类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、进行性、全身性自身免疫性疾病，其基本的病理改变为关节滑膜的异常增生、血管翳形成，并逐渐出现关节的软骨和骨破坏，最终导致关节畸形及功能丧失。RA在我国的患病率约为0.35%，并且具有高度的致残率［1-3］。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）在白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的刺激下表现出抗凋亡的细胞特性，使滑膜炎症和异常增生持续存在［4-6］。越来越多的结果指出，除抗细胞凋亡的特性以外，自噬是RA-FLS过度增生的又一重要机制。RA-FLS通过上调自噬相关蛋白，如自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达水平，及时清除错误折叠蛋白、受损的细胞器等变性的胞浆成分，延长自身的存活时间，进一步减少其凋亡［6-7］，表明RA-FLS低凋亡率和高自噬水平促进了RA滑膜炎的发生并加重RA病情。祖国医学认为RA属于“痹证”范畴，可分为风寒湿痹型、风湿热型、寒湿阻络型、痰瘀互结型及肝肾两虚型5种证型［8］。风湿热痹作为RA临床常见证型，可因久居炎热潮湿之地，外感风湿热邪，袭于肌腠，壅于经络，痹阻气血经脉，滞于关节筋骨或素体阳盛，内蓄积热，复感风湿之邪，入里从阳化热等引起，临床上以游走性关节疼痛，活动不便，关节灼热红肿，强硬不舒，喜冷恶热，得冷则舒，可有皮下结节或红癍，常伴发热、恶风、汗出、口渴、烦躁不安、舌红、苔黄或黄腻、脉滑数或浮数为主要表现［9］。辨证论治是中医学理论核心，为了在基础研究中体现中医辨证论治，以更好地探讨与诠释疾病的发病机制，采用“病证结合”的原则，在模拟西医病理因素基础上，加以中医对“证”的考量，基于实验理论设计中医证候模型不失为一种较好的研究思路［10］。病证结合动物模型亦是实现中医药现代化发展的关键［11］，其既能保证疾病发病的统一性，又能体现“证”的一致性，体现现代医学与传统医学相结合的巨大优势，可为临床研究与治疗提供科学可靠的实验依据，有利于进一步了解疾病的发生发展规律，在促进中医药对疾病防治具有重大意义。因此，本研究基于对RA风湿热痹病因病机的认识，尝试在灭活结核杆菌（Mtb）诱导下建立RA风湿热痹动物模型，从全身炎症指标、自噬与凋亡相关蛋白及基因表达等多层次对模型进行综合评价，为完善RA病证结合动物模型提供更多的实验依据，以期用于防治RA的药物相关研究。1 材料1.1　动物由南方医科大学实验动物中心提供SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（160±10）g，动物许可证号SYXK（粤）2016-0041，在南方医科大学SPF级实验室适应性饲养7 d后开展实验。本实验符合南方医科大学的实验动物伦理委员会相关要求和原则，决议编号L2019201。1.2　药物与试剂Mtb（美国BD公司，批号7104681）；DEPC水（广州晶欣生物科技有限公司，批号210110）；大鼠TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒、苏木素染液、伊红染液、TRIzol（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为111220201167、111220201117、112818190320、120318190215、061318190723）；逆转录试剂盒、高灵敏性染料法实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测试剂盒（ChamQ SYBR Real-time PCRR Master Mix）（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号分别为7E470E0、7E381B9）；B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国CST公司，批号分别为05/2019、04/2019、08/2018）；LC3、Beclin1、p62（美国Proteintech公司，批号分别为00093290、00080987、00080720）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（武汉博士德生物公司，批号201912）；其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯产品。1.3　仪器RM2135型石蜡切片机（德国Leica公司），5804R型高速离心机（德国Eppendorf公司），VORTE-6型涡旋震荡仪、LX-500型瞬时离心机（海门Kylin-Bell有限公司），DS-11型超微量紫外分光光度计（美国DeNovix公司），YP200001型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司），Veriti96型梯度PCR仪（美国Applied Biosystems公司），LightCycler96型Real-time PCR仪（瑞士Roche公司），51119000FC型酶标仪（美国Thermo公司）。2 方法2.1　大鼠分组及模型构建将30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为正常组、佐剂性关节炎模型组（AA组）和RA风湿热痹模型组（FSR组），参照文献［12］在AA组和FSR组大鼠的尾根部注射Mtb诱导剂（1 mg/只）进行造模，正常组大鼠尾根部注射等体积生理盐水。从免疫第1天开始对FSR组大鼠置于风湿热环境的人工气候箱（温度36 ℃、湿度90%、风速5 m·s-1）中连续干预16 d（2次/d，每次2 h）。28 d后对各组大鼠进行相应处理。2.2　大鼠一般状态、体质量、足趾肿胀度、关节炎指数（AI）观察观察各组大鼠毛发、活动灵敏度、精神状态、大便形态等。造模后第1、4、8、12、16、20、24、28天用足趾容积测量仪测量各组大鼠足趾大小，同时记录AI评分，比较大鼠在造模前后的足趾容积变化，进一步判断大鼠足趾的肿胀情况。关节炎评分标准［13］：0分，无关节红肿；1分，趾关节出现轻微红肿；2分，足踝关节以下部位出现肿胀；3分，踝关节以下部位均出现肿胀；4分，包括踝关节在内整个足爪均出现肿胀，最高分为8分。双后足关节累计得分即为每只大鼠的AI。2.3　大鼠腹主动脉血清采集、脾脏提取及脾脏指数检测在麻醉状态下对各组大鼠进行腹主动脉采血。血液静置30 min，4 000 r·min-1离心15 min（离心半径10 cm，下同），56 ℃水浴30 min灭活补体，过滤，密封，标记，存于-80 ℃冰箱备用。采血完毕后剪开大鼠左上腹，用无齿镊提起肝脏，见其后缘脾脏后分离脾脏与周围结缔组织，取出脾脏后用磷酸盐缓冲液（PBS）涮洗2次去除血渍，滤纸吸干，进行称质量，分组固定，备用。脾脏计算公式为脾脏指数=脾脏质量（mg）/大鼠体质量（g）。2.4　大鼠膝关节滑膜组织及踝关节提取将大鼠处死后取仰卧位固定，75%乙醇消毒膝关节，沿膝关节正中纵行剪开皮肤，用齿镊提起髌骨，从髌骨上缘向下剪至股骨处，再从髌骨两侧向下分离至胫骨，打开膝关节腔，完整剥离滑膜组织，PBS涮洗2次，置于-80 ℃冰箱保存用于后续操作。剪下大鼠双后足，并将其浸泡于脱钙液中进行脱钙5 d。2.5　HE染色观察大鼠滑膜组织及踝关节的形态学变化将滑膜组织与踝关节进行石蜡包埋，切片，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察各组大鼠滑膜组织及踝关节的组织病理变化。2.6　ELISA检测大鼠血清IL-1β、TNF-α的含量按照说明书要求配制标准品，取出板条后放入96孔框架内，按每孔100 μL分别加入相应孔中，并设置调零孔（只加TMB溶液和终止液），室温避光孵育2 h。每孔加入生物素化抗体100 μL，室温避光孵育1 h。每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记Streptavidin 100 μL，室温避光孵育20 min。吸弃后按照每孔100 μL避光加入TMB显色，室温避光孵育20 min，最后每孔加入终止液50 μL终止反应，混匀，用酶标仪检测波长450 nm处各孔的吸光度A，制作标准曲线，根据标准曲线计算样本浓度。2.7　Real-time PCR检测IL-1β、TNF-α、Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的mRNA表达取大鼠滑膜组织样品放入匀浆管中，加入TRIzol提取，放入2粒4 mm、3粒3 mm氧化锆匀浆珠，匀浆机匀浆3次，4 ℃、12 000 ×g离心15 min。参照说明书用TRIzol法提取总RNA，测定各组大鼠RNA样品的纯度与浓度，将RNA进行逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，Real-time PCR的反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40次，按照Roche公司的Real-time PCR仪器预设定的melting以及cooling程序，运用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量，进行3次生物学重复，对所得数据进行统计学分析。该实验的引物由NCBI Primer-blast网站设计，通过擎科生物科技有限公司合成，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列（5'-3'）长度/bpIL-1β上游GGCTTCCTTGTGCAAGTGTCT161下游TCTGGACAGCCCAAGTCAAGTNF-α上游GATCGGTCCCAACAAGGAGG138下游GCTTGGTGGTTTGCTACGACLC3上游TTGGTCAAGATCATCCGGCG104下游TCAGCGATGGGTGTGGATACBeclin1上游TCAGGAACTCACAGCTCCAT153下游GTAGACATCATCCTGGCTGGGp62上游GAGGCTTTCAGGCGCACTA138下游GCCGGCACTCCTTCTTCTCTTTBcl-2上游TGGCCTTCTTTGAGTTCGGT111下游GATGCCGGTTCAGGTACTCABax上游AGCTGCAGAGGATGATTGCTG178下游CTGATCAGCTCGGGCACTTTAGAPDH上游AGTGCCAGCCTCGTCTCATA389下游GGCGGAGATGATGACCCTTT2.8　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的蛋白表达取出各组大鼠滑膜组织，加入RIPA裂解液、1粒4 mm及2粒3 mm氧化锆研磨珠，匀浆3次，在4 ℃冰箱内静置裂解30 min，4 ℃、12 000 ×g离心15 min后取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对大鼠组织进行蛋白浓度的测定，加入适量的稀释液和上样缓冲液，95 ℃变性3 min，配制12%聚丙烯酰胺凝胶待用，取样品20 μg上样，电泳（80~120 V，2 h），进行350 mA恒流转膜1.5 h，5%脱脂奶粉进行封闭2 h，TBST洗膜3次，加入一抗稀释液稀释Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62、β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶6 000）4 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，加ECL工作液，超灵敏全自动成像分析仪下进行曝光成像。使用Image J软件进行统计分析。2.9　统计学处理实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，用x¯±s表示，用t检验进行两独立样本比较，用单因素方差分析进行多样本均数比较。如果不符合正态性分布，则采用秩和检验（Kruskal-Wallis H检验），P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠一般状况及体质量的影响正常组大鼠毛发呈白色且有光泽，体质量自然增长，活动自如，反应迅速。与正常组比较，AA组大鼠毛发色泽暗淡，饮食减少，大便稀软，身疲倦怠，造模第16~28天出现体质量增长速率显著减慢（P0.01）；与AA组比较，FSR组大鼠毛发干枯发黄，晦暗无光，不思饮食，大便稀溏臭秽，萎靡少动，在造模第16~28天，FSR组大鼠比AA组体质量增长速率显著减慢（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T002表2风湿热痹环境对AA大鼠体质量的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of wind-damp-heat arthralgia on body weight of AA rats （x¯±s，n=10）组别0 d4 d8 d12 d16 d20 d24 d28 d正常组149.50±4.72170.67±5.35189.50±4.23208.17±6.68226.83±5.04248.50±6.69268.00±6.39286.50±5.68AA组153.33±6.56173.67±10.67189.83±6.97201.67±7.39212.17±8.642）213.00±5.552）216.67±5.892）224.67±6.382）FSR组149.67±5.20171.50±7.48187.33±4.32191.33±3.56197.50±9.732，3）194.50±6.752，4）197.17±4.882，4）206.33±3.502，4）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与AA组比较3）P0.05，4）P0.01（表3-表7同）g3.2　对大鼠脾脏指数的影响与正常组（1.74±0.16）比较，FSR组（4.50±0.76）和AA组（3.89±0.33）脾脏指数显著升高（P0.01），提示FSR组和AA组大鼠出现症状后脾脏明显肿大；与AA组比较，FSR组脾脏指数明显升高，脾脏肿大更为严重（P0.05）。3.3　对大鼠足趾肿胀情况的影响正常组大鼠未出现明显足趾肿胀，足踝部关节与足趾皮肤正常，行动自如。与正常组比较，AA组大鼠在造模后第10~12天，足趾轻度充血红肿，足趾皮肤轻度增厚，行动缓慢；FSR组在造模后第8~10天先出现足趾中度充血红肿，后向上蔓延至踝关节，甚至出现因关节畸形和功能障碍导致的跛行或者拖腿现象。28 d后，再次比较AA组、FSR组大鼠足趾情况，FSR组大鼠因足趾重度充血红肿，足踝关节重度畸形出现活动严重受限或者无法活动，而AA组大鼠足趾肿胀程度较FSR组轻。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.F001图1风湿热痹环境对AA大鼠足踝形态学的影响Fig.1Effect of wind-damp-heat arthralgia on ankle morphology of AA rats注：A.正常组；B.AA组；C.FSR组（图2-图4同）3.4　对大鼠AI的影响除正常组外，AA组和FSR组大鼠的AI评分均出现不同程度的升高。与正常组比较，AA组大鼠在第8天出现轻度足部关节红肿，症状逐渐加重，第22~24天AI达到峰值，最高分为8分（P0.01）；FSR组大鼠在造模第8天足爪关节显著红肿，甚至出现脱皮、溃疡和结节，个别大鼠尾部和耳根部出现环状结节。与AA组比较，FSR组大鼠在12~20 d AI增长快于AA组，AI评分高于AA组（P0.05），在第19~20天，FSR组大鼠后足关节炎症状严重，AI达到峰值，最高分为8分（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T003表3风湿热痹环境对AA大鼠AI的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of wind-damp-heat arthralgia on AIin AA rats （x¯±s，n=10）组别0 d4 d8 d12 d16 d20 d24 d28 d正常组0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00AA组0.00±0.000.00±0.000.67±0.021）2.30±0.152）5.50±0.082）6.67±0.112）7.33±0.062）7.33±0.062）FSR组0.00±0.000.00±0.000.83±0.012）3.33±0.042，3）6.55±0.122，3）7.50±0.152，3）7.50±0.152）7.50±0.152）分3.5　对大鼠滑膜组织形态学的影响正常组大鼠滑膜组织结构清晰，层次分明，可见1~2层滑膜被覆细胞整齐排列，滑膜内无充血水肿，无淋巴细胞、浆细胞与巨噬细胞等炎性细胞浸润。AA组滑膜轻度充血水肿，滑膜被覆细胞增生至4~6层，滑膜表面可见少量纤维素样物质沉积，滑膜间质有淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞散在分布，部分新生血管侵入；与AA组比较，FSR组滑膜重度充血水肿，衬里层显著增厚，滑膜被覆细胞增生至8~10层，排列紊乱，滑膜间质有大量纤维细胞增生与炎性细胞密集，新生血管增生侵入滑膜间质，与增生纤维细胞、巨噬细胞形成炎性肉芽组织，提示FSR组大鼠滑膜组织异常增生显著。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.F002图2风湿热痹环境对AA大鼠滑膜组织形态学的影响 （HE，×200）Fig.2Effect of wind-damp-heat arthralgia on synovial histomorphology of AA rats （HE，×200）3.6　对大鼠踝关节病理学形态的影响正常组大鼠踝关节间隙正常，软骨表面光滑完整，与骨组织连接紧密，未见明显滑膜组织增生、血管翳形成、炎性细胞浸润及明显骨质破坏；AA组大鼠踝关节间隙变窄，关节软骨表面不规则增厚，骨质轻度破坏，关节内可见少量炎性细胞，有少量滑膜组织增生；与AA组比较，FSR组大鼠踝关节软骨破坏严重，因大量纤维组织增生侵入关节腔至关节间隙消失，大量血管翳形成，关节内炎症细胞密集。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.F003图3风湿热痹环境对AA大鼠足踝关节的病理学形态的影响（HE，×100）Fig.3Effect of wind-damp-heat arthralgia on ankle joint of AA rats （HE，×100）3.7　对大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响与正常组大鼠比较，AA组和FSR组大鼠血清的TNF-α、IL-1β含量均显著升高（P0.01）；与AA组比较，FSR组血清的TNF-α、IL-1β含量明显升高（P0.05，P0.01），提示FSR组大鼠全身炎症更为严重。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T004表4风湿热痹环境对AA大鼠TNF-α、IL-1β的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of wind-damp-heat arthralgia on TNF-α，IL-1β of AA rats （x¯±s，n=3）组别TNF-αIL-1β正常组21.00±5.35222.67±6.02AA组98.67±20.422）446.67±14.882）FSR组152.33±18.372，4）555.00±16.392，3）3.8　对大鼠滑膜组织TNF-α、IL-1β的mRNA表达的影响与正常组大鼠比较，AA组和FSR组大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β的mRNA的表达水平显著升高（P0.01）；与AA组比较，FSR组大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β的mRNA的表达水平升高（P0.05）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T005表5风湿热痹环境对AA大鼠TNF-α、IL-1β的mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of wind-damp-heat arthralgia on TNF-α，IL-1β in synovial tissues of AA rats （x¯±s，n=3）组别TNF-αIL-1β正常组1.00±0.001.00±0.00AA组1.49±0.172）1.70±0.212）FSR组2.04±0.152，3）2.23±0.232，3）3.9　对大鼠滑膜组织Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的mRNA表达的影响与正常组比较，AA组和FSR组大鼠滑膜组织的Bax、p62的mRNA表达水平显著下降（P0.01），Bcl-2、LC3、Beclin1的mRNA表达水平显著升高（P0.01）；与AA组比较，FSR组大鼠滑膜组织的Bax、p62的mRNA表达水平明显下降（P0.05），Bcl-2、LC3、Beclin1的mRNA表达水平明显升高（P0.05）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T006表6风湿热痹环境对AA大鼠滑膜组织Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of wind-damp-heat arthralgia on mRNA expression of Bcl-2，Bax，LC3，Beclin1，p62 in synovium tissue of AA rats （x¯±s，n=3）组别Bcl-2BaxLC3Beclin1p62AA组1.26±0.062）0.87±0.092）1.26±0.082）1.47±0.082）0.85±0.112）FSR组1.43±0.182，3）0.73±0.172，3）1.49±0.122，3）1.61±0.062，3）0.71±0.042，3）注：设正常组各指标mRNA表达均为13.10　对大鼠滑膜组织 Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的蛋白表达的影响与正常组比较，AA组和FSR组大鼠滑膜组织的Bax、p62蛋白表达显著下降（P0.01），Bcl-2、LC3、Beclin1蛋白表达显著升高（P0.01）；与AA组比较，FSR组大鼠滑膜组织的Bax、p62蛋白表达明显下降（P0.05），Bcl-2、LC3、Beclin1蛋白表达明显升高（P0.05）。见表7、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.T007表7风湿热痹环境对AA大鼠滑膜组织Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 7Effect of wind-damp-heat arthralgia on Bcl-2，Bax，LC3，Beclin1，p62 in synovical cells of AA rats （x¯±s，n=3）组别Bcl-2/β-actinBax/β-actinLC3Ⅱ/LCⅠBeclin1/β-actinp62/β-actin正常组0.97±0.121.21±0.020.85±0.120.97±0.141.02±0.13AA组1.05±0.232）1.14±0.042）0.96±0.232）1.21±0.082）0.93±0.072）FSR组1.23±0.262，3）0.92±0.012，3）1.25±0.262，4）1.35±0.192，3）0.81±0.052，3）10.13422/j.cnki.syfjx.20221941.F004图4风湿热痹环境对AA大鼠滑膜组织Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62的蛋白表达的影响Fig.4Effect of wind-damp-heat arthralgia on Bcl-2，Bax，LC3，Beclin1，p62 in synovium cells of AA rats4 讨论RA病因尚未明确，为更好地了解该病的发病原因与发展机制，构建贴合RA临床病理特点的动物模型是必不可少的。迄今为止已建立了多种RA动物模型，按构建方式可分为诱导型和转基因型两大类，其中RA诱导型动物模型主要包括胶原诱导关节炎（CIA）、AA、链球菌细胞壁（SCW）诱导关节炎、软骨寡聚基质蛋白（COMP）诱导关节炎、降植烷诱导关节炎（PIA）、抗原诱导关节炎（AIA）、蛋白多糖诱导关节炎（PGIA）［14-17］。目前研究RA的动物模型多采用的是CIA诱导或者AA诱导的动物模型。［18-19］。随着中医药的不断发展，具有中医证候特点的疾病动物模型应运而生。病证结合模型以模拟疾病病因病理为基础，给予外界环境干预刺激或者内服药物探讨药性与病证的关系，该动物模型可靠性强、稳定度高，已成为现代医学研究的重要载体。病证结合动物模型的构建多以病理病因复合因素的造模方式为主。病理病因复合因素是指先后或同步施加病因与证因，构建疾病模型的同时利用中医致病因素如外邪、饮食、情志、劳倦等复制证候模型，病证同塑，结合二者各自特点与优势，应用于中医证候与西医病理机制相关性的研究及中药作用机制研究。IL-1β和TNF-α是RA发生过程中极其重要的细胞因子，两者相互作用，促使炎症细胞向滑膜聚集，导致炎症反应持续，同时诱导RA-FLS增殖，促进关节软骨破坏和骨侵蚀，加重RA病情，最后导致不可逆性关节畸形及功能丧失［20-23］。本实验结果表明，与正常组比较，AA组和FSR组大鼠均出现毛发枯槁，色泽暗淡，大便性状改变，体质量增长缓慢，脾脏肿大，足趾关节肿胀明显且关节炎指数升高，HE染色示滑膜组织异常增生显著并伴有炎性细胞弥散以及血管翳的形成，足踝关节内有增生纤维组织充斥，关节间隙消失，关节软骨破坏严重，血清与滑膜组织中IL-1β、TNF-α及滑膜组织中IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平升高，说明AA组和FSR组大鼠出现与RA相关的炎症反应与病理改变，提示在Mtb诱导下成功构建RA动物模型。其中，FSR组大鼠毛发干枯发黄，倦怠乏力，精神颓靡，脾脏显著肿大，足跖红肿严重并向上蔓延至踝关节，出现活动严重受限，滑膜及踝关节病理改变显著，全身炎症指标显著上调，说明FSR组大鼠RA症状更为显著，一定程度上符合风湿热痹“筋骨关节游走性热痛，得热则增，遇寒则减，肌肤麻木不仁，肿胀，喜冷恶热，发红，发热，恶风，强硬不舒”的特点，提示RA风湿热痹模型造模成功。相关研究表明，RA的病情发展与滑膜组织的低凋亡率、高自噬水平有关［24-25］。在IL-1β和TNF-α等炎症因子的刺激，滑膜组织中包括RA-FLS在内的细胞Bax表达下调及Bcl-2表达上调，导致过度增殖的细胞沉积在关节滑膜内，进一步加重炎症反应与骨质破坏［26-27］。自噬作为一种全新的细胞程序化死亡方式，在RA的发生发展中起到重要作用。自噬通过及时清除错误折叠蛋白、受损的细胞器等变性的胞浆成分，维持细胞内环境稳定［28］。目前与自噬相关的重要标志物有LC3、Beclin1、p62。LC3、Beclin1的表达水平与滑膜细胞自噬呈正相关关系，p62与滑膜细胞自噬呈负相关关系［29］。有研究表明，RA疾病活动度与LC3、Beclin1、p62相对表达水平相关。在RA患者的滑膜组织中，RA-FLS通过上调LC3Ⅱ蛋白表达水平显著增强自噬，延长自身的存活时间［30］。RA患者滑膜组织中的LC3和Beclin1的mRNA相对表达水平在治疗后下降，p62表达水平升高［31］。由此推测，细胞凋亡相关基因Bax，Bcl-2与自噬相关基因LC3、Beclin1、p62可作为评价RA疾病活动度的指标。本实验结果显示，与AA组比较，FSR组大鼠滑膜组织的Bax、p62的mRNA和蛋白表达水平显著降低，LC3、Beclin1、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著升高，说明FSR组滑膜细胞凋亡水平显著减低，自噬水平显著增强，提示FSR组大鼠比AA组更贴合RA滑膜异常增殖的情况，用来研究RA更具针对性。综上所述，基于痹证成因中的内外合因，本实验在Mtb诱导的RA动物模型基础上，结合RA风湿热痹的证型特点，建立RA风湿热痹动物模型并从全身炎症指标，滑膜自噬与凋亡的角度评价该模型，达到多方位评价该动物模型的目的。由于RA病症结合动物模型相关研究尚在探索阶段，尚未形成统一的造模标准以及成熟的造模方式［33］。本实验结合“证”对RA临床症状加以考量，同时用科学可靠的临床指标或者基础实验来验证模型是否成功以及是否更具针对性，结果表明，与AA组比较，FSR组不仅病变程度更为严重而且同时具备风湿热痹证型特点，在体现中医辨证论治的基础上更加贴合RA临床症状，为完善RA病证结合动物模型提供更多实验依据，以期揭示“证”的本质，具有一定的参考价值。