FL可以通过降低炎症，减少胶原沉积、抑制HSC激活来改善NASH。实验为金银花及其主要活性成分改善NASH的研究提供一定思路，也为临床金银花应用于NASH的治疗提供理论依据。