肝癌是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。手术治疗是早期肝癌患者最普遍和最有效的治疗手段，晚期患者通常需要接受全身治疗，但治疗效果往往并不理想［1］。索拉非尼和乐伐替尼是2种晚期肝癌的一线治疗药物。索拉非尼可以有效抑制肝癌细胞的恶性表型，但在治疗过程中肿瘤细胞很容易对其产生耐药性，并且伴发多种不良反应。乐伐替尼在临床试验中的治疗表现不差于索拉非尼，但其仍缺乏完整的治疗方案［2-3］。在探求新的治疗手段时，药食中的天然化合物被发现具有良好的治疗潜力［4］。天然化合物毒性低、不良反应小，并且治疗范围十分广泛，涉及抗氧化、抗炎和抗癌等多个方面的疗效［5］。灵芝是中国传统著名药食两用真菌，有“仙草”之称。灵芝的子实体和孢子粉都具有多种药用价值，其在抗肿瘤方面的良好疗效已经得到证实［6-7］。灵芝多糖是灵芝中的重要活性物质，也是灵芝发挥抗癌作用的主要成分。研究表明灵芝多糖可以抑制结直肠癌的发生［8］、调节巨噬细胞极化和微环境来抑制肝癌细胞活性［9］以及抑制信号分子磷酸化来干预肺癌细胞转移［10］。磷脂酰肌醇3­激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路是癌症中常见的异常激活通路，管理细胞存活、细胞周期进程和细胞生长等多种生物过程［11］。本研究通过灵芝多糖对肝癌细胞SK-HEP-1和Huh-7恶性表型的影响，以及灵芝多糖对PI3K/Akt信号通路的调控作用，进一步探讨其抗癌机制。1 材料1.1　细胞与试剂人肝癌细胞系SK­HEP­1和Huh­7 （美国ATCC公司，批号分别为HTB­52、YB­H3110），置于含有10%胎牛新鲜血清的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，传至第5代后用于实验。破壁灵芝孢子粉（安徽敬道生物科技有限公司，批号200301），经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定符合实验要求，为多孔菌科植物灵芝Ganoderma lucidum的孢子粉；胎牛血清（以色列Biological Industries公司，批号04-001-1A）；细胞增殖与活性检测-8（CCK-8）试剂盒（美国Glpbio公司，批号GK10001）；cell cycle staining kit （杭州联科生物技术有限公司，批号CCS102）；Hoechst33258、RIPA蛋白质裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL显影试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C1011、P0013C、P0012S、P0018S）；TBS+Tween （TBST）缓冲液（中国Biosharp公司，批号21259419）；甘油醛­3­磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、磷酸化（p）-PI3K、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为2118S、4257T、4228T、4691T、4063T）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白（中国北京索莱宝科技有限公司，批号SE134）。1.2　仪器HF160W型恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；318C+型酶标仪（上海赣闽分析仪器有限公司）；DMi8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；NovoCyte 2060R型流式细胞仪［艾森生物（杭州）有限公司］；1645070型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Tanon 5200型FluorChem M凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）。2 方法2.1　制备灵芝多糖参照文献［12］方法制备灵芝多糖。称取适量的破壁灵芝孢子粉，先用乙醇浸泡进行粗提取，再将提取物溶解于超纯水100 mL，然后依次用5、1.2、0.45 μm的微滤膜进行过滤，除去灵芝多糖粗提液中的固形物。在超滤压力为0.43 mPa，溶液温度为35 ℃，膜面流速为15.5 m·s-1条件下，用1×104 Da的超滤膜分离特定区间相对分子质量的灵芝多糖，最后进行真空冷冻干燥处理，得到后续实验的灵芝多糖，由此制得的破壁灵芝孢子粉多糖得率为15.56 mg·g-1，纯度为82.4%。2.2　CCK­8法检测细胞增殖肝癌细胞SK­HEP­1和Huh­7消化后，1 200 r·min-1离心3 min（离心半径10 cm）收集细胞，将细胞密度调到4×104个/mL，以每孔100 μL均匀接种在96孔板中。将96孔板于37℃、5% CO2恒温培养箱中过夜培养，直至细胞完全贴壁。用DMEM完全培养基配制不同浓度（0、2、4、8、16、32 g·L-1）的灵芝多糖溶液，每个浓度设置3个复孔，在吸除原有培养基后加入灵芝多糖溶液培养细胞48 h。之后在复孔中以DMEM基础培养基-CCK­8 10∶1加入CCK­8试剂，培养箱孵育2 h，用酶标仪测量450 nm处A，计算肝癌细胞存活率。增殖抑制率=（A溶剂孔-A药物组）/（A溶剂孔-A空白组）×100%，细胞存活率=（A药物组-A空白组）/（A溶剂孔-A空白组）×100%。2.3　检测细胞划痕愈合肝癌细胞SK­HEP­1和Huh­7消化后，将细胞密度调到8×104个/mL，以每孔500 μL均匀接种在24孔板中。待板中细胞长到90%时，用10 μL的白枪头在孔内划线，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔漂洗2次，洗去脱落的细胞后加入DMEM基础培养基配制的0、3.5、7、14 g·L-1灵芝多糖溶液，并在作用0、48 h时进行拍照记录。计算划痕愈合的相对距离进行统计学分析。2.4　检测细胞周期肝癌细胞SK­HEP­1和Huh­7消化，将细胞密度调至1×106个/mL，以每孔2 mL均匀接种在6孔板中。待细胞贴壁后加入0、3.5、7、14 g·L-1灵芝多糖溶液，培养48 h分别收集孔中的细胞，弃上清。用预冷PBS清洗，加入DNA Staining solution 1 mL和碘化丙啶（PI） 10 µL，并涡旋振荡混匀，于室温避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测。2.5　检测细胞凋亡肝癌细胞SK­HEP­1和Huh­7消化后，将细胞密度调到8×104个/mL，以每孔500 μL均匀接种在24孔板中。待细胞贴壁后，用DMEM完全培养基配制0、3.5、7、14 g·L-1灵芝多糖溶液培养细胞48 h，每个浓度设置2个复孔。培养过后用4%多聚甲醛进行细胞固定20 min，用PBS漂洗2次，每次5 min。将细胞用Hoechst33258染液避光孵育约5 min，用PBS漂洗。用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化并拍照。2.6　蛋白免疫印迹法检测细胞蛋白表达肝癌细胞SK­HEP­1和Huh­7消化后，将细胞密度调至1×106个/mL，以每孔2 mL均匀接种在6孔板中。待细胞贴壁后，用DMEM完全培养基配制0、3.5、7、14 g·L-1灵芝多糖溶液培养细胞72 h，PBS漂洗细胞，用细胞裂解液裂解细胞并收集。蛋白上样后进行电泳和转膜，封闭2 h后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将PVDF膜放入一抗（1∶1 000） 4 °C下孵育过夜。用TBST缓冲液漂洗3遍后，在室温下孵育二抗（1∶5 000） 2 h，再用TBST缓冲液漂洗，最后在PVDF膜上滴上显影液进行曝光。2.7　统计学方法采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，所有符合正态分布的计量资料均以x¯±s表示，所有检验皆为双侧检验，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　灵芝多糖对肝癌细胞增殖能力的影响与空白组比较，灵芝多糖（4~32 g·L-1）作用于SK­HEP­1和Huh­7细胞时，细胞的活力均明显减少（P0.05， P0.01）。灵芝多糖作用于SK-HEP-1和Huh-7细胞的半数抑制浓度（IC50）为7 g·L-1，根据IC50的一半和两倍确定灵芝多糖3.5、7、14 g·L-1用于后续实验。与空白组比较，灵芝多糖组（3.5、7、14 g·L-1）均可以抑制肝癌细胞的增殖（P0.01），其抑制程度和灵芝多糖浓度成正比。见表1、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.T001表1灵芝多糖对肝癌细胞的存活率的影响 （x¯±s，n=3）Table 1Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on survival rate of hepatocellular carcinoma cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1细胞存活率/%SK-HEP-1Huh-7空白组100.00±1.43100.00±0.65灵芝多糖组286.90±2.4390.76±1.36475.83±1.701）81.19±1.931）861.44±1.712）63.53±1.002）1644.74±1.562）48.43±1.362）3229.19±0.652）33.83±1.122）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01（表2-表5同）10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.T002表2灵芝多糖对肝癌细胞的存活率的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on survival rate of hepatocellular carcinoma cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1细胞存活率/%SK-HEP-1Huh-7空白组100.00±0.96100.00±1.00灵芝多糖组3.589.82±0.531）85.07±2.412）770.51±0.882）72.87±2.662）1453.68±0.852）59.07±1.452）3.2　灵芝多糖对肝癌细胞迁移能力的影响与空白组比较，灵芝多糖组（3.5、7、14 g·L-1）作用于SK­HEP­1和Huh­7细胞48 h，细胞的迁移距离明显缩短（P0.05， P0.01），并且迁移距离和灵芝多糖浓度呈反比。见图1、图2、表3。10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F001图1灵芝多糖对SK­HEP­1细胞迁移能力的影响 （倒置显微镜，×40）Fig. 1Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on migration ability of SK­HEP­1 cells （inverted microscope, ×40）注：A. 空白组；B~D. 灵芝多糖组 （3.5、7、14 g·L-1） （图2-图6同）10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F002图2灵芝多糖对Huh­7细胞迁移能力的影响 （倒置显微镜，×40）Fig. 2Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on migration ability of Huh­7 cells （inverted microscope, ×40）10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.T003表3灵芝多糖对肝癌细胞迁移能力的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on migration ability of hepatocellular carcinoma cells （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1SK-HEP-1Huh-7空白组0.82±0.020.62±0.03灵芝多糖组3.50.70±0.011）0.48±0.011）70.51±0.002）0.39±0.022）140.32±0.032）0.25±0.032）3.3　灵芝多糖对肝癌细胞周期的影响与空白组相比较，灵芝多糖组（3.5、7、14 g·L-1）SK­HEP­1细胞S期和G2期细胞数量随着药物浓度增加逐渐下降（P0.05，P0.01），SK­HEP­1、Huh-7细胞G1期细胞比例逐渐增加（P0.05，P0.01），说明灵芝多糖诱导肝癌细胞G1期细胞阻滞。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.T004表4灵芝多糖对肝癌细胞周期的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on cycle of hepatocellular carcinoma cells （x¯±s，n=3）细胞组别质量浓度/ g·L-1G1SG2SK-HEP-1空白组29.64±1.2747.43±0.9422.93±1.70灵芝多糖组3.540.34±1.581）44.63±1.3915.03±2.001）754.12±0.832）39.58±1.662）6.29±1.982）1469.40±2.162）24.50±2.082）6.10±2.252）Huh-7空白组30.22±1.3346.08±1.8223.69±2.19灵芝多糖组3.540.41±2.291）45.14±2.0914.46±2.391）755.99±2.002）37.21±1.872）6.80±1.552）1469.54±1.462）24.76±1.492）5.70±1.062）%3.4　灵芝多糖对肝癌细胞凋亡的影响与空白组比较，灵芝多糖组（3.5、7、14 g·L-1）中凋亡细胞的数量逐渐增多。Hoechst33258是一种重要的荧光染料，染色后正常细胞呈低蓝色，凋亡细胞的细胞核呈高亮的蓝色。空白组中绝大部分细胞呈低蓝色荧光状态，是正常细胞；灵芝多糖组出现核形态改变的肝癌细胞，凋亡细胞数量与灵芝多糖浓度呈正比。见图3、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F003图3灵芝多糖对SK­HEP­1细胞凋亡的影响 （Hoechst33258， ×200）Fig. 3Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on apoptosis of SK­HEP­1 cells （Hoechst33258， ×200）10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F004图4灵芝多糖对Huh­7细胞凋亡的影响 （Hoechst33258，×200）Fig. 4Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on apoptosis of Huh­7 cells （Hoechst33258， ×200）3.5　灵芝多糖对PI3K/Akt通路的影响与空白组比较，灵芝多糖组（7、14 g·L-1）明显抑制PI3K、Akt磷酸化（P0.05，P0.01），呈浓度依赖性。但灵芝多糖对PI3K和Akt的表达未见明显影响。见图5、图6，表5。10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F005图5灵芝多糖作用于SK­HEP­1细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达电泳Fig. 5Electrophoresis of Ganoderma lucidum polysaccharides on relative protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt in SK­HEP­1 cells10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.F006图6灵芝多糖作用于Huh-7细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达电泳Fig. 6Electrophoresis of Ganoderma lucidum polysaccharides on relative protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt in Huh-7 cells10.13422/j.cnki.syfjx.2022002023.T005表5灵芝多糖对肝癌细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on relative protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt in hepatocellular carcinoma cells （x¯±s，n=3）细胞组别质量浓度/g·L-1PI3K/GAPDHp-PI3K/GAPDHAkt/GAPDHp-Akt/GAPDHSK-HEP-1空白组1.14±0.071.30±0.021.02±0.081.34±0.11灵芝多糖组3.51.02±0.041.11±0.090.99±0.011.12±0.0270.99±0.010.73±0.061）0.87±0.230.81±0.122）141.10±0.030.45±0.062）0.90±0.020.44±0.162）Huh-7空白组0.91±0.091.36±0.361.01±0.071.33±0.03灵芝多糖组3.51.03±0.051.07±0.040.96±0.150.94±0.271）71.08±0.120.90±0.311）1.05±0.170.82±0.112）140.97±0.270.59±0.142）1.06±0.050.39±0.282）4 讨论肝癌是一种高发的恶性肿瘤，2020年全球癌症统计数据显示，全球新发肝癌人数高达91万左右，死亡率排在第2位［13］。我国肝癌的发病率和死亡率更是接近全球发病率和死亡率的一半，并且发病率和死亡率的数值很接近［14］。肝癌的早期诊断困难并且病情发展迅速，多数患者初次诊断即为中晚期肝癌。虽然肝癌的治疗手段在不断进步，晚期肝癌的全身治疗效果也有所提高，但这还远远不够，患者的存活率仍然很低。近年来，中药因为其不良反应小、疗效好等多种优点，在抗肿瘤药物研究方面受到广泛关注。灵芝是我国的传统保健药材，含有丰富的活性成分，灵芝多糖就是从中提取的一种天然活性物质，不仅安全性高而且具有多种治疗和保健作用［15-16］，如抗肿瘤［17］、抗氧化［18］、调节免疫［19］、降血糖血脂［20］、抗疲劳［21］等。多项研究表明灵芝多糖的抗肿瘤作用突出。本课题组评价了灵芝多糖对肝癌细胞SK-HEP-1和Huh-7的抗肿瘤作用，并探讨了其可能的作用机制，结果表明灵芝多糖具有开发抗肝癌药物的潜力。灵芝多糖具有优秀的抗肿瘤活性，对多种肝癌细胞都有抑制作用，通常剂量越高效果越显著［22］。本研究对SK­HEP­1和Huh­7两种肝癌细胞展开体外细胞实验，CCK-8实验结果显示，与空白组比较，灵芝多糖低、中、高浓度对2种肝癌细胞的增殖有显著的抑制作用，并且灵芝多糖的浓度越高，细胞的存活率越低。此外，细胞周期实验结果显示灵芝多糖可以诱导SK­HEP­1和Huh­7细胞发生G1期周期阻滞，随着浓度的增加，G1期细胞逐渐增多，S期和G2期细胞比例逐渐下降。通过诱导周期阻滞抑制肿瘤细胞增殖是一种重要的抗肿瘤机制，灵芝多糖也曾被证明可以诱导结肠癌细胞周期阻滞，并将LoVo细胞阻滞于S期、HCT­116细胞阻滞于S和G2/M期［23］。有报道证明了灵芝多糖肽可以抑制睡眠片段化小鼠的B16-F10-luc-G5黑色素瘤肿瘤的转移［24］，此外，细胞实验结果显示高浓度的灵芝多糖肽可以抑制肝癌细胞Huh-7的迁移，并且诱导Huh-7细胞的凋亡［25］。划痕实验和Hoechst33258染色结果显示灵芝多糖具有相似的抗肿瘤作用。划痕实验结果显示，与空白组比较，灵芝多糖组2种肝癌细胞的迁移能力以浓度依赖的方式显著降低。Hoechst33258染色结果显示，空白组中2种肝癌细胞普遍为低蓝色荧光状态，灵芝多糖组（3.5 g·L-1）出现核形态改变的肝癌细胞，在显微镜下呈现为高亮的蓝色荧光状态，灵芝多糖浓度越高，核形态改变的细胞数越多，提示灵芝多糖可以促进肝癌细胞的凋亡。PI3K/Akt信号通路是调控肿瘤细胞生物学过程的重要通路，活化的PI3K可以与其下游分子Akt结合，促使其磷酸化后继续激活下游的凋亡相关蛋白［26］。此外，Akt的激活和肝癌细胞的增殖、迁移及周期调节都密切相关［27］。蛋白免疫印迹法结果显示灵芝多糖抑制了PI3K和Akt的磷酸化，而且浓度越高，抑制作用越明显。灵芝多糖在抑制2种肝癌细胞增殖、迁移并诱导其周期阻滞和凋亡的同时，还显著下调p-PI3K和p-Akt蛋白的表达水平。因此，灵芝多糖对2种肝癌细胞恶性表型的抑制作用，与其抑制PI3K/Akt信号通路的表达有关。综上，灵芝多糖通过调控PI3K/Akt信号通路，进而抑制SK­HEP­1和Huh­7的增殖和迁移，并且在诱导G1期细胞周期阻滞及凋亡方面也发挥作用。这为灵芝多糖的临床应用提供一定的依据，但其对动物模型的作用及其机制尚不明确，有待进一步的研究。