肝脏具有分泌胆汁、参与代谢、生物转化、免疫调节等功能，然而，在生物转化过程中容易遭受外源性有毒物质侵害而导致肝损伤［1］，其中，药物不良反应是造成损伤主要原因之一，在住院患者中发病率高达10%~30%［2］。药物及其代谢产物对肝脏造成的损害称为药物性肝损伤（DILI）［3］。引起DILI的药物众多，包括对乙酰氨基酚（APAP）、曲格列酮、异烟肼、利福平，以及天然药物雷公藤、黄药子、何首乌等［4-5］。这些药物因其肝损伤及其他脏器损伤危害而使用受限甚至退出市场。APAP引起的肝毒性占美国所有急性肝衰竭病例的46%［6］。糖尿病药物曲格列酮因肝损伤相继退出了欧美和日本市场，而异烟肼、甲氨蝶呤等因可能诱发DILI等被美国食品药品管理局提出安全性警告［7］。近年来中草药引起肝损伤的报道屡见不鲜，如急性肝炎和肝融合性坏死［8］。中药引起的肝损伤中雷公藤位居前列，药物毒性和不良反应成为了其临床普遍使用的主要限制因素［9］。中药雷公藤是卫矛科植物，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、神经保护等作用［10］。雷公藤多苷片（TGT）是从雷公藤根部提取精制而成具有脂溶性的糖苷［11］，具有免疫调节作用，临床常用于治疗自身免疫性炎症性疾病如肾病综合征、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、哮喘等［12-13］。但是，雷公藤多苷片可导致急性肝损伤，肾损伤，胃肠道不良反应，生殖器官损伤及血液系统损伤等不良反应［14-16］。在引起全身器官损伤作用中，肝损伤的发病率高达40%［17］。肝损伤中以药物性肝炎、肝功能衰竭、急性肝损伤、胆汁淤积较为常见［18］。临床症状主要表现为疲倦、乏力、厌食、恶心、压痛等［19］，血清中肝功能生化指标和氧化应激指标含量异常［20-21］。解毒圣药甘草，具有调和诸药、缓和药性作用，可与众多药物配伍，发挥保肝解毒等功效［22］。甘草解毒成分有甘草酸、甘草次酸、甘草甙等［23］。已有报道甘草提取物用作保肝剂治疗四氯化碳、APAP及甲氨蝶呤诱导的DILI取得较好疗效［7，24］。近来研究表明，中药配伍雷公藤制剂具有减毒作用，拓展了雷公藤的药物应用前景，能有效缓解肝损伤［25-31］。因此，本文旨在探究甘草缓解TGT所致急性肝损伤的药效作用机制。本研究采用预给药方式，基于雷公藤多苷片所致急性肝损伤小鼠模型，通过苏木素-伊红（HE）切片观察肝脏病理变化；采用生化法检测血清中肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（ALP）和总胆红素（TBIL）及细胞氧化应激指标丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的血清水平，并通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot），检测其对2种经典的肝药酶细胞色素P4502D6（CYP2D6）、细胞色素P4503A4（CYP3A4） mRNA及蛋白表达水平的影响。初步阐述甘草水提物通过调节肝脏药物代谢关键酶的表达水平，改善TGT所致急性肝损伤的作用机制。1 材料1.1　动物健康雄性昆明种小鼠18~22 g，共60只，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SYXK（京）2019-0010，动物饲养至中国中医科学院中药研究所动物房，实验单位使用许可证编号SYXK（京）2019-0003。饲养条件恒温、恒湿，饲料及饮水充足。本研究中的动物实验获得中国中医科学院中药研究所实验动物伦理委员会批准（批准号2021B110），并按照伦理要求尽可能地减少动物使用数量并减缓实验过程中动物的痛苦。1.2　药品及试剂甘草（北京同仁堂，经中国中医科学院王超副研究员鉴定质量合格），雷公藤多苷片（浙江得恩德制药股份有限公司，批号2004112B），甘草酸二铵胶囊（正大天晴药业集团股份有限公司，批号200105502）；AST、ALT、ALP、TBIL、γ-GT检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号分别为C010-2-1、C009-2-1、A059-2、C019-1、C017-2-1）；MDA含量检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为BC0025、PC0020）；总SOD活性检测试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（碧云天生物技术有限公司，货号分别为S0101S、P0015L）；苏木精（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号CR2014124）；伊红（珠海贝索生物技术有限公司，批号C210601）；TRIzol、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，批号分别为O31103、P30923、P10325）；CYP2D6抗体、CYP3A4抗体（英国Abcam公司，货号分别为CR3210034-6、CR3336523-2）；抗兔免疫球蛋白（Ig）G二抗（美国Cell Signaling Technology公司，货号30）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号62u0922/6）；化学发光检测试剂盒（上海雅梅生物科技有限公司，货号014711000）。1.3　仪器NanoDrop One型超微量分光光度计、Applied Biosystems Veriti型梯度PCR仪、ABI StepOnePlus型Real-time PCR仪（美国Thermo Fisher公司）；EnVision型微孔板读板仪（美国PerkinElmer公司）；Azure Biosystems C400可见荧光成像系统（美国Azure Biosystems公司）；JY300HE型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。2 方法2.1　药品制备雷公藤多苷片和甘草酸二铵分别研磨成药粉，称取相应质量加入生理盐水溶解制得质量浓度为27、5.625 mg·L-1的混悬液。甘草水提物制备，称取甘草135 g，加入水2 L，加热浓缩至300 mL，过滤，保存滤液。再加水1 L加热浓缩至300 mL，过滤。将2次滤液混合加热浓缩至质量浓度为1.125 g·L-1的水提物，经稀释得到的甘草水提物中剂量组质量浓度为0.75 g·L-1和甘草水提物低剂量组质量浓度为0.375 g·L-1。2.2　动物分组、造模及给药将60只SPF级昆明种小鼠随机分为空白组、模型组、甘草水提物低、中、高剂量组（5、10、15 g·kg-1·d-1，给药剂量参考文献中甘草水提物剂量分别为5、15 g·kg-1·d-1对急性肝损伤有明显保护作用而设定［32］）和阳性药甘草酸二铵组（75 mg·kg-1·d-1）［33］，每组10只。甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组每日灌胃给药，正常组和模型组用等体积生理盐水灌胃，连续7 d。雷公藤多苷诱导急性肝损伤模型的构建：给药组在预给药7 d后，除正常组外，各组均灌胃雷公藤多苷片溶剂（270 mg·kg-1，给药剂量参考文献［33］），作用18 h后采集标本。2.3　观察及检测指标2.3.1　HE染色观察肝脏病理形态用4%多聚甲醛固定的肝组织，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡染色，光镜下观察肝脏病理变化。对HE图片进行半定量方法评价肝组织病理损伤程度［34］，“0”为正常肝细胞结构；“Ⅰ”为肝细胞轻度肿胀，散在炎性细胞，肝细胞点状坏死；“Ⅱ”为肝细胞局灶性或斑片状坏死小于肝小叶的1/3，局灶性炎性细胞浸润；“Ⅲ”为肝细胞广泛坏死，约1/3~1/2肝小叶，斑片状炎性细胞浸润；“Ⅳ”为肝细胞坏死超过1/2的肝小叶，严重的斑片状炎性细胞浸润。2.3.2　生化法检测AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL、MDA、SOD的水平取-80 ℃保存的血清样本，按照试剂盒说明书指南检测血清中AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL、MDA、SOD的水平。2.3.3　Real-time PCR检测CYP2D6、CYP3A4的mRNA表达水平取适量肝脏组织加入TRIzoL进行组织研磨至匀浆、三氯甲烷抽提和异丙醇沉淀提取RNA。将提纯的RNA逆转录为cDNA，将cDNA进行Real-time PCR仪扩增，检测CYP2D6和CYP3A4的mRNA表达量。反应条件为94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt计算mRNA表达量，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列（5'-3'）长度/bpCYP2D6上游GGTAGGGTCCCAGGTCGTCT20下游CTATGCCTGCCGCTTTGAGT20CYP3A4上游GGCAAGCCTGTTACTATGAAAG22下游ACTGAGAAGAGCAAAGGATCAA22GAPDH上游CGTGCCGCCTGGAGAAACC19下游TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG232.3.4　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝脏CYP2D6、CYP3A4蛋白表达水平将肝脏组织用手术剪剪碎后，取100 mg于离心管中。加入RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂按100∶1比例的混合裂解液500 μL，放置冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min（离心半径6 cm），吸取上清，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度并调平蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转膜，摇床上室温封闭1 h后TBST洗膜，用CYP2D6（1∶1 000）、CYP3A4（1∶2 000）、GAPDH（1∶3 000）的兔多克隆抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入抗兔IgG二抗（1∶3 000），室温孵育1 h。TBST洗膜后显影，使用Image J软件做蛋白定量分析。2.3.5　统计学分析采用GraphPadPrism 9.0 版本进行统计学分析，计量资料以x¯±s表示，满足正太性和方差齐性用单因素方差分析（One-way ANOVA）；满足正态性但不满足方差齐性用Welch检验和Brown-Forsythe检验；不满足正太性用非参数检验，P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对雷公藤多苷片所致小鼠肝损伤病理变化的影响结果显示，正常组小鼠的肝脏肝小叶结构清晰，肝细胞排列规则，无炎症细胞浸润；与正常组比较，模型组小鼠肝脏明显出现炎性细胞浸润并且肝细胞明显肿大，胞浆稀疏呈网状，半透明，胞浆界限不明显，并含有淡黄色透明物质沉着，肝细胞坏死明显；与模型组比较，甘草水提物低、中、高剂量组及甘草酸二铵组均可不同程度减轻炎性细胞浸润和肝细胞肿大，肝细胞坏死减少。见图1。肝脏组织病理损害半定量结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织广泛损伤，多为Ⅳ级（P0.01）；与模型组比较，甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组的肝损害分级显著减轻，多为Ⅰ到Ⅱ级（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.F001图1甘草水提物对小鼠肝脏组织病理变化的影响 （HE， ×200）Fig.1Effect of water extract of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma （WEOGRR） on pathological changes of liver tissue in mice （HE， ×200）注：A.正常组；B.模型组；C.甘草酸二铵组；D.甘草水提物低剂量组；E.甘草水提物中剂量组；F.甘草水提物高剂量组（图2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T002表2甘草水提物对小鼠肝脏组织病理损害程度的影响 （n=10）Table 2Effect of WEOGRR on pathological damage degree of liver tissue in mice （n=10）组别剂量/g·kg-1肝损伤程度0ⅠⅡⅢⅣ正常组100000模型组02）02）02）22）82）甘草酸二铵组0.07554）44）14）04）04）甘草水提物低剂量组504）14）74）24）04）甘草水提物中剂量组1024）44）44）04）04）甘草水提物高剂量组1534）64）14）04）04）注：与正常组比较1）P0.05；2）P0.01；与模型组比较3）P0.05；4）P0.01（表3-表6同）只3.2　对雷公藤多苷片所致急性肝损伤小鼠血清中AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL水平的影响与正常组比较，模型组血清中肝功能指标AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL明显升高，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01）；与模型组比较，甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组血清中AST、ALT、ALP、TBIL和γ-GT均降低，其中甘草水提物高剂量组血清中AST、ALT和ALP降低具有显著性（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T003表3甘草水提物对小鼠血清中AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL水平的影响 （x¯±s，n=8）Table 3Effect of WEOGRR on AST， ALT， γ-GT， ALP and TBIL levels in mice serum （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1ALT/U·L-1AST/U·L-1γ-GT/U·L-1ALP/U·L-1TBIL/μmoL·L-1正常组40.07±17.0728.35±5.0511.17±3.86238.50±44.9419.23±5.28模型组516.55±147.112）178.61±37.742）35.85±6.102）320.85±71.521）126.42±68.681）甘草酸二铵组0.075153.94±100.113）77.67±33.0221.52±5.743）230.47±51.953）34.18±6.92甘草水提物低剂量组5278.12±200.9488.51±32.7515.85±2.734）244.13±42.7930.10±10.094）甘草水提物中剂量组10114.32±94.573）76.91±45.2618.01±4.76237.15±81.463）33.67±5.00甘草水提物高剂量组1585.08±78.994）61.31±31.034）19.96±5.81219.02±49.054）30.78±4.643.3　对雷公藤多苷片所致急性肝损伤小鼠血清中氧化应激指标MDA、SOD水平的影响与正常组比较，模型组血清中反映肝细胞氧化应激指标MDA显著升高（P0.01），SOD显著降低（P0.01）；与模型组比较，甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组MDA水平显著降低（P0.01），SOD水平显著升高（P0.01）。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T004表4甘草水提物对小鼠血清中MDA、SOD表达水平的影响 （x¯±s，n=8）Table 4Effect of WEOGRR on expression levels of MDA and SOD in mice serum （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1MDA含量/nmol·L-1SOD酶活力/U正常组3.37±1.431.21±0.18模型组6.71±2.402）0.52±0.132）甘草酸二铵组0.0753.01±2.144）1.25±0.364）甘草水提物低剂量组52.37±1.604）1.14±0.204）甘草水提物中剂量组102.78±2.094）1.14±0.204）甘草水提物高剂量组151.74±1.244）1.13±0.324）3.4　对雷公藤多苷片所致急性肝损伤小鼠肝脏中CYP2D6和CYP3A4 mRNA表达水平的影响雷公藤多苷诱发小鼠DILI后，与正常组比较，模型组肝脏中主要的药物代谢酶CYP2D6和CYP3A4 mRNA表达量显著降低（P0.01）；与模型组比较，甘草酸二铵组及中、高剂量的甘草水提物小鼠肝脏组织中的CYP2D6和CYP3A4 mRNA表达水平显著升高（P0.01）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T005表5甘草水提物对小鼠肝脏中CYP2D6和CYP3A4 mRNA表达水平的影响 （x¯±s，n=5）Table 5Effect of WEOGRR on mRNA expression levels of CYP2D6 and CYP3A4 in mice liver （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1CYP2D6CYP3A4正常组1.00±0.081.00±0.06模型组0.34±0.012）0.09±0.012）甘草酸二铵组0.0750.81±0.044）0.88±0.164）甘草水提物低剂量组50.41±0.020.32±0.014）甘草水提物中剂量组100.46±0.054）0.19±0.024）甘草水提物高剂量组150.50±0.024）0.54±0.024）3.5　对雷公藤多苷片所致急性肝损伤小鼠肝脏中CYP2D6和CYP3A4蛋白表达的影响与正常组比较，模型组CYP2D6和CYP3A4蛋白表达量明显降低（P0.05，P0.01）；与模型组比较，甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组均上调了CYP2D6和CYP3A4蛋白表达水平，其中以甘草水提物中剂量组上调CYP2D6和甘草酸二铵组上调CYP3A4蛋白表达量最为明显（P0.05，P0.01）。见图2和表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.F002图2小鼠肝脏中CYP2D6和CYP3A4蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of CYP2D6 and CYP3A4 protein expression levels in mice liver10.13422/j.cnki.syfjx.20222039.T006表6甘草水提物对小鼠肝脏中CYP2D6和CYP3A4蛋白表达水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 6Effect of WEOGRR on CYP2D6 and CYP3A4 protein expression levels in mice liver （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1CYP2D6/GAPDHCYP3A4/GAPDH正常组1.22±0.261.06±0.41模型组0.67±0.112）0.60±0.281）甘草酸二铵组0.0750.87±0.211.14±0.263）甘草水提物低剂量组50.78±0.150.73±0.32甘草水提物中剂量组101.06±0.254）0.96±0.20甘草水提物高剂量组150.90±0.170.98±0.234 讨论近来天然药物引发的肝脏毒性日渐引起广泛关注［35］。雷公藤多苷片常作为中药免疫抑制剂，用于治疗多种自身免疫性疾病，但其导致DILI的报道屡见不鲜［36］。雷公藤多苷引起的肝损伤常表现为血清中转氨酶ALT、AST升高，高胆红素血症，黄疸，血尿素氮增高，肝肿大、肝衰竭及反应自由基清除水平的抗氧化物SOD含量降低［37-39］。目前认为雷公藤引起肝损伤的可能机制有诱导细胞凋亡、氧化应激、促炎因子TNF-α过度释放等［4］。其中，细胞色素P450调节药物的生物转化及自由基学说的认可度较高，多价不饱和脂肪酸在自由基诱导下过氧化生成MDA，MDA可使蛋白质、核酸等受损及生物膜性质改变，细胞衰老或凋亡。引发肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-10的过度释放，这些促炎因子又增强了细胞氧化应激使得肝细胞损伤更为严重。而细胞依赖SOD清除自由基，阻断自由基的链式反应对细胞的损害而保护肝细胞。当大量雷公藤多苷进入肝脏代谢时，肝细胞膜和线粒体膜变性溶解，ALT、γ-GT和AST释放进入血液，表明肝实质性损伤［40］。由于ALT存在于肝细胞质中且在肝脏中浓度最大，雷公藤多苷引起的急性肝炎时，肝细胞通透性增加，细胞质中ALT大量释放入血，是急性肝损伤非常灵敏的指标。而AST存在于线粒体中，在急性肝炎时线粒体损害较轻，因此AST升高不如ALT明显［41］。雷公多苷引起药物中毒的肝损伤可表现为胆汁淤积、胆道阻塞，造成存在于胆管上皮细胞中γ-GT和ALP释放增多，血清中γ-GT和ALP水平急剧上升［42］。雷公藤多苷引起急性肝炎时，因胆道梗阻或肝细胞破坏导致肝脏对未结合胆红素的摄取和结合能力降低，以及对结合胆红素的排泄受阻导致血清中总胆红素升高［43］，通过血清总胆红素能灵敏的反映肝脏的受损情况。本研究中雷公藤多苷片所致急性肝损伤模型后，小鼠血清中肝功能生化指标AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL急剧升高。甘草水提物低、中、高剂量组上诉指标升高程度均有所缓解，通过肝功能指标反映了甘草水提物预给药后雷公藤多苷片所致肝损伤得到改善，甘草水提物有护肝作用。雷公藤多苷片引起的急性肝损伤中，细胞内氧化与抗氧化失衡。自由基在肝细胞内过多积聚而产生大量脂质过氧化产物MDA导致细胞毒性作用，而具有清除自由基的发挥抗氧化作用的SOD活性降低，造成肝细胞损伤和凋亡［44-45］。本研究通过测定血清中MDA含量和SOD酶活性发现，甘草水提物低、中、高剂量组缓解了MDA含量的急剧升高且SOD酶活力增加，表明甘草水提物可能通过减轻肝细胞氧化应激水平而改善肝损伤。近来研究表明，细胞色素P450在雷公藤引起的肝损伤中发挥着重要的作用。其中参与药物代谢的主要酶亚型是CYP3A4、CYP2D6，而CYP3A4含量最高且主导50%的药物代谢，在肝脏药物清除过程中发挥着重要作用［46］。雷公藤多苷片对CYP3A4酶活性有较强抑制作用，CYP3A4和CYP2D6酶活性抑制或基因表达降低可引起药物代谢异常，导致雷公藤多苷及其代谢产物在肝内清除缓慢、大量蓄积，增强肝损伤作用引起肝细胞大量水肿坏死，炎症细胞浸润，肝细胞脂肪变性等组织病理改变［47-50］。而甘草可改善肝损伤后释放入血的TBIL、AST、ALT水平，上调细胞色素P450的表达而增强药物代谢水平，对肝细胞具有较好的保护作用［51-52］。本研究中雷公藤多苷片造模后可显著降低CYP3A4和CYP2D6 mRNA及蛋白表达水平，抑制药物的代谢。而甘草水提物低、中、高剂量组和甘草酸二铵组增强了CYP3A4和CYP2D6 mRNA及蛋白的表达量，使雷公藤多苷的药物代谢率加快，缓解药物在肝脏的长时间滞留从而减轻肝损伤。此外，病理切片显示，甘草水提物高剂量预给药组肝细胞水肿减轻，炎症细胞数目较少，形态趋于正常。综上，本研究基于雷公藤多苷片诱导的急性肝损伤小鼠模型发现，甘草水提物预给药可以有效减轻肝脏的病理学变化；降低血清中肝功能指标AST、ALT、γ-GT、ALP、TBIL的水平；抑制MDA含量上升并增加了SOD酶活力；升高肝脏组织中肝脏药物代谢酶CYP3A4和CYP2D6 mRNA及蛋白表达量；因此，甘草水提物缓解雷公藤多苷片所致肝损伤的作用机制可能与加速活性氧的清除及提高有毒药物的代谢速率，从而发挥肝脏保护作用。本研究为雷公藤配伍甘草减轻药物毒性作用提供了新的线索，有望解决雷公藤临床用药受限的难题，以及为甘草减轻雷公藤多苷片所致肝损伤的作用机制提供了一定的理论参考。