干燥综合征（SS）是一种主要累及唾液腺和泪腺等外分泌腺的慢性自身免疫性疾病，以血清高水平的自身抗体、外分泌腺体破坏和组织淋巴细胞浸润为主要特征，可分为原发性和继发性2种［1-3］。原发性SS（pSS）好发于中老年女性［1］，在我国人群患病率为0.33%~0.77%，男女比约为1∶22.9［4］。pSS的发病机制尚未完全阐明，目前认为主要与遗传、环境和自身免疫异常有关［5］。局部治疗缓解症状是本病腺体受累的首要疗法，免疫抑制剂可用于存在活动性系统受累的患者，但疗效并不理想［6］。SS属于中医“燥痹”的范畴，中医药能有效改善本病的临床症状［7-9］。化湿润燥方是首都中青年名中医陶庆文教授结合多年临床经验创立的治疗SS的经验方，已获得国家发明专利，该方药味精简，效力专著，临床应用多年，能显著改善SS患者的口眼干等症状，但其作用机制尚不明确［10-11］。水通道蛋白（AQPs）是介导水跨膜转运的一大膜蛋白家族，与视神经脊髓炎、类风湿关节炎（RA）、SS、变应性鼻炎等多种自身免疫性疾病的发病相关［12-16］。AQP5是AQPs的成员之一，主要分布于泪腺、唾液腺、角膜上皮细胞等组织细胞中，参与外分泌腺的腺体分泌过程［17］。研究认为，外分泌腺腺体细胞中AQP5的转运缺陷或表达下调可能与pSS的发病密切相关［17-19］。唾液腺及泪腺中的AQP5表达下调会引起腺泡细胞对水液的渗透功能下降、体液分泌减少，表现出口干、眼干等。因此，AQP5被认为是SS的一个关键生物标志物［20-21］，作为探索中药治疗SS潜在机制的生物学依据。非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠的衍生模型——NOD/Ltj小鼠是目前广泛应用的研究SS最适合的免疫缺陷动物模型，能够自发表现出SS一致症状，血清学可以检测出抗SSA、SSB等自身抗体［22］，该自发模型小鼠在第8周至第16周逐渐出现唾液腺淋巴细胞浸润，第21周时出现唾液腺纤维化［23］。基于上述前期研究基础，本研究拟通过观察化湿润燥方对SS自发模型NOD/Ltj小鼠颌下腺组织病理损伤、腺体功能及颌下腺细胞AQP5表达的影响，探讨化湿润燥方治疗SS的作用及相关机制。1 材料1.1　动物实验组选取健康无特定病原体（SPF）级雌性NOD/Ltj小鼠18只，9周龄，体质量（22.34±1.95） g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0008。SPF级雌性BALB/c小鼠6只，9周龄，体质量（21.28±1.72） g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0001，作为正常组。动物体质量差异无统计学意义。购进小鼠后予以充足水和饲料，适应性喂养3 d，以适应环境。本实验遵循北京中医药大学实验中心有关实验动物管理和使用的规定，通过实验动物伦理委员会批准（批准号BUCM-4-2021090307-3158）。每日12 h光照，12 h黑夜循环，室温20~26 ℃，湿度40%~60%，小鼠饲料、饮用水及垫料等均经过高压灭菌处理，每4 d更换1次垫料。1.2　药物与试剂化湿润燥方由生地黄15 g、百合10 g、茯苓15 g、苏梗10 g、生麦芽10 g、桑叶5 g组成，由中日友好医院中药房提供［中药饮片均购自中国北京同仁堂（集团）有限公司］，由中日友好医院药剂科中药师鉴定并制备成质量浓度为0.72 g·mL-1的药液，经高温消毒后封装，供实验备用。硫酸羟氯喹（HCQ）片（纷乐，上海上药中西制药有限公司，批号H19990263，0.1 g/片）。将上述药物溶解于生理盐水中，制备质量浓度为0.13 g·mL-1的药液，供实验备用。毛果芸香碱（Pilocarpine）、RIPA裂解缓冲液（美国MedChemExpress公司，批号分别为133246、HY-K1001），苏木素-伊红（HE）染色液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司，货号分别为BA4025、25200-056、11965、P1003、10099-141），电化学发光液（ECL）、苯甲磺酰氟（PMSF）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、小鼠抗AQP5抗体（美国Millipore公司，货号分别为WBKLS0500、P7626、HVLP04700、178615），TBST缓冲液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物、Tween-20、柠檬酸钠抗原修复液（50×）（Sodium Citrate Antigen Retrieval Solution）（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为T1085、P1260、T8220、C1032），Tris-buffered saline（TBS）粉末、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白电泳缓冲粉（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为G0001、B1216-2），DAB显色试剂盒、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（中杉金桥生物技术有限公司，货号分别为ZLI-9018、TA-09、ZB-5305）。1.3　仪器DYY-6D型电泳仪、DYCZ-24DN型迷你电泳槽（北京六一仪器厂），JY-ZY5型湿转印系统转印槽（北京君意东方电泳设备有限公司），HC-3018R型高速冷冻离心机（中科中佳科学仪器有限公司），Olympus CK31型正置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。2 方法2.1　动物分组及给药将18只NOD/Ltj小鼠按照体质量随机分为模型组、化湿润燥方组、HCQ组，每组6只。每组小鼠的给药量按人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值计算（70 kg标准体质量成人×9.1=0.02 kg标准体质量小鼠用量）［24］，化湿润燥方组按7.15 g·kg-1·d-1给药［相当于70 kg成人每日55 g的临床等效剂量，该处方剂量为临床有效剂量，已获国家发明专利（专利号ZL 202210973056.X）］，每次用药0.20 mL；HCQ组按1.30 g·kg-1·d-1给药（相当于70 kg成人每日200 mg的临床等效剂量），每次用药0.20 mL。模型组、正常组予等体积生理盐水灌胃，每次0.20 mL。每天1次，连续给药8周。2.2　饮水量测定分别在0周、1周、4周、8周测量各组小鼠前1 d晚5时水壶重量（g1）及次日晚5时的水壶重量（g2）。24 h平均饮水量（mL）=（g1-g2）/（6×1 g·mL-1）。2.3　唾液流率测定各组在8周给药结束后，使用1%戊巴比妥钠，以50 mg·kg-1腹腔注射麻醉小鼠，5 min后再次腹腔注射5 mg·kg-1无菌毛果芸香碱。将适当大小的棉球塞入小鼠口腔中5 min后取出称定湿质量。唾液流率（μL·min-1）=［湿质量（mg）-干质量（mg）］×10/（1 g·mL-1×5 min）。2.4　标本收集各组均在适应性喂养3 d后每天灌胃1次，持续8周，灌胃结束后，禁食水12 h后，经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，脱颈处死，仰位固定于鼠板上，无菌分离颌下腺。2.5　HE染色观察小鼠颌下腺组织病理形态学变化每组小鼠取双侧颌下腺经4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（厚度5 μm），HE染色，光镜下观察，参照Chisholm-Mason进行病理学评分［25］。按照各组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润进行病理程度量化评定（1个浸润灶指每4 mm2有至少50个以上淋巴细胞浸润），无或极少淋巴细胞浸润为0分，少量散在淋巴细胞浸润为1分，淋巴细胞中度浸润（未成灶）、伴有轻度实质损伤为2分，每4 mm21个淋巴细胞浸润灶（4个低倍视野）为3分，每4 mm21个淋巴细胞浸润灶（4个低倍视野）为4分。若评分达到2分以上，则视为发病。用Image Pro Plus v6.0软件计算各组小鼠颌下腺淋巴灶数量、炎症细胞浸润灶面积百分比作为量化染色结果。2.6　颌下腺细胞AQP5的表达测定2.6.1　免疫组化法（IHC）测定颌下腺细胞AQP5蛋白的表达每组选取3只小鼠，经1%戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后脱颈处死，仰位固定，无菌分离双侧颌下腺，4% 多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，连续切片（厚度5 μm）。使用标准方案进行免疫组织化学染色，柠檬酸钠抗原稀释液加入双蒸水稀释50倍，将切片浸泡在抗原修复液（1×）中，95~100 ℃加热约20 min修复抗原，待修复液降至室温后PBS冲洗，5 min，3次；10%的正常山羊血清封闭，湿盒室温孵育20 min后倾去，倾去血清，滴加AQP5一抗（1∶1 000）75 μL后，37℃室温湿盒中孵育2 h，PBS冲洗1 min×3次；滴加二抗（1∶1 000）75 μL，37 ℃室温孵育30 min。新鲜配制DAB溶液，每张片子加1~2滴指示颜色2 min，苏木素染液复染1 min，蒸馏水冲洗，脱水封片，使用 Image Pro Plus v6.0 软件评价各蛋白在组织中的表达。2.6.2　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测AQP5蛋白表达每组取3只小鼠，经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后脱颈处死，仰位固定，无菌分离双侧颌下腺，称重，每20 mg组织加入RIPA裂解缓冲液200 μL（内含PMSF 20 μL），在冰上进行组织匀浆，4 ℃，12 000×g 离心10 min，取上清液，制备10%蛋白电泳胶，根据样品蛋白浓度计算上样量，将Maker及各组样品依次加入孔中，电泳。提前将合适的PVDF在甲醇中活化10 min，浸泡在预冷的转膜液中反复按压，将转膜槽置于冰上，250 mA恒流转膜55 min。将转好蛋白的PVDF膜取出，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入AQP5一抗（1∶100），β-actin（1∶5 000），4 ℃冰箱孵育过夜。第2天取出室温振荡30 min，TBST缓冲液冲洗，10 min，3次，二抗（1∶1 000）孵育，室温摇床振荡反应2 h，TBST缓冲液冲洗，3次×10 min，按A液-B液1∶1比例配置ECL显影液，混匀后均匀滴在膜上，曝光。应用Image J软件分析灰度值，根据灰度值与内参比值计算蛋白的相对表达量，AQP5蛋白水平=AQP5条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。2.7　统计学方法实验数据采用SPSS V17.0软件统计分析，计量资料以x¯±s表示，不服从正态分布以中位数及四分位间距M（IQR）描述；组间比较服从正态分布且方差齐时采用单因素方差分析；不服从正态分布或方差不齐采用非参数检验比较不同组间的差异。采用Spearman等级相关系数计算单样本平行变量间的相关系数，假设检验采用双侧检验，P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对小鼠饮水量的影响造模及治疗前后正常组小鼠饮水量基本保持稳定。第0周、第4周各组小鼠之间饮水量差异无统计学意义。8周后，与正常组比较，模型组小鼠饮水量明显增加，差异具有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，化湿润燥方组小鼠饮水量明显降低，差异具有统计学意义（P0.05）；HCQ组小鼠饮水量有所下降，但差异无统计学意义。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.T001表1化湿润燥方对小鼠饮水量的影响 （x¯±s，n=6）Table 1Effect of Huashi Runzao prescription on water consumption in mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-10周4周8周正常组4.08±0.464.03±0.484.15±0.81模型组4.03±0.384.33±0.285.70±0.531）HCQ组1.33.93±0.194.35±0.304.85±0.31化湿润燥方组7.153.93±0.203.94±0.754.64±0.512）注：与正常组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05；与HCQ组比较3）P0.05（表2-表5同）mL3.2　对小鼠唾液流率的影响8周后，与正常组比较，模型组和HCQ组小鼠唾液流率明显减低，差异具有统计学意义（P0.05）；与模型组比较，化湿润燥方组和HCQ组小鼠唾液流率明显升高（P0.05）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.T002表2化湿润燥方对小鼠唾液流率的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of Huashi Runzao prescription on salivary flow rate in mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-10周8周正常组27.63±1.8027.95±6.16模型组28.44±2.4113.31±3.311）HCQ组1.327.54±2.4120.44±0.602）化湿润燥方组7.1527.40±3.2122.70±2.902）μL·min-13.3　对小鼠颌下腺病理学评分、淋巴细胞浸润水平的影响组织病理评分方面，与正常组比较，模型组病理评分、淋巴细胞浸润灶数目、淋巴浸润灶面积百分比增高，差异具有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，化湿润燥方组的病理评分、淋巴细胞浸润灶数目均明显降低（P0.05）；化湿润燥方组和HCQ组的淋巴浸润灶面积百分比明显降低（P0.05）。与HCQ组比较，化湿润燥方组病理评分、淋巴细胞浸润灶数目降低（P0.05）。见表3和图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.T003表3化湿润燥方对小鼠颌下腺病理学评分、淋巴细胞浸润水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Huashi Runzao prescription on pathological score and lymphocyte infiltration level of mice submandibular gland （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1病理评分/分淋巴细胞浸润灶数目/个淋巴浸润灶面积百分比/%正常组1.25±0.251.00±1.000.01±0.01模型组3.75±0.251）13.33±2.521）4.49±0.841）HCQ组1.33.50±0.2511.67±1.531.64±0.132）化湿润燥方组7.152.25±0.252，3）6.33±2.522，3）0.33±0.122）10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.F001图1化湿润燥方对小鼠颌下腺组织病理形态的影响 （HE，×25）Fig.1Effect of Huashi Runzao prescription on pathological morphology of mice submandibular gland （HE，×25）注：A.正常组；B.模型组；C.HCQ组；D.化湿润燥方组（图2和图3同）3.4　对小鼠颌下腺细胞AQP5蛋白表达的影响IHC结果显示，8周后，与正常组比较，模型组颌下腺细胞AQP5蛋白表达明显下调，差异具有统计学意义（P0.05）；与模型组和HCQ组比较，化湿润燥方组颌下腺细胞AQP5蛋白表达明显有增加，差异具有统计学意义（P0.05）。见表4和图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.T004表4化湿润燥方对小鼠颌下腺IHC AQP5蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Huashi Runzao prescription on AQP5 protein expression detected by immunohistochemistry of mice submandibular gland （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1AQP5正常组5 646.33±372.90模型组1 773.33±93.781）HCQ组1.31 939.33±138.31化湿润燥方组7.155 182.67±373.332，3）10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.F002图2化湿润燥方对小鼠颌下腺IHC检测AQP5蛋白表达的影响（IHC，×100）Fig.2Effect of Huashi Runzao prescription on AQP5 expression detected by immunohistochemistry in mice submandibular gland（IHC，×100）Western blot结果显示，8周后，与正常组比较，模型组颌下腺细胞AQP5蛋白表达明显下调，差异具有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，化湿润燥方组、HCQ组颌下腺细胞AQP5蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P0.05）。与HCQ组比较，化湿润燥方组小鼠颌下腺细胞AQP5蛋白表达增加（P0.05），差异有统计学意义。见表5和图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.T005表5化湿润燥方对小鼠颌下腺AQP5蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Huashi Runzao prescription on AQP5 protein expression of mice submandibular gland （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1AQP5/β-actin正常组0.81±0.03模型组0.33±0.021）HCQ组1.30.45±0.022）化湿润燥方组7.150.58±0.042，3）10.13422/j.cnki.syfjx.20231597.F003图3小鼠颌下腺AQP5蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of AQP5 protein expression in submandibular gland of mice4 讨论SS以唾液腺、泪腺等外分泌腺体结构损害和腺体分泌功能减退为主要特征［26］，98%的SS患者均存在不同程度的口干、眼干症状［1，27］。唾液分泌减少还可引起吞咽障碍、味觉障碍、口腔疼痛、猖獗性龋齿等，十分影响患者生活质量。环境因素如病毒，可能触发具有遗传易感性的个体的唾液腺上皮细胞的激活，树突状细胞激活并诱导高水平干扰素产生。活化的上皮细胞和树突状细胞分泌促炎因子和趋化因子，唾液腺中T、B淋巴细胞激活，进行性浸润，腺体上皮细胞增生后逐渐萎缩，最后纤维组织取代原有腺体结构，从而导致组织损伤以及相应的分泌功能减退［5，28］。目前，SS相关干燥治疗包括药物和非药物疗法，一线局部治疗包括人工泪液、人工唾液、口腔喷雾、凝胶和漱口水等，旨在替代和刺激腺体分泌，减少局部炎症［6，29-30］。除局部用药暂时改善症状外，目前尚无获批的减缓疾病进展的治疗方法［31］。最新临床试验表明，靶向B细胞单抗Ianalumab对SS干燥症状疗效并不理想［32］。SS目前尚缺乏高质量循证医学证据支持的有效药物［33-34］。中医药因其多途径、多靶点的特性，在SS治疗中前景广阔［35-38］。基于不同的诊疗理念，不同医家的治法不尽相同，或治以养阴清热润燥［39-44］，或从“阴火”论治［45-46］，或通利三焦［47-48］，扶阳化气等［49-51］。迄今为止，SS仍缺乏针对性的上市中成药，亟待研发。陶庆文教授在长期临床实践和临床研究中发现，SS乃“内燥”偏盛，脏腑阴阳失调，气血津液运行不畅所致［52-53］。“内燥”可因素体气阴两虚、大病耗伤气阴或饮食不节引起。气虚运化失常易致湿浊内生，饮食不节损伤脾胃又多夹湿，故SS常夹湿。燥与湿存在于SS的不同阶段，相互促进、转化，表现出不同的程度差异。正如清代《医原》中记载：“往往始也病湿，继则湿又化燥……往往始也病燥，继则燥又夹湿”［54］。燥与湿夹杂同病，治疗当润燥相济，以平为期。化湿润燥方即是平调燥湿的有效经验方，具有化湿养阴润燥的功效，能有效缓解SS燥湿夹杂患者的口干症状，且安全性良好。唾液分泌不足是引起口干的最直接原因［55］。AQPs通过影响唾液腺腺泡细胞上的M3受体、肾上腺素受体，调节唾液蛋白质的产生、电解质的释放，从而调节唾液腺功能［56］。因此，AQPs表达异常可引起唾液分泌功能紊乱。SS患者外分泌腺组织中可以检测到多种AQPs［12］。研究发现，AQP1基因治疗能够恢复SS模型小鼠腺体细胞的水液运动［57］，而腺病毒介导的AQP1 cDNA转移通过改善唾液功能能够缓解辐射诱导的动物模型的口干症状［58］。AQP5表达于唾液腺浆液性腺泡上皮细胞［56］，有4个胞浆结构域，其C-末端结构域通过自噬小体或溶酶体突变参与调控AQP5的转运定位，形成唾液分泌的通道［59］。多项研究显示，SS模型小鼠和pSS患者外分泌腺体细胞的AQP5表达明显下调［18，60-61］。敲除AQP5基因后，SS模型小鼠颌下腺分泌功能显著降低［57］，唾液量、渗透压和电解质浓度表现异常［62］。抗AQP5自身抗体可识别位于AQP5的3个细胞外环内的功能性表位，并抑制AQP5介导的水液流动［63］。一项队列研究表明，抗AQP5免疫球蛋白G水平与SS的血清学和组织病理学特征呈正相关［64］。诱导抗AQP5自身抗体表达的小鼠模型中，淋巴细胞浸润同样得到改善［65］。因此，AQP5的表达水平可能与SS的腺体结构损伤与功能减退密切相关。本研究结果表明，SS模型鼠饮水量明显增加、唾液流率明显降低、组织形态学病理明显改变、淋巴细胞浸润灶面积百分比明显升高，表明SS模型小鼠颌下腺的结构损伤及功能存在异常。经过化湿润燥方、HCQ的干预，与模型组小鼠比较，化湿润燥方组、HCQ组的唾液流量、颌下腺指数、颌下腺组织病理学评分显著改善，且化湿润燥方组的病理评分等指标明显低于HCQ组，提示化湿润燥方与HCQ相比，具有更好地改善腺体结构损伤、恢复腺体分泌功能的功效。同时，本研究观察到，SS模型小鼠颌下腺细胞AQP5蛋白表达较正常小鼠显著下调，经化湿润燥方治疗后颌下腺组织AQP5蛋白的表达水平显著上调，提示化湿润燥方改善SS模型小鼠腺体结构损伤和功能减退的作用机制可能与上调AQP5表达有关，但是具体的调节机制和潜在作用途径仍需进一步研究。综上所述，本研究进一步证实了化湿润燥方可以改善SS模型鼠的腺体结构损伤和功能减退，其作用机制可能与上调AQP5蛋白的表达有关，为临床应用化湿润燥方治疗SS进一步提供了生物学依据。