大麻Cannabis sativa属桑科大麻属草本植物，一般为雌雄异株，偶有雌雄同株，依靠风媒传粉［1］。大麻是传统的经济作物，被广泛用于药品、食品和纺织等领域［2］。大麻品种繁多，我国现行的大麻分类管理将大麻分为工业大麻和医用大麻。2019年，陈士林团队在此基础上提出了药用大麻的定义［3］，即四氢大麻酚（THC）质量分数0.3%，大麻二酚（CBD）含量高，主要用于提取CBD的大麻。药用大麻定义的提出推动了我国对大麻的开发与应用。药用大麻中含有多种植物天然产物，大麻素是目前已知其中最重要的一类化合物。药用大麻中存在的2个成分（THC和CBD）使得大麻获得广泛关注，THC具有强烈的致幻性及成瘾性，CBD则是药用大麻中的非精神活性成分，不具有成瘾性，能够拮抗THC与受体的联结，有效减缓THC对人体所产生的致幻作用，同时还具有杀菌、抗炎、抗焦虑、抗痉挛等药理作用［4］。2018年6月，美国食品药品监督管理局（FDA）批准Epidiolex口服液上市，其是一种口服的、高纯度CBD提取物液体制剂，在此之前，2016年FDA授予Epidiolex治疗罕见遗传性结节性硬化症（TSC）的孤儿药地位。此外，含CBD口香糖治疗肠易激综合征也已进入临床试验。另外，CBD作为原料被广泛用于食品、化妆品等领域［5］。预计2024年CBD市场规模将达587亿美元。目前全球医用大麻合法化国家55个，娱乐用大麻合法化国家11个，其中乌拉圭和加拿大为大麻全面合法化，工业大麻种植合法化国家31个。我国仅在云南省和黑龙江省实现工业大麻种植加工合法化，随着市场对CBD的需求越来越高，吉林省或将成为第3个种植和加工工业大麻的合法省份。相较于工业大麻，药用大麻CBD含量高很多，更有利于医疗及药物研究，CBD提取分离技术及高CBD含量的药用大麻新品种选育已成为当前研究热点。基于此，本文拟梳理药用大麻的活性成分、CBD分离纯化工艺、产品研发及育种等研究进展，并提出其后续重点研究方向，为药用大麻在国内的开发提供参考。1 药用大麻主要活性成分大麻素是药用大麻植物中所特有的一类次级代谢产物，迄今为止发现的大麻素有至少144种［6］，其中具有药效作用的主要有THC、CBD、四氢大麻酚酸（THCA）、次大麻二酚（CBDV）、大麻萜酚（CBG）等，其生物活性见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220556.T001表1药用大麻主要大麻素的生物活性Table 1Biological activity of cannabinoids in medicinal cannabis成分活性参考文献THC易致幻和成瘾、抗痴呆、缓解焦虑、减低化疗的不良反应、镇痛［6-9］CBD缓解焦虑、抗癫痫病、助睡眠、抗炎、镇痛［10-17］大麻色烯（CBC）抗抑郁、镇痛、抗炎［18-20］THCA抗炎、免疫调节、神经保护和抗肿瘤［21-26］四氢次大麻酚（THCV）抗癫痫、抑制食欲［27-30］CBG治疗青光眼、抗炎、降血压［31-34］大麻萜酚酸（CBGA）降血糖、抗炎、抗癌、神经保护［35-38］大麻二酚酸（CBDA）抗炎、治疗呕吐和恶心、缓解疼痛［39-42］CBDV治疗癫痫、自闭症谱系障碍、恶心［43-47］大麻酚（CBN）止咳、镇痛、抗氧化［48-50］反式四氢大麻酚（THCP）催眠、镇痛、降低直肠温度等［51］反式大麻二酚（CBDP）增加活性氧生成、降低癌细胞活力、助眠［51-52］THC具有致幻及成瘾的特点，只能在国家法规管控下应用于医学方面，个人及企业不得使用［6］。CBD由于无精神活性且能抑制上瘾，近年来已成为研究热点。基于CBD开发的Epidiolex获得FDA批准，用于治疗2岁及以上患者的Lennox-Gastaut综合征或Dravet综合征相关的癫痫发作［10］。同时，GW Pharmaceuticals公司基于CBD和THC还开发了一种用于减缓多发性硬化症疼痛的处方药Sativex®［18］。CBC是大麻中含量第三高的大麻素，具有抗炎、抗抑郁、镇痛等作用［18-20］，也受到了广泛关注。THCA是THC的酸性前体，具有抗炎、免疫调节、神经保护和抗肿瘤特性［21-26］。而THCV与THC的化学结构类似，具有精神活性，能够与人体内的大麻素1型受体（CB1）和大麻素2型受体（CB2）相互作用，在低剂量时，THCV是CB1的拮抗剂；而在较高剂量下，THCV则是CB1的激动剂，能使精神作用变得更加明显［24］。同CBD一样，CBG也是一种不具有精神活性的大麻素，西弗吉尼亚大学健康科学中心曾在摩根敦北部进行了一项研究，证明CBG具有治疗青光眼的效果［31］。此外，CBGA被称为“大麻素之母”，是THC、CBD、CBC等生物合成前体物质，还具有降血糖、抗炎、抗癌等生物活性［35-38］。羧酸类大麻素是大麻素的前体，但由于羧酸不稳定，易受热分解，进行脱羧反应，从而转化为大麻素类物质。CBDA是一种大麻素酸，由CBGA反应产生，其结构不稳定，在常温下易脱羧生成CBD，同时具有不可忽视的药用价值，如CBDA能够抑制环氧合酶-2（COX-2）的活性，从而缓解炎症和疼痛［39］；此外，有研究表明CBDA可与CBD、THC等其他大麻素一起，减少癌症患者因化疗引起的呕吐和恶心［40］。CBDV与CBD结构类似，有研究证实CBDV对癫痫和自闭症障碍具有治疗潜力［43］。CBN由THC分解而来，在新鲜大麻植物中并不存在。与CBD、CBG一样，CBN不具有精神活性，但具有抗氧化、止咳、镇痛等作用，这些生物活性也使其越来越受到关注［48］。2019年，科研人员从大麻中发现2种新的大麻素，分别命名为THCP和CBDP，其中THCP缓解疼痛的效果是THC的30倍左右，CBDP与CBD功效相似，具有放松和助眠等作用［51］。除大麻素外，药用大麻还含有多种萜烯类化合物［53］。近期研究表明大麻素和萜烯之间存在着协同作用［54］，二者结合使用比单独使用时减缓疼痛的效果更好。除大麻素和萜烯外，药用大麻还富含黄酮类、生物碱类等活性成分。例如，哈佛大学丹娜法伯癌症研究所研究发现大麻黄酮FBL-03G可以对抗胰腺癌［55］，表明药用大麻中具有医疗作用的物质不只是大麻素，为药用大麻的开发与利用提供了新见解。大麻中大麻素的生物合成途径已研究清晰，见图1。乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过一系列脱羧聚合生成戊基二羟基苯酸，其在异戊烯转移酶的催化下生成CBGA，随后在CBDA合成酶、THCA合成酶、大麻色烯酸（CBCA）合成酶的作用下分别转化为CBDA、THCA和CBCA，最后，光能或热能将这些成分脱羧（活化）生成THC、CBD和CBC等［56］。美国加州大学伯克利分校的研究人员基于大麻转录组信息筛选到香叶基转移酶CsPT4这一关键蛋白，CsPT4可催化香叶基焦磷酸（GPP）和橄榄酸生成大麻素合成前体物质CBGA［57］。将CsPT4与CBD合酶或THC合酶整合至酵母细胞后，可实现THC、CBD等大麻素的酵母从头合成，此项研究打破了大麻素植物提取单一来源的局面，为大麻素的合成提供了新方式。10.13422/j.cnki.syfjx.20220556.F001图1大麻素的生物合成途径Fig. 1Biosynthetic pathway of cannabinoids2 CBD分离纯化技术由于CBD突出的功效，使得以其为原料的产品被广泛开发，从大麻中提取分离是CBD的主要来源，但因THC的致幻特性及政策限制，在分离制备高纯度CBD同时降低其中THC的含量至安全线以下，对CBD分离纯化技术提出了新挑战。目前，工业上提取药用大麻花和叶中CBD的方法主要有有机溶剂浸提法和超临界萃取法等，文献及专利报道的CBD分离纯化方法主要包括分子蒸馏法、树脂吸附法和色谱分离法等，详见增强出版附加材料［58-70］。例如，朱成业等［58］使用超临界CO2萃取法提取药用大麻花和叶中的CBD，再利用分子蒸馏法富集萃取后的CBD，最后使用色谱分离CBD，该方法提纯后的CBD纯度99%。赵平岭［59］结合细胞生物学方法，采用细胞壁分解酶（纤维酶与果胶酶混合液）对粉碎后的大麻叶浸提、萃取，然后取上清液旋转蒸发得到油状物，通过活性炭脱色后再次旋转蒸发，加入三氯甲烷过滤，得到成品，该方法处理后的CBD纯度可达98%左右。张树权等［61］采取一种新的超临界提取方法，利用氩气作为超临界流体萃取干燥后的药用大麻花和叶，随后进行分子蒸馏，再通过色谱柱分离纯化，该方法所得CBD纯度可达95%~99.8%。综上分析，现有CBD提取分离方法虽能够得到高纯度的CBD，但提取分离过程复杂且对设备要求较高，致使提取分离成本高、工业化放大生产难、市场竞争力弱，因此，寻求和开发简单实用、易工业化生产、生产成本低的CBD提取分离技术将会受到越来越多的关注。3 大麻素类相关产品的开发与应用大麻具有悠久的药用历史，随着对THC及CBD为代表的大麻素类功效成分研究的不断深入，大麻素在抗癌、抗炎及抑制精神疾病等方面展现了巨大的医疗潜力，应用领域也随之不断扩展，在医疗保健、美容护肤、运动健身、食品饮料等均有应用，详细信息见表2［2，10-17，71-74］。除了在医疗保健方面，在美容护肤方面，CBD具有改善皮肤炎症、缓解疼痛、抗氧化、抗衰老及舒缓滋润皮肤等功效，使得CBD护肤品快速发展［75］。2018年12月，Neiman Marcus在旗下门店的美妆区域上架了8个含CBD的产品，包括Sagely Naturals、Cannuka、Ildi Pekar等；在丝芙兰官网上线的High Beauty、Lord Jones等品牌也都推出了含有CBD的护肤品。Prohibition Partners公司通过分析得出，2018年全球含CBD护肤品的市场价值达到了7.1亿美元，同时预测在2024年这个数字将达到9.59亿美元，且含CBD护肤品的市场份额可能达到全球护肤品的10%左右。2018年美国CBD消费品的零售额估计在6~20亿美元，2019年Cowen的1份数据分析显示，近7%的美国人已经在使用CBD产品，推测2025年CBD市场或达160亿美元。目前我国尚不允许生产含有CBD的化妆品，也不允许通过进口方式将国外含有CBD的化妆品引入国内市场。未来到底CBD产品能否在国内进行生产、销售并被市场接受，还需要国家相关政策的批准及市场的验证。10.13422/j.cnki.syfjx.20220556.T002表2THC和CBD的应用及代表产品Table 2Representative products of THC and CBD成分应用领域产品名称产品功效参考文献THC医疗保健Bediol®、Bedrocan®、Bedrobinol®、Marinol®、Cesamet®（Nabilone）抵抗癌症，缓解恶心［71-73］CBD医疗保健Epidiolex®、Sativex®、CBD油、CBD胶囊治疗多发性硬化症（MS）引起的痉挛，抗炎，缓解焦虑等［10-17］食品饮料CBD软糖、CBD饼干、CBD苏打水、CBD啤酒等舒缓安神［2，74］美容护肤洁面乳、护肤霜、面膜等舒缓滋润皮肤、改善皮肤炎症［2，74］此外，HUSAIN等［76］研究发现，种植在重金属污染矿区的工业大麻中CBD总量高于种植在商业种植土壤的，而THC总量却正好相反，并且土壤中的重金属含量较种植前略有降低，提示工业大麻可能作为一种土壤修复作物来种植。药用大麻与工业大麻的THC质量分数均0.3%，但药用大麻中CBD含量远高于工业大麻，推测将药用大麻种植在重金属污染矿区会比种植工业大麻更有价值。总之，随着对药用大麻中大麻素及其他活性成分研究的深入，药用大麻逐渐展现出了越来越多的价值。4 现代药用大麻的育种方法大麻是重要的经济作物，但由于THC的存在，大多数国家已对大麻的种植采取了限种、禁种的措施。药用大麻的提出，明确了其与工业大麻的区别，确定了药用大麻的各项指标，在一定程度上推动和加快了药用大麻产业的发展。基于药用大麻中多种大麻素如CBD、CBDV等的显著药用价值，培育高含量CBD药用大麻新品种成为大麻的研究热点。现有的育种方法主要有3种——基于作物自然选择的系统选育法、基于优良性状组合的杂交育种和基于过程调控的诱变育种。随着现代分子生物学的快速发展，有研究人员使用基因编辑技术定向改造大麻性状，促使产生了更多依靠无性繁殖技术的优良大麻新品种。依据现有育种方法和技术，国内外已选育了多种不同特征和性状的大麻品种，详见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20220556.T003表3国内外大麻品种及其特性Table 3Cannabis cultivars and their characteristics at home and abroad品种质量分数/%来源概述参考文献CBDTHCHarlequin156杂交育种由哥伦比亚、泰国、瑞士和尼泊尔等地大麻品种杂交［77］Sour Tsunami10~116~10杂交育种由Sour Diesel、New York Sour Diesel两品种杂交［77］CBD Critical Cure115杂交育种CBD-THC（2∶1）［77］Harle-Tsu--杂交育种Sour Tsunami与Harlequin杂交之后的品种，通常产生的CBD含量是THC含量的20倍［77］CBD Mango Haze---CBD-THC（2∶1）［77］ACDC16.5~190.6杂交育种超高的CBD含量［77］Stephen Hawking Kush5~20-杂交育种Harle-Tsu和Sin City Kush的杂交品种［77］Cannatonic6~176杂交育种该杂交品种遗传不稳定［77］Sweet&Sour Widow--杂交育种CBD-THC（1∶1），大麻素质量分数5%~10%［77］Charlotte′s Web17约0.3-较低THC含量与较高CBD含量［77］Canna-Tsu1010系统选育CBD与THC含量近乎相等［77］Pennywise--杂交育种Harlequin和Ripper的杂交品种，大麻素质量分数处于12%~15%［77］Blue Dragon Desert Frost170.6-较高的CBD含量［77］Valentine X--杂交育种CBD-THC（25∶1）［77］CBD Critical Mass--杂交育种CBD与THC的比例1∶1至约2∶1［77］Corazón22.52.7杂交育种ACDC与Charlotte′s Web的杂交品种，较高的CBD含量［77］格列西亚--杂交育种纤用型工业大麻［78］龙大麻5号1.120.092杂交、甲基磺酸乙酯（EMS）诱变、系统选育雌雄异株，药用型工业大麻品种。CBD含量高，抗倒伏、抗病变、抗旱能力强［79］汉麻2~4号0~1.2080.001 7~0.129 7杂交育种、系统选育雌雄异株，耐盐碱、抗病变、抗倒伏能力强［80］汾麻3号-0.26系统选育雌雄异株，籽用型品种［81］云麻1~8号0~1.330.18系统选育、杂交育种雌雄异株，多为籽用和药用品种［82］皖大麻1~2号--系统选育雌雄异株，纤用型工业大麻［83-84］4.1　系统选育方法系统育种是基于作物自然选择变异，从中挑选具有优良性状的植株，从而培育出作物新品种的方法。Canna-Tsu大麻品种经杂交育种后进行系统选育，其CBD质量分数可达10%［77］。在我国，云南省农业科学院在2018年采用系统选育法，从云南当地大麻品种中选育出纤维、籽、药多用型大麻品种“云麻8号”，该品种籽粒亩产102.0 kg（1亩≈666.67 m2）、纤维亩产122.1 kg、CBD亩产1.37 kg，CBD平均质量分数1.33%，THC质量分数0.07%［85］。2019年黑龙江科学院大庆分院以品种Dnieper为亲本，利用系统选育方法，经田间和温室连续选择育成高纤低毒早熟品种“龙麻2号”［86］。同时，山西省农业科学院经济作物研究所从山西阳曲大麻中经过系统选育出雌雄异族籽用型工业大麻品种“汾麻3号”［81］。系统育种具有优中选优、简便快速的优点，但其具有一定的局限性，子代只能依靠自然变异，不能定向进行改造，个别植株性状能够改进而群体性状难以稳定进化。4.2　杂交育种方法杂交育种是将2种或多种具有优良性状的作物通过杂交，使母本与父本的基因自然组合，从而形成各种不同的类型，再经过选择和培育，获得比亲本性状更优良的新品种。国外研究人员用ACDC与Harle-Tsu品种进行杂交［77］，再经过选育，研发出了具有极高CBD质量分数（24%）和低THC质量分数（1%）的新品种Ringo′s Gift。而Stephen Hawking Kush是Harle-Tsu和Sin City Kush的杂交品种，杂交后经过选育，其CBD质量分数可高达20%。在我国国内，黑龙江省农业科学院经济作物研究所在2019年以“波引1号”为母本、长白山野生资源品种为父本进行杂交，通过EMS诱变，经系统选育和抗性等相关性状鉴定，选育出药用型工业大麻品种“龙大麻5号”，该品种雌雄异株，花和叶中CBD质量分数1.12%、THC质量分数0.092%，同时该品种具有抗倒伏、抗盐碱、耐瘠薄、抗旱、抗病能力强的优良性状［79］。杂交育种可定向培养需要的品种，操作简单可控，但其生产周期长，作物很难产生新性状且需及时发现具有优良性状的作物。4.3　基于过程调控手段进行诱变育种大麻属于异花授粉作物，遗传不稳定，通过常规的系统选育和杂交选育可以选择出具有优良性状的品种，但具有生产周期长、效率偏低、需要持续选择等缺点。诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合要求的单株，进而培育成新的品种或种质。采用过程调控手段的诱变育种能在短时间内有效提高变异频率，加速育种过程，可较大幅度地改良某种性状，同时变异范围广。张际庆等［82］通过物理、化学、射线等措施，诱发大麻植株基因突变，从变异群体中选择具有高CBD含量的植株，并发现CBD含量高的药用大麻具有植株矮小、分枝多、花朵硕大、腺毛密集等特点。张军等［87］为了解决高CBD含量大麻品种发芽率低的问题，通过蒸馏水浸泡大麻种子，黑暗潮湿室温下催芽，提高了种子活性，出芽率可达95%左右，出芽后采用配制的营养土播种，弱酸性水浇灌培育，使植株出芽整齐，出土率达92%。陈璇等［88］根据CBD由雌性植株产生这一突破点，采用硫代硫酸银（STS）溶液对雌性植株主茎及侧枝的顶梢进行2次喷雾处理，诱导雌株上产生雄性花蕾，将雌株转换成雌雄同株，自由授粉后结籽即为纯雌性的工业大麻种子，从而加大CBD的产量。后来张卫［89］发明了1种获得高含量CBD植株的方法，即当大麻植株初长时，在植株茎尖上包裹EMS棉团进行诱变反应，然后取插穗进行扦插，待插穗生根后移栽，从中筛选出CBD含量高的突变植株，此方法比杂交育种或物理诱变育种方法简单，育种周期短，可快速获得高CBD含量的工业大麻植株。随着现代分子生物学的发展，分子标记技术、基因编辑技术等也被用来辅助育种，这不仅显著提高了目标性状获得的概率，也大大缩短了育种周期［90］。例如，2020年日本政府批准销售基因编辑番茄，药用大麻虽不同于番茄等其他大宗粮食作物，但相信基因编辑药用大麻未来肯定会实现高含量CBD的植株进化。5 展望近年来随着CBD的各种用途被发掘出来，药用大麻种植范围越来越大。但当前国内大麻产业仅云南和黑龙江允许合法种植，政府对于大麻产业处于严格监督管理的形势，种植、育种、加工和应用研究等各环节都受到严格的监管，甚至在种子进口方面，农业部都有严格的管理规范。随着药用大麻定义的提出，建议因地制宜地采取相应措施来鼓励和促进药用大麻的发展，打破目前药用大麻市场不合理的局面。由于我国药用大麻的发展还处于起步阶段，在药用大麻和大麻素的开发应用、药用大麻新品种育种等方面都尚处于起步或跟跑阶段，存在的问题主要有4个方面：①对大麻素合成及调控的基础研究不够，对关键基因的发现及合成路线中限速步骤的优化尚需深入研究；②高含量CBD大麻品种缺位，我国是种植大麻面积最大的国家，但目前国内尚无CBD质量分数10%且THC质量分数0.3%的大麻品种；③对CBD及其他大麻素药效学研究欠缺，大麻在我国生长历史悠久，但其药用价值的研究却推进缓慢，在医疗领域的应用大多还停留在镇定止痛方面；④植物提取效率低、工业化生产不易，CBD的水溶性较差，导致CBD在大麻叶提取物中的含量非常有限，缺乏合成生物学等新技术在CBD原料合成上的研究。为了解决以上问题，未来药用大麻应进行深度研究，重点从以下方向进行布局，应用新技术推动药用大麻产业在国内发展。5.1　利用空间代谢组学及比较转录组学挖掘提高CBD合成辅助基因空间代谢组学是确定代谢产物空间分布和解释CBD合成复杂性的可视化策略，而转录组学可从分子水平上阐释大麻合成CBD的转录水平，两者相互结合，可分析得到可能影响CBD合成过程中的辅助基因，从而通过过表达或弱化相关基因得到高产CBD的大麻植株［91-92］。5.2　通过分子技术助力高CBD含量大麻育种由于分子技术的不断发展，分子育种手段不断更新，分子标记辅助育种是利用分子标记与目标性状基因串联的特点，通过检测简单重复序列（SSR），发现目的基因的存在，达到定向选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰等优点。另外，可通过CRISPR/Cas9系统定向编辑植物基因，通过敲除旁路途径基因和沉默不良性状，实现人工定向改造，从而极大地加速定向分子育种。5.3　绿色CBD提取工艺开发和大麻素活性成分新药开发当前分离纯化CBD的技术工艺较繁杂，应继续优化CBD提取工艺，探索分离步骤简单、产物纯度高且成本低的工艺，同时应注意提取溶剂的无害化和绿色化。此外，由于国内关于CBD药物研制尚处于起步阶段，需进一步加强CBD的新适应证开发，并开展对CBG、CBC等其他大麻素成分的药效学研究，以期在大麻素新药开发上能够获得突破。5.4　基于合成生物学与无细胞体系高产CBD当今合成生物学与无细胞体系合成植物来源有效成分如青蒿素等取得巨大进展，将目标化合物相关基因合成通路导入底盘细胞，再经高密度发酵即可获得较高的产量，具有时间短（通常发酵时间为7 d）、成本相对较低、过程对环境友好的优点，克服了植物提取法中原材料依赖土地种植和植物生长时间长的缺点，建议重点布局合成生物学和无细胞催化合成CBD原料的研究方向，为CBD原料提供新来源。高CBD药用大麻育种选育是打破国际种质封锁的战略步骤，借助前沿技术加速高CBD品种选育有助于提升我国在国际大麻领域权重。长期来看，以大麻素为原料的新药研发是产业链的制高点，我国目前还处于工业大麻种植阶段，药用大麻研发还处于空白时期，而国外已借助CBD在医药领域的长期耕耘进入收获期。