糖尿病足溃疡（DFU）是威胁人类健康的重大疾病，全球发病率约6.3%［1］。全球糖尿病人口在2035年将达到6亿人，其中19%~34%的糖尿病患者可能患有DFU［2-3］。糖尿病创面久不愈合可导致严重感染、截肢，甚至危及生命，导致患者生活质量下降，而且占用了大量医疗资源，加重经济负担。糖尿病创面炎症反应启动晚、消退慢，炎症期过长，造成创面愈合延迟，甚至经久不愈［4］。课题组前期证实糖尿病创面C-C基序趋化因子2（CCL2）、嗜酸性粒细胞趋化因子（CCL11）、C-X-C基序趋化因子3（CXCL3）等趋化因子表达上调［5］，白细胞分化抗原36（CD36蛋白）、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）表达异常［6］，驱动、调控巨噬细胞在病变区域长期浸润，并长期表现为促炎表型M1型。糖尿病创面微循环障碍、晚期糖基化终产物累积、氧化损伤、巨噬细胞长期浸润等病理特点产生的多种危险因素，导致NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体过度激活，从而导致创面持续的炎症状态。NLRP3炎症小体位于细胞内，其激活后白细胞介素（IL）-1β和IL-18被释放分泌，提高了机体炎症水平［7-8］。NLRP3炎症小体与炎症性疾病进展密切相关，目前研究发现其在痛风性关节炎、阿尔茨海默病、炎症性肠病、糖尿病、胰岛素抵抗等疾病的病理过程中起着重要作用［9-10］。据报道NLRP3炎症小体有可能也参与了糖尿病创面愈合［11-12］。因此，本文就NLRP3炎症小体与糖尿病创面修复的机制及中医药或有效成分抑制其表达，发挥抗炎效应的研究进展做一综述，以期为难治性创面促愈研究提供新的思路。1 NLRP3炎症小体概述宿主对致病微生物、环境因素、应激或损伤信号的免疫反应依赖于模式识别受体（PRRs），通过细胞外刺激与胞质内受体紧密协调的结合与激活以产生适应性改变［13］。NOD样受体（NLRs）即PRRs中的一种，位于胞浆内，参与机体的先天免疫［14］。NLRP3炎症小体是NLRP3参与形成的蛋白复合物，位于细胞内，在机体正常情况下其激活释放适当数量的IL-1β和IL-18，参与炎症免疫反应，维持细胞稳态。但过度激活机体内的NLRP3炎症小体，可能造成炎症反应进一步扩大以致组织反复损伤［15］。1.1　NLRP3炎症小体结构NLRP3、凋亡相关颗粒样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶-1前体（pro-Caspase-1）这3种蛋白构成了NLRP3炎性小体蛋白复合物［16］。NLRP3炎症小体的组装是通过NLRP3PYD-ASCPYD 和ASCCARD-pro-Caspase-1CARD相互作用完成的。其中，NLRP3PYD是指N端包含吡啶结构域（PYD）的NLRP3蛋白；pro-Caspase-1CARD是指N端包含半胱天冬酶募集结构域（CARD）的半胱氨酸蛋白水解酶前体；而ASC则同时包含了PYD、CARD两个结构域，PYD蛋白结构域位于其N端，Caspase激活和募集的结构域CARD位于其C端［17］。组装完成后pro-Caspase-1转化为Caspase-1，具备了酶活性，IL-1β、IL-18被催化成熟并分泌［18］。1.2　经典的NLRP3炎症小体激活途径启动、组装双重信号刺激是NLRP3炎症小体被激活的经典途径。首先，位于细胞膜上的细胞因子受体，如Toll样受体4（TLR4）、IL-1受体（IL-1R）、肿瘤坏死因子受体（TNFR）、补体受体等接受并识别来自胞外的危险信号，进而影响细胞核转录因子-κB（NF-κB）、干扰素调节因子（IRF1）等，上调pro-IL-1前体、pro-IL-18前体的转录水平，增加核内NLRP3转录；此外，这些启动信号还可诱导NLRP3去泛素化和ASC的泛素化和磷酸化，影响NLRP3炎症小体的翻译后修饰［19］。质膜渗透性变化、溶酶体破裂、代谢应激等刺激下，活化的NLRP3蛋白，及作为接头蛋白的ASC和效应蛋白pro-Caspase-1完成了NLRP3炎症小体组装。此时，活化的Caspase-1控制胞质前细胞因子pro-IL-1、pro-IL-18的成熟与IL-1β、IL-18的分泌［20-21］。1.3　非经典的NLRP3炎症小体激活途径不需要PRRs介导而激活Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5是非典型的炎症小体反应途径［22］。Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5中CARD结构域，可以直接与单磷酰脂质A（MPLA）进行结合，并激活内切割焦磷酸化底物蛋白（GSDMD蛋白）［23］。GSDMD是Gasdermin家族的一员，其释放的N端结构域通过与膜磷酸肌醇结合而转移到质膜上，引发细胞适应性改变，如穿孔、肿胀、渗透等，造成细胞焦亡，产生强烈促炎效应［24］。非典型的炎症小体途径可激活单核细胞中NLRP3炎症小体，这种间接效应是由GSDMD造成的孔膜破裂导致的。另外，宿主衍生的氧化磷脂（oxPAPC）则靶向Caspase-11激活NLRP3炎症小体［24］。2 靶向NLRP3炎症小体是治疗糖尿病创面的新策略生理情况下，NLRP3炎症小体在体内处于动态平衡，一旦失衡则会引发炎症相关性疾病。糖尿病创面的持续的促炎状态可由NLRP3炎症小体介导，具体机制见图1。糖尿病大鼠创面NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达上调，基因水平变化趋势与之相同［25］。比较糖尿病近、远端截肢患者与非糖尿病下肢近端截肢患者，糖尿病截肢患者近、远端创面组织的NLRP3、IL-1β总mRNA均高于非糖尿病者［26］。10.13422/j.cnki.syfjx.20221430.F001图1NLRP3炎症小体参与糖尿病创面炎症反应Fig. 1NLRP3 inflammasome involved in inflammatory response in diabetic wounds注：NETs.中性粒细胞胞外诱捕网；AGEs.晚期糖基化终产物2.1　调控氧化应激，减少NLRP3炎症小体表达促愈氧化应激通过促进止血、炎症反应、血管生成、肉芽组织形成、创面闭合和细胞外基质的发育和成熟，在伤口愈合中发挥重要作用。低浓度的活性氧（ROS）可以对抗微生物入侵，但是ROS过量会导致氧化损伤，这也是慢性伤口愈合时间延长的主要原因［27］。在高糖诱导下，蛋白激酶C（PKC）激活，其下游氧化氮（NOX）的活性也会增加，而NOX是多种细胞中产生ROS的主要来源［28］。另外，高糖影响下线粒体电子传递链破坏、超氧化物产生、糖基化终末产物（AGEs）、多种ROS生成酶上调等，均可造成ROS累积，而且来自线粒体的ROS主要参与NLRP3炎症小体激活过程［29］。因此，使用ROS清除剂或线粒体靶向的抗氧化剂，可以阻止ROS的过度产生，降低NLRP3炎症小体活性，下调促炎因子IL-1β、IL-18等，从而解除糖尿病创面过长的炎症期。有研究表明使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，NLRP3炎症小体和IL-1β转录水平被抑制，同时降低了NLRP3、IL-1β蛋白表达［30］。另外，使用线粒体靶向抗氧化剂（SkQ1），阻止了线粒体ROS的过度产生，同时降低了中性粒细胞含量，增加巨噬细胞含量，加速伤口愈合［31］。综上，ROS与NLRP3炎症小体之间的相互作用关系提示减少氧化损伤及ROS累积，可抑制NLRP3炎症小体激活，从而促进糖尿病创面愈合。2.2　平衡NETs/NLRP3炎症小体轴促愈中性粒细胞参与机体固有免疫，同时也是巨噬细胞的关键刺激因子，是伤口的早期愈合的重要免疫细胞［32］。中性粒细胞在受到脂多糖（LPS）、IL-8等刺激后，释放一种由蛋白质和酶装饰的web样结构的染色质，这种DNA-蛋白质结构即中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）［33］。糖尿病创面中NETs过量产生，导致炎症失调，伤口久不愈合。一项临床实验证实NETs过多触发了NLRP3炎症小体激活，促使巨噬细胞中IL-1分泌增加，这个现象可能与TLR4、Toll样受体9（TLR9）的蛋白识别及NF-κB磷酸化相关，机制与TLR4/TLR9/NF-κB信号通路有关；也可能是活化的中性粒细胞刺激NOX以产生ROS，上调硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）表达，激活了NLRP3炎症小体［34］。反之NLRP3炎症小体持续激活，分泌的IL-1β和IL-18招募了更多的中性粒细胞形成NETs，造成糖尿病创面反复的组织损伤。因此，调控NETs/NLRP3炎症小体轴的平衡，可促进糖尿病创面愈合。有研究表明，中性粒细胞能被外源性乳脂球状表皮生长因子Ⅷ（MFG-E8）消除［35］。敲除MFG-E8的大鼠实验中，CD11b+细胞、中性粒细胞、巨噬细胞数量增加，NETs被强化，促炎因子IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子（TNF）-α表达上调，而抑炎因子IL-10下调。该实验反向验证了NETs形成，NLRP3炎症小体被过度激活，产生了促炎作用，延长糖尿病创面愈合，而MFG-E8可抑制NETs，减少免疫细胞浸润。另外，脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）可水解NETs的DNA支架，减轻糖尿病大鼠模型中NLRP3炎症小体的激活，减轻炎症或免疫条件下的宿主损伤，有望成为促进糖尿病创面愈合的有效刺激剂［36］。2.3　诱导巨噬细胞向M2型极化促愈巨噬细胞具有吞噬细菌，释放炎症细胞因子，进行组织清创及免疫调节的作用。在正常伤口愈合早期第1天到第3天左右促炎M1型占优势，随后向M2型转变，在第7天左右达到峰值［37］。巨噬细胞极化表型转换失调，是正常伤口与糖尿病创面之间的重要区别。糖尿病创面中，巨噬细胞通常为促炎表型M1型且持续表达，造成伤口闭合受损、血管生成不良和胶原沉积减少等。高糖环境下NLRP3炎症小体表达上调，过度分泌的促炎因子IL-1、TNF-α、IL-6、IL-18等促使巨噬细胞在创面中长期浸润［38］，而当M1型巨噬细胞与葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）结合时，又可引起NLRP3炎症小体的激活及下游炎症事件，形成恶性循环，导致创面无法愈合［39］。据报道常规降糖药二甲双胍可以抑制NLRP3炎症小体，促进巨噬细胞由M1向M2极化，加速伤口愈合［40］。其还可以增加创面血管内皮生长因子（VEGF）、IL-10表达，减少IL-1β表达，增加腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化以促进线粒体自噬。另外，Caspase-12通过阻止炎症小体组装，抑制其活性［41］；NLRP3炎症小体抑制剂MCC950可阻断基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活化［42］，而Caspase-12、MMP-9高表达时可促进巨噬细胞极化。文献报道硫酸肝素可能通过上调MMP-9、Caspase-12的mRNA水平，降低NLRP3炎症小体组分ASC mRNA水平，使得巨噬细胞从促炎表型M1型转换为促愈合表型M2型，发挥抗炎作用［43］。2.4　调控AGEs，减少NLRP3炎症小体表达促愈晚期糖基化终末产物（AGEs）是生物体内糖基化过程中形成有机分子，AGEs通过促进氧化应激，诱导NLRP3炎症小体活化，产生促炎反应和炎症介质［44］。据证实去泛素化酶（USP30）可能与糖尿病创面的发生相关，使用USP30抑制剂MF-094可以恢复AGEs引起的人皮肤成纤维细胞（HSF2）的细胞活力下降，恢复细胞迁移能力，促进Ⅰ型胶原（Collagen-Ⅰ）形成，下调基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9。另外，USP30也可能通过去泛素化，实现线粒体质量控制，抑制AGEs引起的NLRP3炎症小体活化［45］。综上，USP30/NLRP3的这种连接表明了MF-094对糖尿病足溃疡有治疗潜力。但也有报道完全与之相反。研究认为AGEs抑制骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中NLRP3炎症小体的激活和组装［46］。目前看来，在糖尿病创面愈合研究领域，调控AGEs以减少NLRP3炎症小体的表达，还需更多有力的实验证据。2.5　促进自噬，降低NLRP3炎症小体表达促愈自噬可以清除微生物，并调节宿主启动先天免疫反应，在感染性病原体的防御系统中起着主要作用［47］。正常大鼠皮肤组织破损后，体内自噬即被启动以促进伤口愈合及组织修复。但高糖环境抑制了自噬小体、自噬溶酶体的形成［48］。经证实高糖条件下内皮祖细胞的自噬水平被抑制，而低水平的自噬介导了NLRP3炎症小体的激活及免疫炎症［49-50］。这个结果提示上调高糖背景下细胞自噬水平以抑制MLRP3炎症小体，可能是治疗难愈性创面的方法之一。雷帕霉素是一种经典的自噬诱导剂，通过介导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白磷酸化修饰，上调微管相关蛋白Ⅱ/Ⅰ（LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ）、重组人自噬效应蛋白（Beclin-1）的表达，降低NLRP3过度激活，调控mTOR/NF-κB通路以减弱高糖诱导的巨噬细胞炎症［51］。另外，人髓系白血病单核细胞（THP-1）衍生的巨噬细胞中自噬同样被抑制，NLRP3炎症小体被过量的ROS触发。而采用自噬诱导剂resveratrol进行干预后，可以抑制这一现象［52］。3 中医药抑制NLRP3炎症小体促进糖尿病创面愈合多味中药及其有效成分作为天然药物，具有多途径抗炎、高生物相容性、促进组织修复等作用，在糖尿病创面愈合治疗中应用广泛。有报道认为抑制NLRP3炎症小体活化，减少其表达是中药及有效成分发挥抗炎作用，促进难治性创面愈合的机制之一。3.1　中药单体3.1.1　白及多糖（BSP）BSP是兰科草本植物白及的多糖成分，现代药理研究认为BSP具有止血、抗炎、抗氧化、调节免疫作用［53-54］。ZHANG等［55］利用定向冷冻技术制备BSP海绵，能够快速止血，加速伤口愈合。实验研究表明BSP能够减少糖尿病大鼠创面中巨噬细胞浸润，下调TNF-α、IL-1β；减少TXNIP、NLRP3蛋白表达，降低pro-Caspase-1及剪切体cleaved Caspase-1、促炎因子前体pro-IL-1β及剪切体cleaved IL-1β的蛋白水平，上调蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化水平；此外，BSP还可以修复高糖激活NLRP3炎症小体后造成的内皮细胞损伤，其机制可能与ROS产生减少有关［56］。3.1.2　芍药苷（PF）PF是是中药白芍中属于单萜苷的有效成分，其在治疗炎症、疼痛、氧化损伤、肝损伤等方面均有应用［57-58］。据报道PF显著抑制了NLPR3和pro-Caspase-1的表达，大幅减少炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α产生；并且发现阻断高糖处理的人永生化角质形成细胞（HaCaT）的C-X-C型趋化因子受体2（CXCR2），可以抑制细胞中NLPR3、ASC的活化［59］。因此认为PF可以阻断CXCR2，抑制NLPR3炎症小体的激活和NF-κB的转录，缓解糖尿病溃疡大鼠的炎症状态。3.1.3　染料木素（Gen）Gen也叫金雀异黄素，是一种天然的异黄酮，广泛存在于淡豆豉、葛根、黑豆、槐角等多味中药中，具有抗肿瘤、抗糖尿病、抑制炎症、调节激素代谢、促进细胞凋亡等作用［60-61］。研究构建了四氧嘧啶诱导+手术的糖尿病溃疡小鼠模型，在正常喂养的饲料中添加不同程度（0.025%、0.1%）的Gen膳食干预2周，观察伤口情况。结果，与正常喂养的小鼠相比，饲料中添加了Gen膳食的糖尿病溃疡小鼠的伤口闭合率从72 h开始显著加快；且皮肤组织中pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白水平显著上调。而且添加了0.025% Gen膳食的小鼠，组织中NLRP3蛋白水平高表达；在伤后24、72 h，添加了0.1% Gen膳食的小鼠，伤口部位NLRP3、ASC蛋白水平显著提高。这个结果表明Gen提高了糖尿病创面早期NLRP3炎症小体的组分蛋白表达，提示了若在创面愈合增殖期、重塑期，使用Gen抑制剂以减少NLRP3炎症小体表达，可能会阻断糖尿病创面过长的炎症期，促进伤口愈合［62］。3.2　中药复方托里消毒散是中医外科治疗疮疡的经典方剂，最早记载于明代陈实功的《外科正宗》，方中透法代表药白芷、皂角刺旨在消肿排脓，现代药理学研究发现其具有抗菌抗炎、调节免疫等作用［63-64］。有研究采用白芷、皂角刺的提取物干预LPS诱导的高糖条件下巨噬细胞，发现IL-1β的蛋白表达、转录水平均明显下降。另外，白芷提取物干预还可下调Caspase-1及pro-Caspase-1，下调TXNIP蛋白水平与转录水平，减少细胞内的ROS蓄积，从而抑制NLRP3炎症小体过度活化；而皂角刺提取物下调pro-Caspase-1，但不影响NLRP3蛋白、ASC蛋白的表达，独立于NLRP3炎症小体途径发挥抗炎作用［65］。此外，糖尿病创面病变涉及高糖影响下的血管病功能障碍、周围神经病变、感染等。中药及有效成分可以直接或间接缓解高糖诱导NLRP3炎症小体过表达造成的病理损伤，间接促进糖尿病创面愈合。如獐牙菜苦苷［66］可以通过抑制NOXs/ROS/NLRP3信号通路，纠正糖尿病神经病变炎性因子失衡；黄芪甲苷［67-68］、抵挡汤［69］抑制NLRP3/IL-1β轴，减缓高糖造成的主动脉内膜增厚及血管炎症；生、熟地黄［70］通过上调p-AMPK/AMPK，调控多脏器能量代谢，发挥抗炎效应；红景天苷［71］、鸢尾素［72］均可缓解AGEs诱导的内皮细胞炎症和氧化应激，改善糖尿病血管功能障碍，其中，红景天苷是通过激活AMPK磷酸化，作用于AMPK/NF-κB/NLRP3信号通路实现的；鸢尾素则是通过抑制ROS/NLRP3炎症小体信号通路实现的。4 小结糖尿病慢性创面的持续感染和高促炎状态与NLRP3炎症小体激活高度相关。NLRP3炎症小体活化，促进Caspase-1及下游IL-1β、IL-18等细胞因子的成熟和释放，引发持续促炎状态，是导致糖尿病创面久不愈合的重要原因。NLRP3炎症小体参与糖尿病创面炎症反应见图1，NLRP3炎性小体已经成为一个有吸引力的治疗靶点，通过调控NLRP3炎症小体及其下游信号调控炎症反应，减少其表达或抑制其活性，有望成为糖尿病创面治疗的新策略。但是中医药调控NLRP3炎症小体，应用于糖尿病创面愈合的研究较少，中医药作用的靶向性及调控机制也需进一步探讨。