慢性萎缩性胃炎（CAG）是由多因素反复刺激引起的，常常出现上腹部痛或胀等不适症状。其常见病理特征是胃黏膜炎性改变及固有腺体数目的减少甚至消失［1］。CAG伴肠上皮化生或异型增生则被称为萎缩性胃炎癌前病变或胃癌前病变（PLGC），进一步发展则会导致胃癌的发生［2］。异型增生（Dys）或称为上皮内瘤变（IN），世界卫生组织（WHO）在2010版《国际肿瘤组织学分类》中为其正式更名，并将其分为高、低2种不同种类，这使PLGC的临床诊断更规范化［3］。PLGC是CAG进展为胃癌的中间环节，因此，临床上研究胃癌前期病变的发病机制及防治方案具有重要意义。课题组前期研究发现，益气活血法能有效改善萎缩性胃炎癌前病变的肠上皮化生，保护胃黏膜。本实验拟通过观察益气活血法对小鼠自噬因子蛋白及基因表达情况的影响，以揭示益气活血法作用于PLGC的具体机制。1 材料1.1　动物 SPF级昆明种小鼠，雄性，75只，体质量（20±2）g，西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（陕）2017-003。饲养于陕西中医药大学医学科研实验中心动物房。动物房自然明暗周期各半，室温控制在18~29 ℃，相对湿度50%~60%，通风良好。本实验由陕西中医药大学动物实验中心伦理委员会批准（伦理审核编号SUCMDL20190302002）1.2　药物与试剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG，日本TCI公司，批号8WF3N-LC），盐酸雷尼替丁胶囊（江西汇仁药业股份有限公司，批号20180501），黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus的干燥根，由四川新绿色药业科技发展有限公司加工为黄芪免煎颗粒（批号YPK000030104423），三七为五加科植物三七Panax notoginseng的干燥根和根茎（北京同仁堂药业股份有限公司，批号244003638），由陕西中医药大学附属医院杨红莲主任鉴定为正品，叶酸片（常州制药厂有限公司，批号20180623，国药准字H20003143，0.4 mg/片）；苏木素（美国Sigma公司，批号H9627），伊红Y、无水乙醇、二甲苯（国药集团，批号分别为71014544、10009218、10023418），RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（武汉Servicebio公司，批号分别为G2002、G2026、G2003），微管相关蛋白1轻链3（LC3）兔多克隆抗体（美国Proteintech公司，批号00072777），自噬关键分子酵母Atg6同系物1（Beclin1）兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德公司，批号分别为BM0627、BA1051、BA1054），内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（英国Abcam公司，批号Ab9485）。1.3　仪器JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司），RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），DYY-7C型电子显微镜（日本奥林巴斯公司），QuantStudio5型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国ABI公司），Nano-300型微量分光光度计（杭州奥盛公司），Neofuge23R型冷冻离心机（香港利康生物公司），DYCZ-40G型转印电泳仪（北京六一仪器厂），NanoDrop One型超微量分光光度计（美国赛默飞公司）。2 方法2.1　动物模型制备参考文献［4］方法，采用MNNG复合雷尼替丁进行造模。将75只SPF级雄性KM小鼠按随机对照表分为空白组（12只）及造模组（63只），空白组小鼠每天自由摄食饮水，同时每天灌胃去离子水10 mL·kg-1鼠体质量。造模组小鼠每日自由饮用MNNG（MNNG配置时需避光）溶液（150 mg·L-1），同时按10 mL·kg-1鼠体质量灌胃，结合雷尼替丁溶液每日按0.03 g·kg-1灌胃。共造模12周。12周后，随机抽取4只小鼠处死，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片进行苏木素-伊红（HE）染色。依据参考文献［5］，符合PLGC病理要求，提示造模成功。过程中空白组大鼠死亡1只，造模组死亡8只，造模率为87.3%。2.2　分组及给药造模成功后，运用随机数字表法将造模组小鼠分为5组，模型组（10只，去离子水10 mL·kg-1）、益气组（11只，黄芪3.5 g·kg-1）、活血组（10只，三七粉0.7 g·kg-1）、益气活血组（10只，黄芪3.5 g·kg-1+三七粉0.7 g·kg-1）、叶酸组（11只，0.002 g·kg-1）分别给予相应的药物灌胃，连续治疗8周。用药剂量按实验动物与60 kg成人体表面积比等效量核算比率，计算动物的等效剂量，实验时以去离子水配制成所需浓度，4 ℃冰箱保存。2.3　标本采集给予治疗药物8周后取材，脱颈处死，腹部打开，取出胃组织。沿胃大弯处剪开胃组织，并取出全部胃内容物。0.9% NaCl冲洗组织，滤纸吸去多余水分后并展开，观察胃黏膜形态结构后拍照。沿角切迹剪开，胃窦部横向条状取材胃黏膜组织，放于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片进行HE染色。光学显微镜下观察病理情况。取胃体部分，放入冻存管内，-80 ℃冰箱条件下保存，用于蛋白免疫印迹法（Western blot）及Real-time PCR实验。2.4　Western blot检测胃组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1的蛋白表达将胃组织取出，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后切碎放入匀浆管中，提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，完成蛋白变性，低温保存。蛋白转移至硝酸纤维膜上，放入稀释的一抗 LC3Ⅰ、LC3Ⅱ（1∶1 000）， Beclin1（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。在暗室里把曝光液混匀进行曝光，胶片扫描，用Image J软件进行灰度值转换，计算各蛋白的相对表达量。2.5　Real-time PCR检测小鼠胃组织Beclin1和miR216b mRNA表达将组织研磨成细腻的絮状物。提取总RNA，取RNA 2.5 μL使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。反转录为cDNA。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，使用特异性引物合成产物，反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环。计算方法为ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCtt用药组-ΔCt空白组，使用2-ΔΔCt表示各组基因的相对表达量，进行统计分析。引物由武汉Servicebio公司合成，引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230990.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物引物序列（5̓-3̓）长度/bpβ-actin上游GTGACGTTGACATCCGTAAAGA92下游GTAACAGTCCGCCTAGAAGCACBeclin1上游GAGATTGGACCAGGAGGAAGCT126下游GTGCCAAACTGTCCGCTGTGmiR216b上游CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACATTT150下游ACACTCCAGCTGGGAAATCTCTGCAGGCAA注：此表中所有引物均由武汉Servicebio公司提供2.6　统计学分析统计分析采用SPSS 21.0统计软件，数据均以x¯±s表示，组间比较符合正态分布且方差齐采用单因素方差分析，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　对各组小鼠胃黏膜组织病理的影响病理学观察显示空白组小鼠黏膜结构正常。腺体排列紧密，大致未见异常。模型组胃黏膜出现程度不一的萎缩，伴肠上皮化生，黏膜层变薄，固有层腺体数量减少；壁细胞数量明显较少，可见排布疏散；一部分腺体体积扩大，黏膜肌层增厚。与模型组比较，各治疗组病理均有改善，其中以益气活血组最为明显，腺体排列整齐，数量较前明显多。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230990.F001图1益气活血法对各组小鼠胃黏膜组织病理的影响 （HE，×200）Fig.1Effect of Yiqi Huoxue method on pathology of gastric mucosa in mice of each group （HE，×200）注：A.空白组；B.模型组；C.益气组；D.活血组；E.益气活血组；F.叶酸组（图2同）3.2　对各组小鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响与空白组比较，模型组小鼠胃组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达明显降低（P0.05）。与模型组比较，益气组、活血组及叶酸组小鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达明显升高（P0.05），益气活血组小鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达显著升高（P0.01）。与空白组比较，模型组小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低（P0.05）。与模型组比较，益气组、活血组及叶酸组小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显升高（P0.05），益气活血组小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著升高（P0.01）。见图2、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230990.F002图2各组小鼠胃组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of LC3Ⅰ，LC3Ⅱ and Beclin1 protein expression in gastric tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20230990.T002表2益气活血法对各组小鼠胃组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的影响 （x¯±s）Table 2Effect of Yiqi Huoxue method on expression of LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin1 protein and LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ in gastric tissue of mice in each group （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1LC3Ⅰ/GAPDHLC3Ⅱ/GAPDHBeclin1/GAPDHLC3Ⅱ/LC3Ⅰ空白组1110a0.21±0.051.23±0.090.93±0.086.12±0.22模型组1010a0.05±0.011）0.17±0.021）0.60±0.011）3.10±0.101）益气组113.50.12±0.022）0.54±0.012）0.74±0.022）4.52±0.022）活血组100.70.11±0.012）0.49±0.052）0.74±0.012）4.49±0.022）益气活血组103.5+0.70.17±0.013）0.98±0.063）0.82±0.023）5.57±0.053）叶酸组110.0020.10±0.012）0.46±0.022）0.71±0.022）4.44±0.042）注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01；a.mL·kg-1（表4同）3.3　对各组小鼠Beclin1、miR216b mRNA表达的影响与空白组比较，模型组小鼠胃组织Beclin1 mRNA表达明显降低（P0.05），miR216b mRNA表达明显升高（P0.05）。与模型组比较，各给药组小鼠胃组织Beclin1 mRNA表达明显升高（P0.05），miR216b mRNA表达明显降低（P0.05）。以益气活血组改善较为明显。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230990.T003表3益气活血法对各组小鼠胃组织Beclin1、miR216b mRNA表达的影响 （x¯±s）Table 3Effect of Yiqi Huoxue method on expression of Beclin1 and miR216b mRNA in gastric tissue of mice in each group （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1Beclin1miR216b空白组1110a1.60±0.070.85±0.07模型组1010a0.56±0.051）3.86±0.041）益气组113.50.94±0.022）1.73±0.022）活血组100.70.84±0.022）1.84±0.062）益气活血组103.5+0.71.07±0.022）1.66±0.052）叶酸组110.0020.64±0.062）2.09±0.052）4 讨论祖国传统医学对于PLGC没有明确指出其归属于哪个病名。后世医家依据其胃脘胀满、疼痛、反酸、嗳气的症状，将其定义为“胃痞”。目前认为本病的病性属于“本虚标实”。“本虚”以脾胃气虚、阳虚为主，脾胃虚弱，运化功能失调，无以布输精微物质予全身，正气不足，实邪停滞，日久更为虚弱；“标实”是脾胃气虚，无力输布气血津液运行，导致气机阻滞，水湿停聚，瘀血内结。王道坤教授认为本病的病机以脾胃亏虚为本，瘀毒内结为标，自拟化痰消痞方以温补脾胃兼益气化瘀［6］。王义相［7］采用2种不同治疗方法对84例PLGC患者进行观察，最后发现中药组治疗率高达92.9%。李洁等［8］临床通过扶正通络汤与胃复春对PLGC给予对比治疗发现，扶正通络汤对于改善胃黏膜情况，逆转肠化生疗效显著。戴辉煌等［9］认为本虚是PLGC病机的关键，六君子汤是他临证治疗的常用方，方中黄芪具有修复胃黏膜，增强胃黏膜屏障作用。刘庆生等［10］通过动物实验发现益气活血法可在一定程度上防治PLGC的发展。参考古今文献及现代临床经验认为本病的病机关键属“脾虚血瘀”，益气活血法为治疗本病的常用方法。课题组前期研究发现以黄芪、三七为代表的益气活血法可以明显减轻PLGC大鼠胃黏膜的萎缩及肠化情况，升高大鼠血清胃蛋白酶原（PG）Ⅰ/PGⅡ及胃泌素（G17）水平［11］。并且还发现黄芪、三七可以通过影响Hedgehog通路的下游因子胶质瘤相关癌基因同源蛋白（Gli）-1/Gli-2/Gli-3、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、苏氨酸蛋白激酶Fused抑制因子（SuFu）的表达来对PLGC进行干预［12］。因此课题组认为益气活血法为治疗本病的基本治法，而黄芪、三七可作为益气活血法的代表药对，临床上以黄芪、三七为主治疗PLGC亦取得了很好的疗效。近期研究显示，细胞自噬对CAG损伤胃黏膜的修复有重要作用［13］，研究PLGC与自噬的具体发生机制成为现在消化界的热点之一。自噬是在应激状态下，将细胞内坏死的物质运到溶酶体内降解消化［14］。研究表明应激状态下自噬活性迅速激活，形成大量自噬体，会严重影响疾病的发生和发展［15］。在肿瘤的发生中，细胞自噬常常显示为两面性，早期细胞自噬常可保护机体抑制癌变，而肿瘤一旦形成，细胞自噬为癌细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长。有Meta分析指 Beclin1可以作为一个可靠的胃癌预后指标，分析结果提示Beclin1的高表达有利于胃癌患者的预后［16］。YU等［17］检测了胃癌组织和癌旁组织中Beclin1的表达水平，并在多种胃癌细胞系中进行了验证，发现Beclin1的高表达与胃癌的良好预后相关，而Beclin1的低表达与胃癌的转移和低分化有关。马陆军等［18］研究发现Beclin1蛋白在cag、癌前病变、胃癌中的表达率逐渐降低，证明Beclin1诱导的细胞自噬在胃黏膜修复及更新方面发挥作用。Beclin1是酵母Atg6的同类物，位于染色体17q21基因，该基因突变可导致肿瘤形成［19］。miRNAs是一类长21~23个核苷酸的非编码RNA，miRNA可以与靶mRNA的3'UTR区完全或者非完全结合，直接降解基因的mRNA或者在翻译后水平抑制靶基因的表达。课题组经过查找数据库发现，miR216b能够与Beclin1的3'UTR区域中的579~585段结合。程艳香等［20］发现miR216b可靶向作用于Beclin1，并对其进行负向调节，从而影响细胞自噬水平。因此课题组推测miR216b能够靶向Beclin1 mRNA，抑制Beclin1的表达，从而对Beclin1介导的细胞自噬发挥负调控的作用。本实验结果中，PLGC模型组miR216b的表达较高，而Beclin1的趋势与miR216b正好相反，提示miR216b对Beclin1有负向调控作用，这与课题组前期的推测相符。本研究结果显示，在MNNG诱导的PLGC的模型中，益气活血法可以明显改善小鼠胃黏膜肠化生、IN情况。经过益气活血法干预治疗后，PLGC小鼠胃组织LC3Ⅰ、LC3 Ⅱ、Beclin1蛋白表达量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1的基因表达量均明显升高，其中以益气活血组最为明显，提示益气活血法可能对自噬具有激活作用。小鼠胃组织miR216b的基因表达情况中，模型组表达量最高，益气活血组表达量较其他治疗组明显下降，提升益气活血法可抑制miR216b的表达。因此，以黄芪、三七为代表的益气活血法治疗PLGC的作用机制可能为通过抑制miR216b的表达，激活Beclin1，从而促进自噬，发挥修复胃黏膜的作用。