粉红粘帚菌Clonostachys rosea隶属于半知菌亚门丝孢纲，是一类分布广泛的丝状真菌［1］。作为植物内生真菌，其可以生存在健康植物体内而不引起植物明显感染症状［2］。粉红粘帚菌是很多植物病原真菌的克星，可通过产生细胞壁降解酶来抑制番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的侵染［3-4］，抑制禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum等多种植物病原真菌的生长［5-6］，对病原线虫也有一定的防治效果［7］，显示出了良好的生物防治潜力。此外，粉红粘帚菌有促进植物生长的作用，对提高药用植物的质量和产量具有重要意义，例如，杨涛等［8］发现其能在提高重茬当归品质的同时不影响其产量。因此，本研究聚焦内生真菌与甘草共生并可促进其幼苗生长的特点［9-12］。对于非自然共生的甘草植株，通常采用人为内生真菌定殖的方法，如浸根法［13］、喷雾法［14］、涂抹法［15］、注射法［16］等，但这些方法存在孢子需求量大、操作繁琐、污染性强等问题，故本研究基于浸种法［17］对粉红粘帚菌-甘草共生体系的构建方法进行优化，以确定更加合理、高效的定殖方法。为验证定殖结果，可将携带标记基因的粉红粘帚菌转化子定殖到植物体内，利用标记基因的表达，有效检测转化子的定殖情况。根癌农杆菌介导的遗传转化（ATMT）是获得真菌突变体的方法之一［18］。其原理是使用乙酰丁香酮（AS）等植物酚类物质吸引根癌农杆菌，诱导其经创口感染进入宿主细胞，之后致瘤质粒（Ti质粒）上的毒性区（Vir区）能与转移DNA（T-DNA）边界上高度保守的碱基序列发生特异性结合，将农杆菌的T-DNA转移至宿主细胞，完成转基因过程，得到表达外源基因的真菌［19］。因其具有操作简便、转化效率高、转化子稳定和插入位点无序列特异性等优点，已被广泛用于包括丝状真菌在内的60多种真菌的遗传操作［20］，但目前包括粉红粘帚菌在内的大多数甘草内生真菌的ATMT研究尚未见报道。本课题组前期从乌拉尔甘草中分离获得1株甘草内生真菌粉红粘帚菌［21］，基于此，本研究对粉红粘帚菌ATMT转化条件和转化子定殖甘草条件进行优化，以期为生物菌肥的开发及优质甘草的育种奠定基础。1 材料Veriti 96型梯度聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司），SW-CJ-1D型洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司），HZQ-F100型立式恒温振荡培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司），1-14型台式小型离心机（德国Sigma公司），GelDoc2000型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），JY-SP3型水平电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），MM400型冷冻混合球磨仪（德国Retsch公司），Research Plus型单道可调量程移液器（德国Eppendorf公司），LS-B35型立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司），BX51型生物显微镜（日本Olympus公司）。甘草种子购自国药种业有限公司，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的种子。转化对象为乌拉尔甘草内生真菌粉红粘帚菌菌株，保存于北京中医药大学中药学院中药资源与鉴定系实验室。转化用农杆菌为GV3101（上海唯地生物技术有限公司，批号AC1001），质粒pCAMBIA1303-TrpC-Hyg-gpdA-GUS-GFP（武汉淼灵生物科技有限公司，见图1，其中TrpC为真菌表达常用的启动子，与色氨酸合成相关；gpdA亦为真菌常用启动子，与甘油三磷酸脱氢酶合成相关；Hyg为潮霉素抗性基因；GFP为绿色荧光蛋白基因；GUS为β-葡萄糖苷酸酶基因）。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.F001图1pCAMBIA1303-TrpC-Hyg-gpdA-GUS-GFP的质粒谱Fig. 1Profile of pCAMBIA1303-TrpC-Hyg-gpdA-GUS-GFPGUS染色试剂盒（北京酷来搏科技有限公司，批号SL7160），真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号D2300），AS、利福平（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为S30264、B25308），潮霉素B、卡那霉素（北京兰博利德商贸有限公司，批号分别为K5472、K1010），DL2000 DNA Marker［宝日医生物技术（北京）有限公司，批号3427Q］，诱导培养基（IM）［取KH2PO4 1.45 g、K2HPO4 2.05 g、NaCl 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、CaCl2 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.002 5 g、（NH4）2SO4 0.50 g、无水葡萄糖1.8 g、甘油5 mL，依次充分溶解在水中，终体积1 L，现配现用，用1 mol·L-1 HCl调节pH至5.2］、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（取马铃薯200 g，去皮水煮30 min，取过滤液，另取葡萄糖20 g、琼脂粉18 g，加去离子水定容至1 L）、LB固体培养基（取酿酒酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂粉18 g，加去离子水定容至1 L）、LB液体培养基（取酿酒酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加去离子水定容至1 L）均为实验室自制，2×EasyTaq® PCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技术股份有限公司，批号AS111-11）。2 方法与结果2.1　潮霉素敏感性的检测在含不同质量浓度（10、30、60、90、120、150、180 mg·L-1）潮霉素的PDA培养基平板上接种粉红粘帚菌，于温度28 ℃连续培养7 d，观察并记录平板上菌株的生长情况，各组均设置3次生物学重复。结果显示，当潮霉素的质量浓度为0 mg·L-1时，培养7 d后粉红粘帚菌菌落已覆盖整个培养皿，而当潮霉素的质量浓度≥30 mg·L-1时，培养7 d后培养皿上则观察不到菌落，具体情况见图2。说明该菌株对潮霉素敏感，后续可选用含质量浓度≥30 mg·L-1潮霉素的PDA培养基筛选该菌株转化子。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.F002图2粉红粘帚菌的潮霉素敏感度测试Fig. 2Hygromycin sensitivity test of C. rosea2.2　ATMT转化条件优化将携带质粒的GV3101接种到LB固体培养基平板上（含50 mg·L-1利福平和100 mg·L-1卡那霉素），于28 ℃培养至产生菌落，挑取单菌落接种至LB液体培养基（含50 mg·L-1利福平和100 mg·L-1卡那霉素）中，28 ℃、150 r·min-1振荡培养（约48 h），于5 000 r·min-1离心5 min（离心半径15 cm），收集菌体，用新配制的IM（AS浓度200 µmol·L-1）稀释至于600 nm处吸光度A600 nm为0.3，继续振荡培养至A600 nm约0.6。与此同时，利用IM（AS浓度200 µmol·L-1）将孢子从PDA平板上冲洗下来，使用IM将孢子稀释至1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1，28 ℃预萌发6 h左右。将农杆菌和孢子等体积混匀，吸取150 µL涂布到表面铺有无菌玻璃纸的IM固体培养基上（AS浓度为50、100、150、200 µmol·L-1），待水分吸干后，将平板置于28 ℃培养箱中，共培养侵染一定时间（36、48、60、72 h）后，将玻璃纸转移到PDA固体培养基上（含250 mg·L-1头孢霉素、200 mg·L-1潮霉素），继续培养3~7 d，将可能的转化子在培养基上连续传代 5 次来验证转化子的稳定性。各组均设3次生物学重复。2.2.1　孢子液浓度对ATMT转化的影响孢子液浓度为1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1时，转化子数量分别为2、4、15、13 个，见表1。对获得的转化子数量进行单因素方差分析和组内多重比较分析，各组数据差异均具有统计学意义（P0.05，P0.01），见表2和表3。结果发现受体菌分生孢子液浓度在设定条件下均能筛选得到转化子，其中1×107 cfu·mL-1时转化效率达到最高，之后随着受体菌孢子液浓度的增大，转化效率降低。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.T001表1不同因素对ATMT转化效率的影响Table 1Effect of different factors on transformation of ATMT因素数值转化子数量/个标准差标准误孢子浓度/cfu·mL-11×10521.0000.5771×10640.5770.3331×107151.0000.5771×108131.0000.577AS浓度/μmol·L-150422.5171.453100563.0551.764150613.0001.732200483.0551.764反应时间/h3671.0000.57748754.7262.728601354.7262.728721244.0412.33310.13422/j.cnki.syfjx.20220748.T002表2不同处理下转化子数的LSD多重比较Table 2LSD multiple comparisons of transformant number under different treatments因素条件比较平均值差值/个标准误差P95%置信区间上限下限孢子浓度/cfu·mL-11×105与1×106-20.7450.007-4.39-0.951×105与1×107-130.7450.000-14.72-11.281×105与1×108-110.7450.000-12.72-9.281×106与1×107-100.7450.000-12.05-8.611×106与1×108-80.7450.000-10.05-6.611×107与1×10820.7450.0280.283.72AS浓度/μmol·L-150与100-142.3800.000-19.49-8.5150与150-182.3800.000-24.16-13.1850与200-62.3800.029-11.82-0.84100与150-42.3800.086-10.160.82100与20072.3800.0122.1813.16150与200122.3800.0016.8417.82反应时间/h36与48-683.2150.000-75.75-60.9236与60-1283.2150.000-135.75-120.9236与72-1173.2150.000-124.75-109.9248与60-603.2150.000-67.41-52.5948与72-493.2150.000-56.41-41.5960与72113.2150.0093.5918.4110.13422/j.cnki.syfjx.20220748.T003表3转化子数的方差分析Table 3ANOVA of number of transformants因素项目SSfMSFP孢子浓度组间358.0003119.333143.2000.000组内6.66780.833总计364.66711AS浓度组间612.9173204.30624.0360.000组内68.00088.500总计680.91711反应时间组间358.0003119.333143.2000.000组内6.66780.833总计364.667112.2.2　AS浓度对ATMT转化的影响AS浓度为50、100、150、200 µmol·L-1时，转化子数量分别为42、56、61、48 个，详细数据见表1。对获得的转化子数量进行单因素方差分析和组内多重比较分析，其中100 µmol·L-1和150 µmol·L-1两组间差异不具有统计学意义，其余各组差异则具有统计学意义（P0.05，P0.01），见表2和表3。结果发现AS浓度在50~150 µmol·L-1时，转化效率随AS 浓度增加而提高，之后随着AS浓度的增加，转化效率反而降低。2.2.3　共培养时间对ATMT转化的影响共培养时间为36、48、60、72 h时，转化子数量分别为7、75、135、124 个，见表1。对获得的转化子数量进行单因素方差分析和组内多重比较分析，各组数据的差异均具有统计学意义（P0.01），见表2和表3。结果发现共培养时间在36~72 h时，随着共培养时间的延长转化效率呈先上升后下降的趋势；当共培养时间为60 h时，转化效率最高。2.3　转化子PCR验证随机挑选10个转化子，将转化子在筛选培养基上连续传代5次，提取初代和第6代基因组。以野生粉红粘帚菌的基因组DNA为阴性对照，质粒DNA为阳性对照，通过扩增GFP基因片段对转化子进行PCR验证，引物为GFPF：5′-CTTTTCACTGGAGTTGTCCCAA-3′，GFPR：5′-TTCGAAAGGGCAGATTGTGTG-3′。扩增体系为DNA模板1 µL（40~400 ng），正、反引物各1 µL（0.2 µmol·L-1），2×EasyTaq® PCR SuperMix（+dye）15 µL，加双蒸水（ddH2O）补至30 µL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（30个循环）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存；用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。结果表明 10 个转化子均带有标记基因（长度608 bp）且插入基因可稳定遗传。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.F003图3随机挑选的10个转化子中GFP片段扩增后电泳分析Fig. 3Gel electrophoresis of GFP gene partial fragments cloned from randomly picked 10 transformants注：A.初代转化子；B.第6代转化子；M.DL2000 DNA Marker；W.野生型粉红粘帚菌的PCR产物；P.以质粒为模板的PCR产物；1~10.10个转化子的PCR产物2.4　转化子GUS染色挑取少量转化子菌丝置于GUS染色液（按试剂盒说明书配制）中，水浴30 ℃反应8~24 h，显色反应见图4。结果发现转化子菌丝团块均可被染成蓝色，野生型则未显色。同时，利用显微镜对菌丝的GUS染色进行观察，见图5，结果表明转化子经染色后菌丝团块和显微结构均呈现野生型菌株没有的蓝色。证明转化子中外源GUS基因的成功插入和表达。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.F004图410个转化子和野生型菌株的菌丝团块GUS染色Fig. 4GUS staining of mycelial clumps of 10 transformants and wild type strains注：W.野生型粉红粘帚菌；1~10.10个转化子（图5同）10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.F005图5粉红粘帚菌及其转化子菌丝的显微观察（GUS，×400）Fig. 5Microscopic observation of C. rosea and its transformant hyphae （GUS，×400）2.5　浸种法定殖粉红粘帚菌方法的优化选择颗粒饱满的乌拉尔甘草种子进行浸种定殖，置于人工气候培养箱中育苗培养，设置温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间16 h·d-1。有研究表明，甘草种子在10 ℃以上能够逐渐萌发，在20~30 ℃情况下发芽势和发芽率较高，萌发时滞短，种苗状态较好；过高的温度（35 ℃）则会抑制甘草种子的萌发，因此将共培养温度梯度设置在16~30 ℃［22］。另有研究表明，打破休眠后的甘草种子发芽时间约4 d，胚轴长约3.9 cm［23］。考虑到孢子可能对幼嫩的胚轴造成一定伤害，将侵染时间梯度设置在36 h以内。选择共培养温度（16、25、30 ℃）、共培养时间（12、24、36 h）、孢子浓度（1×104、1×105、1×106 cfu·mL-1）为考察因素，各因素分别设置3个水平。采用L9（34）正交试验，见表4，每组处理150颗种子。先用不同浓度孢子液过夜浸泡用浓硫酸处理后的乌拉尔甘草种子，再转至平皿上进行发芽处理，以定殖率为评价指标。培养条件下生长2周后提取甘草内生真菌全基因组DNA，PCR验证定殖结果，PCR检测条带单一且明亮即为定殖阳性的种子，计算定殖率，公式为定殖率=定殖阳性的总粒数/发芽种子总数×100%，其方差分析见表5。结果发现各因素对定殖率的影响排序为CAB，差异均有统计学意义（P0.05）。最终确定最佳定殖条件为A2B3C3，即共培养温度25 ℃，共培养时间36 h，孢子浓度1×106 cfu·mL-1。10.13422/j.cnki.syfjx.20220748.T004表4粉红粘帚菌定殖甘草种子的正交试验分析Table 4Orthogonal test for colonization of G. uralensis seeds by C. roseaNo.A共培养温度/℃B共培养时间/hC孢子浓度/cfu·mL-1D（空白）定殖率/%116121×104127.78216241×105220.00316361×106337.83425121×105326.67525241×104151.85625361×106271.11730121×105221.62830241×104347.62930361×106124.3910.13422/j.cnki.syfjx.20220748.T005表5定殖率的方差分析Table 5ANOVA of colonization rate方差来源SSMSFPA810.99405.4951.460.05B594.93297.4637.750.05C860.38430.1954.590.05D（误差）15.767.881.00注：F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=993 讨论据报道，在诱导和共培养阶段，随着AS浓度（0~800 µmol·L-1）的增加，农杆菌对蜡蚧菌Lecanicillium lecanii的转化效率提升显著［24］；在共培养阶段添加AS对蛹虫草Cordyceps militaris的转化效率并无明显影响［25］。本文研究发现AS浓度为150 µmol·L-1时，农杆菌GV3101对粉红粘帚菌的转化率最高，高于这一浓度后，不仅会影响了孢子的萌发生长，还会导致插入拷贝数的增加，进而造成转化效率降低。共培养时间和孢子浓度也是影响转化效率的重要因素，在农杆菌转化指状青霉Penicillium digitatum的研究中发现，当孢子浓度1×104 cfu·mL-1或共培养时间24 h时转化效率极低，甚至检测不到转化子［26］。本研究发现在设定梯度内，孢子浓度为1×107 cfu·mL-1时转化率最高，提高到1×108 cfu·mL-1时转化子反而有所下降；共培养时间在60 h时效果最佳，延长至72 h反而有所降低，可能是由于受体菌过度生长导致菌落生长空间受限，同时非转化子对转化子生长产生了竞争作用。同时，在实验过程中，发现孢子浓度1×108 cfu·mL-1和共培养时间72 h时，孢子萌发量显著增加，导致玻璃纸上菌落连接成片，给转化子筛选带来难度，这可能是导致挑选出来的转化子数量低的原因之一。此外，农杆菌转化不同丝状真菌的转化率结果存在差异，邵倩［27］优化了农杆菌介导黄曲霉的遗传转化体系，在最优条件下，每1×106个受体真菌孢子可获得60个转化子。王沛雅等［28］优化了农杆菌介导寡雄腐霉的遗传转化体系，在最优条件下，每1×106个受体真菌孢子可获得130个转化子。王艳等［29］优化了农杆菌介导黑曲霉的遗传转化体系，在最优条件下，每1×107个受体真菌孢子可获得120个转化子。本文研究发现在最优条件下，每1×107个受体真菌孢子可获得135个转化子，与其他丝状真菌在同一数量级。内生真菌定殖植物的方法有很多，其中浸根法用于幼嫩的种苗时容易使幼苗致病；喷雾法和涂抹叶片法孢子需先进入植物地上部分，不能直接作用于甘草入药部位根及根茎；这3种方法后续投入生产时需要的孢子量巨大，且施用过程中需要先与土壤或空气等介质接触，会对其他生物体的健康存在一定威胁。注射法则过于繁琐，对单粒种子的处理会大大增加实验者及后续田间生产中的工作量。因此，本研究结合甘草种子的发芽特性，对浸种法进行优化，探索了一种实用性强、操作简便的方法，即将粉红粘帚菌定殖至植物，并通过正交试验优选得到最佳定殖条件为共培养温度25 ℃，共培养时间36 h，孢子浓度1×106 cfu·mL-1。汪茜等［30］于生姜发根期，采集不同处理的生姜根系进行侵染检测，发现丛枝菌根真菌（AMF）菌剂、深色有隔内生真菌（DSE）菌剂对生姜根系的侵染率分别为55%、42%，二者混合菌剂侵染率63%。隋丽等［31］发现使用浓度为1×107 cfu·mL-1的球孢白僵菌孢子悬浮液对玉米进行灌根处理时，其在玉米叶部的定殖率达到最大值76.7%。闫思远［32］发现当枸杞内生真菌转化子NQ-D-47发酵液浓度2×107 cfu·mL-1时，其在枸杞中的定殖率较高，达93.65%，之后随着内生真菌发酵液的浓度增加，内生真菌定殖率则会下降。这可能是因为当内生真菌量增加到植物免疫系统识别的阈值时，会引起植物的免疫防御反应，进而不利于内生真菌在宿主中的定殖［33］。本文研究发现，在最佳定殖条件下定殖率为71.11%，提示不同真菌定殖不同宿主植物时定殖率和最优定殖浓度一定存在差异，这可能是因为不同真菌在不同植物免疫系统识别的阈值不同，但具体机制还需进一步验证。本研究通过ATMT成功实现了粉红粘帚菌的GFP和GUS标记，实现了农杆菌转化法转化粉红粘帚菌的条件优化，并将其转化子定殖至甘草植株中，采用正交试验优化了定殖条件。但由于野生菌株粉红粘帚菌亦可在488 nm的激发光下显微弱的绿色荧光，提示绿色荧光观察的方法不适用于该菌后续研究。这可能是因为真菌的菌丝整体、菌丝细胞壁、菌丝横隔、分生孢子及子实体可在不同培养条件下表现出不同程度的自发荧光现象［34］，后续将尝试使用红色荧光蛋白（RFP）或黄色荧光蛋白（YFP）标记粉红粘帚菌。本研究为进一步研究粉红粘帚菌与甘草的分子互作奠定了基础，后续可通过GUS染色法观察粉红粘帚菌在甘草植株的定殖情况，并通过栽培试验验证粉红粘帚菌对甘草的促生增产作用。