肥胖已成为引发全球关注的健康问题，如果不进行有效干预，预计到2025年，将有10亿成年人（占世界人口的近20%）患有肥胖症［1］。肥胖常引起糖尿病、心脑血管病、脂肪肝等疾病的发生［2］，最近研究发现，肥胖会增加新冠肺炎患者患重症的风险［3］。肥胖引发的健康危机给医疗系统带来了巨大的压力。脂肪细胞功能和代谢异常是引起肥胖的主要原因之一，由于能量消耗少于能量摄入，过剩的能量以甘油三酯在白色脂肪组织（WAT）中过度沉积，使白色脂肪与棕色脂肪组织（BAT）比例失衡，大量WAT生成，最终导致肥胖发生［4］。哺乳动物有3种主要类型的脂肪细胞：白色脂肪细胞、米色脂肪细胞和棕色脂肪细胞。白色脂肪细胞用于储存能量，米色和棕色脂肪细胞是专门的生热细胞，能够以热量的形式消耗能量［3］。虽然白色脂肪与棕色脂肪有共同的特征，如脂质积累和内分泌功能，但棕色脂肪表现出更小的脂滴及多室结构，其功能主要是氧化甘油三酯水解产生的脂肪酸来产生热量，并以热量的形式散失，而白色脂肪则具有单室结构［4］。棕色脂肪组织在成年人体内存在，且功能活跃［5］，对2型糖尿病及心脏代谢具有重要贡献。白色脂肪棕色化和棕色脂肪产热能够促进多余的脂肪消耗。因此，增加产热脂肪组织的丰度和活性是提高能量消耗、对抗代谢性疾病和肥胖症的有效策略，研究开发安全调节棕色脂肪活性的药物对改善肥胖及相关代谢性疾病具有巨大市场潜力［6］。芦丁是黄酮类天然化合物之一，作为毛细血管稳定剂临床应用多年，未发现明显不良反应［7］，具有抗糖尿病、抗炎、促进代谢等作用［8-10］。芦丁在改善肥胖方面有显著成效，不仅可诱导肥胖小鼠皮下脂肪组织中棕色样脂肪细胞的形成［7］，还可通过单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）信号通路促进白色脂肪棕色化和棕色脂肪活化及促进高脂饮食诱导的肥胖大鼠肌肉线粒体生物合成［7，11］。3T3-L1前脂肪细胞是研究脂肪形成最常用的体外模型细胞之一［4］，近年来研究发现，肉桂［12］、姜黄素［13］、人参皂苷Rb1［14］、丹参酮ⅡA［15］等多种中药、单体可促进3T3-L1细胞产生棕色化效应。但芦丁促进白色脂肪棕色化的机制尚不完全清楚，本研究观察芦丁对3T3-L1脂肪细胞脂滴形成、线粒体生物合成及产热相关蛋白表达的情况，并阐明其诱导脂肪棕色化的作用机制。1 材料1.1　细胞系3T3-L1前脂肪细胞株，购于武汉普诺赛生命科技有限公司，编号9K0005DC0D，传至7代。1.2　药品与试剂芦丁（纯度为95%），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为G21N11L131837、W27S11E126100）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批号21040704）；DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶、青链霉素（美国Corning公司，批号分别为30720021、04618004、30002297）；地塞米松、胰岛素（北京百瑞极生物科技有限公司，批号分别为20201102、W15J11E107428）；饱和油红O、山羊血清、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗荧光淬灭封片剂（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为CR2102104、G5001、G1012、G1401）；细胞增殖与毒性检测-8（CCK-8）试剂盒（北京翱擎生物科技有限公司，批号AQ308）；蛋白Marker（美国Thermo Scientific公司，批号00787299）；PVDF膜（0.45 μm）（德国Merck Millipore公司，批号R0BB30223）；超敏ECL化学发光试剂盒（苏州新赛美生物科技有限公司，批号20210714）；抗UCP1抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司，批号#A2320）；山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G、PGC-1α抗体、UCP1抗体、山羊抗兔（英国Abcam公司，批号分别为ab150113、GR3245994-2、GR3329095-1、GR3315336-6）；PRDM16抗体（美国Novus公司，批号B605-1404）；NRF1抗体、NRF2/GABPA抗体、TFAM抗体、β-肌动蛋白（β-actin）、山羊抗鼠（美国Proteintech公司，批号分别为00022715、00042558、10011066、00091924、20000242）。1.3　仪器HERACELL 150i型二氧化碳恒温培养箱、Nanodrop One型超微量紫外-可见分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；AE200型倒置显微镜（Motic麦克奥迪实业集团有限公司）；CX23型正置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；SP8型激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）；BioTek Epoch型全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；1658033型蛋白电泳系统及转膜仪（美国Bio-Rad公司）；Amersham Imager 680型超灵敏多功能成像仪（美国Cellular Technology Ltd公司）。1.4　细胞培养基培养基Ⅰ：含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM高糖培养基；培养基Ⅱ：含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素、5 mg·L-1胰岛素、1 μmol·L-1地塞米松和0.5 mmol·L-1 IBMX的DMEM高糖培养基；培养基Ⅲ：含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素和5 mg·L-1胰岛素的DMEM高糖培养基。2 方法2.1　CCK-8法检测芦丁对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性将3T3-L1细胞接种至96孔板中，2×104个/孔，分为8组，每组6个复孔。置于细胞培养箱孵育24 h，向8组分别加入不同浓度的芦丁10 μL，使8组终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol∙L-1。孵育24 h，加入CCK-8溶液，10 μL/孔，继续孵育4 h。孵育结束后，酶标仪测定培养板中细胞450 nm处吸光度A，并计算细胞存活率。细胞存活率=（A药物组-A溶剂孔）/（A空白组-A溶剂孔）×100%。2.2　3T3-L1前脂肪细胞诱导分化与药物处理将3T3-L1前脂肪细胞按照1×105个/孔于24孔板、1×106个/孔于6孔板中进行诱导分化。首先以培养基Ⅰ进行培养，培养至接触抑制后第2天，3T3-L1前脂肪细胞开始诱导分化，弃去培养基Ⅰ，更换为培养基Ⅱ，此日记为诱导分化的第0天。在第2天，弃去培养基Ⅱ，更换培养基Ⅱ继续培养；第3天，吸弃旧的培养基Ⅱ，更换培养基Ⅲ培养；第5天，弃去培养基Ⅲ，更换培养基Ⅰ培养。之后，每隔1 d，用培养基Ⅰ换液，至第10天收集细胞测定。空白组处理如前所述。从第3天起，即更换培养基Ⅲ开始用芦丁处理细胞，第3天和第4天将芦丁溶于培养基Ⅲ处理细胞，从第5天开始将芦丁溶于培养基Ⅰ处理细胞，隔天换液，至第10天收集细胞，进行下一步实验。根据药效学实验指标，选择最佳药效学剂量组，进行后续实验。2.3　油红O染色观察芦丁对3T3-L1脂肪细胞脂滴生成将3T3-L1前脂肪细胞接种于24孔板中，1×105个/孔，诱导分化完成后吸弃旧的培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS漂洗，每孔加入油红O工作液500 µL，4 ℃过夜。弃去油红O，60%异丙醇洗去浮色，PBS漂洗，显微镜下观察拍照。图片采集完成后，弃去PBS，每孔加入异丙醇1 mL，于脱色摇床上震荡10 min，使细胞内与脂滴结合的油红O完全溶解，吸取100 μL至新的96孔板中，分为空白组和芦丁组，每组设置6个复孔，于490 nm处测定培养板中细胞A，测定3T3-L1脂肪细胞中脂滴的含量。此外，在显微镜下观察油红O染色后细胞内脂质累积情况，若出现“戒环状”排列脂滴，则证明诱导分化成功。2.4　免疫荧光染色观察芦丁对线粒体UCP1蛋白表达将3T3-L1前脂肪细胞按照1×106个/孔接种至含有细胞爬片的6孔板，分为空白组和芦丁组。诱导分化完成后收集细胞进行线粒体UCP1蛋白免疫荧光染色。收集后的细胞经过固定、透化及封闭后加入一抗UCP1（1∶200），4 ℃孵育过夜。次日弃去一抗，将细胞6孔板置脱色摇床上用PBS洗涤，用山羊抗兔IgG二抗（1∶200）标记细胞，室温孵育1 h。爬片放置于PBS中在脱色摇床上洗涤，爬片甩干后滴加DAPI染液，室温避光孵育10 min。爬片放置于PBS中在脱色摇床上洗涤，玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂进行封片。通过激光共聚焦荧光显微镜观察并采集图像，并通过Image Pro Plus 6.0软件计算积分吸光度，观察芦丁对3T3-L1前脂肪细胞线粒体UCP-1表达的影响。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测脂肪细胞相关蛋白表达将3T3-L1前脂肪细胞按照1×106个/孔接种至含有细胞爬片的6孔板，分为空白组和芦丁组。诱导分化完成后，加入RIPA裂解液400 μL，室温放置5 min，收集细胞于离心管，使用BCA法测定蛋白浓度。将制备好的SDS-PAGE胶装入电泳仪，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，向加样孔中加入处理好的蛋白样品和Marker。恒压150 V电泳至Marker完全分离。通过电转将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上，电转时电压100 V，时间75 min。转膜后取出PVDF膜放入含有封闭液封闭1.5 h。加入一抗，其中UCP1、PGC-1α、PRDM16（1∶1 000），NRF1、NRF2、TFAM（1∶2 000），β-actin（1∶20 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗涤PVDF膜，放入二抗（1∶5 000）孵育1 h，用TBST洗涤。显影、曝光、拍照，测定蛋白条带灰度值，进行半定量分析。2.6　统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计，实验所得计量资料用x¯±s表示，两组间数据比较采用Student's t分析，多组间数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　芦丁对3T3-L1细胞活性影响与空白组比较，200 μmol∙L-1芦丁组细胞活力显著下降（P0.01）。见表1。为保证细胞活性状态，选取12.5、25、50 μmol∙L-1进行细胞棕色化实验。10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.T001表1芦丁对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响 （x¯±s，n=6）Table 1Effect of different concentrations of rutin on viability of 3T3-L1 preadipocytes （x¯±s，n=6）组别浓度/μmol∙L-1细胞存活率/%空白组100.00±4.27芦丁组3.125100.72±2.686.2598.56±3.6712.599.04±3.452598.23±2.645098.47±4.2310096.36±2.5420090.61±3.061）注：与空白组比较1）P0.01（表3、表4同）3.2　芦丁对3T3-L1细胞棕色化的影响与空白组比较，芦丁（12.5、25、50 μmol∙L-1）可增加3T3-L1细胞产热相关蛋白UCP1、PGC-1α和PRDM16蛋白表达（P0.05，P0.01）。见图1、表2。50 μmol∙L-1芦丁对3T3-L1细胞棕色化作用最佳，因此，选取芦丁50 μmol∙L-1进行后续机制研究［16］。10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.F001图1芦丁作用3T3-L1前脂肪细胞后产热蛋白表达电泳Fig. 1Electrophoresis of rutin on expression of thermogenic proteins in 3T3-L1 preadipocytes注：A.空白组；B~D.芦丁组（12.5、25、50 μmol∙L-1）10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.T002表2芦丁对3T3-L1前脂肪细胞产热蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of rutin on expression of thermogenic proteins in 3T3-L1 preadipocytes （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol∙L-1PGC-1α/β-actinPRDM16/β-actinUCP1/β-actin空白组1.00±0.341.00±0.141.00±0.15芦丁组12.51.81±0.171）1.17±0.311.67±0.30252.36±0.522）1.82±0.913.02±1.162）503.00±0.492）2.70±0.302）3.04±0.682）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.013.3　芦丁对3T3-L1前脂肪细胞脂质积累的影响空白组细胞中出现大量脂滴，且脂滴与油红O染料结合后呈“戒环状”排列；与空白组比较，芦丁组细胞中脂滴含量显著减少。见图2。表明芦丁可显著抑制脂肪细胞的脂质累积。10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.F002图2芦丁对3T3-L1前脂肪细胞脂质积累的影响（油红O，×200）Fig. 2Effect of rutin on lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes （oil red O，×200）注：A.空白组；B.芦丁组（图3、图4同）3.4　芦丁对3T3-L1细胞线粒体生物合成的影响与空白组比较，芦丁组显著增加3T3-L1细胞线粒体UCP1蛋白的免疫荧光强度（P0.01）。见图3、表3。芦丁组3T3-L1细胞线粒体NRF2蛋白表达显著增加（P0.01），NRF1、TFAM蛋白表达也较空白组增加。见图4、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.F003图3芦丁对3T3-L1前脂肪细胞UCP1蛋白的影响（免疫荧光，×200）Fig. 3Effect of rutin on UCP1 protein immunofluorescence in 3T3-L1 preadipocytes （immunofluorescence，×200）注：A.空白组；B.芦丁组10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.T003表3芦丁对3T3-L1前脂肪细胞UCP1蛋白免疫荧光的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of rutin on UCP1 protein immunofluorescence in 3T3-L1 preadipocytes （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol∙L-1荧光强度/AU空白组0.41±0.08芦丁组501.32±0.221）10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.F004图4芦丁作用3T3-L1细胞线粒体生物发生标志性蛋白表达电泳Fig. 4Electrophoresis of rutin on expression of Hallmark proteins of mitochondrial biogenesis in 3T3-L1 cells10.13422/j.cnki.syfjx.202201727.T004表4芦丁对3T3-L1细胞线粒体生物发生标志性蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of rutin on expression of Hallmark proteins of mitochondrial biogenesis in 3T3-L1 cells （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol∙L-1NRF1/β-actinNRF2/β-actinTFAM/β-actin空白组1.00±0.131.00±0.091.00±0.12芦丁组501.37±0.281.95±0.091）1.40±0.244 讨论随时人们生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖已成为全球性流行病，肥胖发生率逐年上升，严重威胁公众健康。肥胖的根本原因是能量消耗不足，过量的能量摄入会导致脂肪组织的扩张，包括脂肪细胞数量及脂肪细胞尺寸的增加。白色脂肪细胞的主要功能是在能量摄入超过消耗时将能量储存为脂肪，棕色或米色脂肪细胞则有助于在冷暴露或肾上腺素能刺激下进行非颤抖产热，从而促进能量消耗。BAT含有丰富的线粒体，通过氧化磷酸化的解偶联产生热量。研究表明，BAT有能力逆转与肥胖相关的代谢紊乱，并且作为一种内分泌器官，可能代表着肥胖及相关疾病的治疗靶点［17］。由于生热脂肪细胞的耗能特性，促进棕色或米色脂肪生成将是治疗肥胖的一种治疗策略［18-19］。近年来，研究人员一直试图通过调节脂肪生成来发现天然或合成的小分子化合物或生物分子来治疗肥胖或相关的代谢性疾病，许多天然化合物和中草药作为补充和替代药物越来越受到公众的关注，可以刺激棕色或米色脂肪的生成，并显示出抗肥胖的活性。芦丁因其药理活性而成为极具吸引力的植物化学物质之一［9］。有研究表明，芦丁通过激活SIRT1/PGC-1α/TFAM信号通路，增加脂肪细胞线粒体数量和BAT活性，及能量消耗，从而显著改善肥胖［7］。棕色和米色脂肪细胞最常用的分子标记是解偶联蛋白1（UCP1）的高表达，UCP1是一种线粒体膜蛋白，在BAT产热过程中起关键作用［15］，可将H+从蛋白通道流入线粒体基质，从而使氧化磷酸化与ATP合成解偶联，并伴随热释放［11］。研究发现，UCP1不仅在棕色脂肪细胞中表达，当机体受到如冷暴露和β-肾上腺素能药物刺激时，WAT中也可检测到表达UCP1具有产热能力与棕色脂肪细胞功能类似的多室脂肪细胞，该细胞被命名为米色脂肪细胞［5］。棕色和米色脂肪细胞虽然只占总脂肪组织的小部分，但由于他们参与产热的能力，可以对机体新陈代谢产生重要影响［3］。棕色脂肪细胞与米色脂肪细胞受热蛋白主要由UCP1、PGC-1α、PRDM16的表达诱导，PRDM16已被确定为决定棕色脂肪细胞形成和功能的遗传开关［20］。产热转录反应的一个关键枢纽是过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（PGC-1α），其在线粒体生物发生过程中起主要调节作用。PGC-1α被p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化并激活，以响应β-肾上腺素能信号［3］。在棕色脂肪细胞中，β-肾上腺素受体也是线粒体呼吸和适应性非颤抖产热机制的主要驱动力［21］。本实验结果表明，芦丁可促进UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白的表达。在上述基础之上，进一步检测了3T3-L1脂肪细胞脂滴聚集的情况，分化的3T3-L1细胞油红O染色结果表明，芦丁可显著抑制前脂肪细胞内脂滴积聚。线粒体在维持代谢组织能量平衡方面起着关键作用［22］，肥胖和糖尿病患者的胰岛素抵抗与脂肪中的线粒体功能障碍密切相关［23-24］。此外，线粒体数量和活性的增加也是白色脂肪组织棕色化的特征，在棕色脂肪细胞的适应性产热中起着关键作用［25-26］。本研究中，芦丁显著增加3T3-L1脂肪细胞线粒体UCP1蛋白含量，表明芦丁增加了3T3-L1脂肪细胞线粒体数量和活性。TFAM是线粒体DNA复制、修复和基因转录的关键调节因子，TFAM过表达可增强能量消耗及更高的线粒体脂肪酸氧化能力，有助于减少脂肪积累和不完全脂肪氧化的代谢物［27-28］。PGC-1α作为一个关键的产热标记物可通过与NRF1/2相互作用调节TFAM，促进线粒体生物发生［29］。线粒体生物发生是由现有线粒体产生新的线粒体的过程，这一生物发生过程受PGC-1α调控，一旦被磷酸化或去乙酰化激活，PGC-1α就会激活NRF1和NRF2，然后激活TFAM，PGC-1α-NRF-TFAM途径的激活导致线粒体DNA和蛋白质的合成及新线粒体的产生［30］。本研究中，芦丁增加了线粒体生物发生蛋白（NRF1、NRF2和TFAM）的表达水平。综上所述，芦丁可抑制3T3-L1前脂肪细胞脂滴的沉积，促进棕色脂肪细胞标志性蛋白UCP1、PGC-1α、PRDM16表达及增加线粒体生物合成，增加产热，诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化。