清心莲子饮收录于《古代经典名方目录（第一批）》，出自《太平惠民和剂局方》，由黄芩、麦冬、地骨皮、车前子、甘草（炙）、石莲肉、茯苓、黄芪（炙）、人参配伍而成，可清心火、交心肾、益气阴、止淋浊，用于治疗小便白浊、遗精涩沥、便赤如血、五淋滞下、烦热消渴等证，适用于偏虚性慢性泌尿系统疾病，在神经衰弱、早期糖尿病肾病等方面也有显著疗效［1］。清心莲子饮基准样品经水提、浓缩、干燥制成，可能含有黄酮［2］、高异黄酮［3］、生物碱［4］、苯乙醇苷、环烯醚萜［5］、水溶性多糖［6-7］、氨基酸［8］、三萜皂苷等化学成分［9］。通过文献检索发现，有关清心莲子饮的研究目前多集中于临床药效及其加减方的应用，缺乏系统性的物质基础研究。有研究人员采用高效液相色谱法（HPLC）分别测定清心莲子饮中人参皂苷Re、Rg1、Rb1［10］，黄芩苷［11］，甘草酸铵［11］，京尼平苷酸［12］的含量，但单一控制1~2味药材的特征成分显然是不太符合中药复方的整体观，因此，亟待加强该方的整体质量评价研究。因此，笔者立足于经典名方开发，采用HPLC建立清心莲子饮基准样品的特征图谱，运用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱法（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）对其化学成分进行定性分析，并建立其组方药味麦冬、地骨皮、莲子、茯苓、黄芪及人参鉴别的薄层色谱法（TLC），为该经典名方的开发和质量控制提供参考依据。1 材料LC-2030C 3D、LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），UltiMate 3000型超高效液相色谱仪（美国戴安公司），LTQ Orbitrap velos pro型质谱仪（美国Thermo Fisher公司），XA105、ML-104/02型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，CP423C型电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］，WHLL-45BE型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），ZF-90型多功能暗箱式紫外透视仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸铵、黄芩苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品（批号分别为111920-201606、110731-200615、715-200010、111530-201713、110704-201223、110754-200319，纯度均98%），麦冬、地骨皮、莲子、茯苓、黄芪及人参对照药材（批号分别为121013-201711、121087-201707、121121-201205、121117-201509、120974-201612、120917-201712）均购自中国食品药品检定研究院，人参皂苷Rg1对照品（中国计量科学研究院，批号GBW09204，纯度99%），硅胶60薄层色谱板（德国Merck公司），水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸为质谱纯，其他试剂均为分析纯。黄芩、麦冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参饮片均由葵花药业集团（冀州）有限公司提供。各饮片经中国中医科学院中药研究所赵海誉研究员鉴定，基原分别为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis的干燥根，百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus的干燥块根，茄科植物枸杞Lycium chinense的干燥根皮，车前科植物车前Plantago asiatica的干燥成熟种子，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎，睡莲科植物莲Nelumbo nucifera的干燥成熟种子，多孔菌科真菌茯苓Poria cocos的干燥菌核，豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus var. mongholicus的干燥根，五加科植物人参Panax ginseng的干燥根和根茎，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）的相关规定，饮片具体信息见增强出版附加材料。2 方法与结果2.1　清心莲子饮基准样品的制备参照文献［1］中确定的方法制备15批清心莲子饮基准样品，编号JZYP-01~JZYP-15。2.2　特征图谱方法的建立2.2.1　色谱条件YMC Hydrosphere C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0~10 min，5%~20%A；10~20 min，20%A；20~25 min，20%~24%A；25~40 min，24%~30%A；40~55 min，30%~50%A；55~65 min，50%~100%A；65~75 min，100%A；75~75.1 min，100%~5%A；75.1~90 min，5%A），柱温35 ℃，检测波长360 nm，流速1 mL·min-1，进样量20 μL。2.2.2　供试品溶液的制备精密称取清心莲子饮基准样品粉末（过80目筛）0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入含0.5%冰乙酸的50%甲醇50 mL，称定质量，密塞，超声提取40 min（250 W，40 kHz），放凉，加入含0.5%冰乙酸的50%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。2.2.3　对照品溶液的制备精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸铵、黄芩苷及毛蕊花糖苷对照品适量，加含0.5%冰乙酸的50%甲醇制成每100 mL含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.3 mg、甘草酸铵1 mg、黄芩苷7.5 mg及毛蕊花糖苷0.6 mg的混合对照品溶液，摇匀，即得。2.2.4　精密度试验称取清心莲子饮基准样品JZYP-06约0.1 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。按2.2.1项下色谱条件测定，连续测定6次，计算特征峰1~15相对保留时间（tR）的相对标准偏差（RSD）均0.1%，相对峰面积的RSD均1.0%，表明仪器精密度良好。2.2.5　重复性试验称取清心莲子饮基准样品JZYP-06共6份，按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液，按2.2.1项下条件测定，计算特征峰1~15相对tR的RSD均0.1%，相对峰面积的RSD均2.0%，表明该方法重复性良好。2.2.6　稳定性试验取同一基准样品的供试品溶液，室温放置，分别于制备后0、4、8、12、20、24 h按2.2.1项下条件测定，计算特征峰1~15相对tR的RSD均0.2%，相对峰面积的RSD均1.2%，说明供试品溶液至少在24 h内稳定性良好。2.2.7　样品测定取15批清心莲子饮基准样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下条件测定，特征图谱见图1，各特征峰的相对tR见增强出版附加材料。结果发现15批清心莲子饮基准样品中特征峰1~15相对tR的平均值分别为0.414、0.499、0.533、0.558、0.648、0.888、0.943、1.000、1.082、1.143、1.209、1.284、1.421、1.502、1.641，RSD均≤3.0%。10.13422/j.cnki.syfjx.20221049.F001图115批清心莲子饮基准样品的HPLC特征谱Fig. 1HPLC specific chromatograms of 15 batches of Qingxin Lianziyin benchmark samples注：S1~S15.JZYP-01~JZYP-152.2.8　特征峰的标定及归属在清心莲子饮基准样品的特征图谱中标定了15个特征峰，以8号峰为参照峰，特征峰1~15的相对tR分别为0.412、0.493、0.526、0.550、0.639、0.889、0.938、1.000、1.085、1.143、1.207、1.283、1.423、1.506、1.647。通过比对对照品的紫外吸收波长及tR，确定3号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为黄芩苷。通过与单味饮片样品比对，确定1、6、7、14号峰来自于甘草；3号峰来自于车前子和黄芩；2、4、5、8~13、15号峰来自于黄芩，特征图谱见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20221049.F002图2清心莲子饮基准样品及单味饮片的特征谱Fig. 2Specific chromatograms of Qingxin Lianziyin benchmark samples and its decoction pieces2.2.9　特征图谱的相似度检测采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），选择中位数法，时间窗宽度0.10 min，对色谱峰进行多点校正、自动匹配，生成对照图谱，计算样品JZYP-01~JZYP-15的特征图谱相似度分别为0.996、0.999、0.986、0.996、0.998、0.989、0.999、0.998、0.995、0.997、0.998、1.000、0.998、0.998、0.994，说明15批基准样品的化学成分基本稳定，符合特征图谱研究要求。2.2.10　系统适应性考察在LC-20AT型和1260型高效液相色谱仪上分别使用YMC Hydrosphere、YMC Triart、SilGreen、Phenomenex Gemini、SB-C18等十八烷基键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行检测，结果显示，各共有峰间分离度均1.5，其他成分对待测成分的结果无干扰，说明建立的色谱条件系统适应性良好。其中偏水性的YMC Hydrosphere C18色谱柱的分离效果最佳，采用3根YMC Hydrosphere C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序列号分别为112YA80198、123HA80197、110EA80222）进行检测，谱图结果表明重复性良好。2.3　清心莲子饮基准样品的化学成分解析2.3.1　检测条件色谱条件为采用柱后分液（分流比3∶1），进样量2 μL，其余色谱条件同2.2.1项。质谱条件为电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式下扫描，毛细管温度350 ℃，喷雾电压3.4 kV，鞘气（N2）流速35 arb，辅助气（N2）流速10 arb，一级质谱进行全扫描（分辨率30 000，扫描范围m/z 50~1 500），二级及三级质谱采用数据依赖性扫描。数据采集和分析采用Xcalibur 4.1、Mass Frontier 7.0软件。2.3.2　供试品溶液的制备同2.2.2项。2.3.3　UHPLC-LTQ-Orbitrap MS成分分析采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技术，在正、负离子模式下对清心莲子饮基准样品进行分析，总离子流图见增强出版附加材料，根据质谱提供的离子信息结合化合物裂解规律，共鉴定了100个成分，包括黄酮类、有机酸类、皂苷类、氨基酸类，初步明确了清心莲子饮基准样品的物质基础，见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20221049.T001表1清心莲子饮基准样品中化学成分的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS鉴定Table 1Identification of chemical components in Qingxin Lianziyin benchmark samples by UHPLC-LTQ-Orbitrap MSNo.离子模式tR/minm/z实测值m/z理论值δ/ppm化合物分子式碎片离子1ESI+2.56175.119 1175.119 00.62精氨酸［13-14］C6H14N4O2158、116、602ESI+3.2276.039 176.039 3-2.83甘氨酸［13，15］C2H5NO23ESI+3.2690.054 890.055 0-1.50丙氨酸［13，15］C3H7NO24ESI+3.30106.049 8106.049 9-0.37丝氨酸［13，15］C3H7NO388、605ESI+3.33120.065 6120.065 50.50苏氨酸［13，15］C4H9NO3102、746ESI+3.43148.060 5148.060 40.65谷氨酸［13，15］C5H9NO47ESI+3.57134.044 9134.044 80.71天冬氨酸［13］C4H7NO4102、748ESI-3.58711.215 4711.213 13.23芹糖甘草苷［16］C32H40O18549、417、255、135、1199ESI+3.60118.086 2118.086 3-0.47缬氨酸/甜菜碱［13，15］C5H11NO27010ESI+3.63116.070 7116.070 60.39脯氨酸［13，15］C5H9NO27011ESI-3.79341.106 9341.107 8-2.84蔗糖［17］C12H22O11179、16112ESI-5.12133.013 6133.013 13.39苹果酸C4H6O5115、7113ESI+5.16132.101 9132.101 9-0.04异亮氨酸C6H13NO28614ESI+5.28268.104 1268.104 00.26腺苷［18］C10H13N5O413615ESI-6.40191.018 7191.018 60.27柠檬酸C6H8O711116ESI+7.37166.086 2166.086 3-0.15苯丙氨酸［13，17］C9H11NO212017ESI-9.15373.111 8373.112 9-1.13京尼平苷酸［19］C16H22O10221、167、149、12318ESI-10.21359.095 6359.097 3-4.55丁香酸葡萄糖苷［14］C15H20O1019ESI-11.19487.144 8487.144 60.46肉苁蓉苷F［20］C21H28O1320ESI+15.74565.154 2565.155 2-1.67夏佛塔苷［16］C26H28O14547、475、445、385、35521ESI+17.95581.185 2581.186 5-2.14liquiritigenin-7，4ʹ-diglucoside［16］C27H32O14419、257、23922ESI+19.49549.159 5549.160 3-1.43白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷［21］C26H28O1325523ESI+19.71447.128 1447.128 6-1.17毛蕊异黄酮葡萄糖苷［22］C22H22O10285、27024ESI-20.06339.086 8339.086 31.40甲基麦冬高黄酮A［23］C19H16O625ESI-20.15549.157 2549.160 3-5.53芹糖甘草苷［24］C26H30O13417、255、153、13526ESI-20.18417.116 1417.118 0-4.60甘草苷［25］C21H22O9255、153、135、119、9127ESI+20.30433.112 2433.112 9-1.65芹菜素葡萄糖苷［17］C21H20O10215、243、15328ESI-20.48433.111 0433.112 9-4.46南酸枣苷［16］C21H22O10271、15129ESI-21.11623.193 7623.197 0-5.43毛蕊花糖苷［26］C29H36O15477、461、315、25130ESI-21.19417.117 2417.118 0-2.04异甘草苷［16，25］C21H22O9297、135、119、9131ESI+22.28549.159 6549.160 3-1.31白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷［21］C26H28O1325532ESI-24.34561.161 3561.160 31.88黄甘草苷［16］C27H30O13267、25233ESI+27.79463.086 4463.087 1-1.605，7-二羟基-2ʹ-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C21H18O1231534ESI+34.78431.132 9431.133 7-1.76芒柄花苷［17］C22H22O926935ESI+34.99489.137 6489.139 1-3.08毛蕊异黄酮-7-O-β-D-（6″-乙酰基）-葡萄糖苷［17］C24H24O11285、270、253、225、13736ESI-35.02329.101 0329.102 0-3.08麦冬二氢高异黄酮AC18H18O637ESI+35.12433.112 0433.112 9-2.13大波斯菊苷或其异构体［26］C21H20O1027138ESI-35.81623.193 2623.197 0-6.11异毛蕊花糖苷［26］C29H36O15477、461、315、25139ESI+35.87347.075 6347.076 1-1.605，7，2ʹ，5ʹ-四羟基-8，6ʹ-二甲氧基黄酮［21］C17H14O8332、317、31440ESI-39.36267.028 7267.028 8-0.41考迈斯托醇［25］C15H8O541ESI+39.61463.087 1463.087 1-0.075，7-二羟基-2ʹ-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C21H18O1231542ESI+39.61447.092 7447.092 21.24黄芩苷C21H18O1127143ESI-39.72353.100 7353.102 0-1.32甘草黄酮醇/甘草异黄酮醇［25］C20H18O644ESI+40.35449.107 5449.107 8-0.80木犀草苷［20］C21H20O1128745ESI-40.88463.158 3463.159 9-3.482ʹ-羟基-3ʹ，4ʹ-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷［17］C23H28O1030146ESI-43.01461.106 2461.107 8-3.55红车轴草素-7-O-β-D-葡萄糖苷［17］C22H22O1147ESI+43.02477.101 9477.102 8-1.855，7，8-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［27］C22H20O1230148ESI+44.31433.112 6433.112 9-0.65大波斯菊苷或其异构体［26］C21H20O1049ESI+45.22447.092 5447.092 20.63黄芩苷异构体［21］C21H18O1127150ESI-46.17299.055 9299.055 03.10金圣草素［20］C16H12O651ESI+46.18315.085 9315.086 3-1.38二羟基二甲氧基异黄酮［16］C17H14O6300、283、25552ESI+46.33477.102 3477.102 8-1.035，7，2ʹ-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C22H20O1230153ESI+46.33301.070 3301.070 7-1.08三羟基甲氧基黄酮［21］C16H12O628654ESI+46.59431.096 9431.097 3-0.82白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C21H18O1026955ESI+46.66461.108 0461.107 80.29千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C22H20O11285、27056ESI+48.38477.102 0477.102 8-1.665，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C22H20O1230157ESI+48.41301.070 4301.070 7-0.88韧黄芩素Ⅱ［21］C16H12O628658ESI-48.55505.169 4505.170 4-2.002ʹ-羟基-3ʹ，4ʹ-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-（6″-乙酰基）-葡萄糖苷［17］C25H30O1130159ESI+48.79461.107 9461.107 80.16汉黄芩苷［21］C22H20O11285、27060ESI+48.96473.144 0473.144 2-0.51formononetin-7-O-glc-6″-O-acetate［16］C24H24O10269、254、21361ESI+49.18491.117 6491.118 4-1.685，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷［21］C23H22O1262ESI+49.18315.085 9315.086 3-1.38二羟基二甲氧基黄酮［21］C17H14O6300、285、28263ESI-49.72799.478 7799.483 80.93人参皂苷Rf或其异构体［28］C42H72O1464ESI+49.89287.055 4287.055 01.20木犀草素［20］C15H10O615365ESI-50.16461.105 6461.107 8-4.88高车前苷［20］C22H22O1166ESI+50.38317.101 6317.102 0-1.28二羟基二甲氧基二氢黄酮［16］C17H16O6299、289、183、163、13567ESI-51.911 077.584 51 077.584 00.44人参皂苷Rb3或其异构体［28］C53H90O22945、783、45968ESI+52.03331.080 8331.081 2-1.18三羟基二甲氧基黄酮［21］C17H14O7316、30169ESI-52.24269.044 0269.044 4-1.52芹菜素［15］C15H10O5251、223、169、15370ESI+52.34271.059 9271.060 1-0.81黄芩素［21］C15H10O5253、242、225、16971ESI-53.12945.543 8945.541 72.13人参皂苷Rd或其异构体［28］C48H82O1872ESI-54.75255.065 1255.065 2-0.30甘草素［25］C15H12O4135、119、9173ESI-55.12267.064 8267.065 2-1.37芒柄花素［17］C16H12O425274ESI+56.98303.122 0303.122 7-2.48二羟基二甲氧基异黄酮［16］C17H18O5193、181、167、14975ESI+58.06301.106 7301.107 1-1.30黄芪紫檀烷［16］C17H16O516776ESI-59.42821.389 4821.395 4-7.32甘草皂苷H2/K2［16，25］C42H62O1677ESI-59.53283.059 4283.060 1-2.51毛蕊异黄酮［17］C16H12O526878ESI+59.56823.407 4823.411 1-4.51甘草酸或甘草皂苷H2/K2［16］C42H62O16647、45379ESI+59.6285.075 6285.075 8-0.46汉黄芩素或千层纸素A［21］C16H12O527080ESI+60.06375.107 2375.107 4-0.54黄芩黄酮Ⅱ［21］C19H18O8360、345、32781ESI+60.06315.086 0315.086 3-1.092ʹ，7-dihydroxy-4ʹ，5ʹ-dimethoxyisoflavone或其异构体［16］C17H14O6300、283、25582ESI+60.29255.064 9255.065 2-1.32白杨素［21］C15H10O483ESI+60.45839.405 2839.406 0-0.91甘草皂苷G2［16］C42H62O1746984ESI+60.60315.085 8315.086 3-1.792ʹ，7-dihydroxy-4ʹ，5ʹ-dimethoxyisoflavone或其异构体［16］C17H14O6300、283、25585ESI-60.66353.100 5353.102 0-1.45甘草黄酮醇［25］C20H18O686ESI-61.22821.390 6821.395 4-5.91甘草酸或甘草皂苷H2/K2［16，25］C42H62O1687ESI+61.38345.096 0345.096 9-2.52二羟基-三甲氧基黄酮［21］C18H16O733088ESI-61.41513.317 8513.321 1-6.46茯苓新酸D［29］C31H46O648189ESI-61.51367.11 7367.117 6-1.68甘草香豆素［16］C21H20O6352、30990ESI-62.22353.100 4353.102 0-1.57甘草黄酮醇/甘草宁L/甘草异黄酮醇［25］C20H18O691ESI-64.12351.084 6351.086 3-1.69甘草异黄酮B［25］C20H16O692ESI-64.22485.323 5485.326 2-5.55茯苓酸G［30］C30H46O5441、423、467、35393ESI-64.95341.101 8341.102 0-0.63甲基麦冬黄烷酮A［31］C19H18O694ESI-65.17481.329 6481.331 2-3.36多孔菌酸C［32］C31H46O4421、311、435、40395ESI-65.22471.344 7471.346 9-4.6416α-hydroxytrametenolic acid［32］C30H48O4409、337、42596ESI-65.26327.121 8327.122 7-2.66甲基麦冬黄烷酮B［31］C19H20O5206、178、16397ESI-65.75497.322 5497.326 2-7.38茯苓新酸A［30］C31H46O5419、479、35198ESI-65.75483.343 8483.346 9-6.303-表去氢土莫酸/去氢土莫酸［30］C31H48O437399ESI-68.67513.355 9513.357 5-3.02poricoic acid HM［30］C32H50O5451、467、495100ESI-69.38527.374 2527.373 12.10茯苓酸［30］C33H52O5465、481、4492.4　TLC鉴别2.4.1　供试品溶液的制备取清心莲子饮基准样品粉末1.0 g，加甲醇25 mL使溶解，超声40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加入乙酸乙酯40 mL，充分振摇，放置分层。乙酸乙酯层蒸干后取残渣，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液A；水层加入水饱和正丁醇30 mL，充分振摇后放置分层，取正丁醇部分加入氨试液60 mL，充分振摇，放置分层，分离正丁醇部分，蒸干，残渣加入甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液B。2.4.2　麦冬取麦冬对照药材1.0 g，加甲醇25 mL超声提取40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺麦冬的麦冬阴性基准样品，同供试品溶液A的制备方法制成阴性样品溶液。吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液A 20 μL、阴性样品溶液20 μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-三氯甲烷（7∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视，见图3A。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。10.13422/j.cnki.syfjx.20221049.F003图3清心莲子饮基准样品的TLC鉴别Fig. 3TLC identification of Qingxin Lianziyin benchmark samples注：A.麦冬（1，2.对照药材；3~17.基准样品；18，19.阴性样品）；B.地骨皮（1~15.基准样品；16.阴性样品；17.对照药材）；C.莲子（1，2.对照药材；3~17.基准样品；18，19.阴性样品）；D.茯苓（1.阴性样品；2~16.基准样品；17.对照药材）；E.黄芪（1.对照药材；2~16.基准样品；17.阴性样品）；F.人参（1，19.阴性样品；2，21.混合对照品从下往上分别为人参皂苷Rb1、Re、Rg1；3，20.对照药材；4~18.基准样品）2.4.3　地骨皮取地骨皮对照药材1.0 g，加甲醇25 mL超声提取40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺地骨皮的地骨皮阴性基准样品，同供试品溶液A的制备方法制成阴性样品溶液。吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液A 20 μL、阴性样品溶液20 μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-丙酮（7∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，见图3B。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2.4.4　莲子取莲子对照药材1.0 g，加甲醇25 mL超声提取40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺莲子的莲子阴性基准样品，同供试品溶液A的制备方法制成阴性样品溶液。吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液A 20 μL、阴性样品溶液20 μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-丙酮（7∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，立即喷以磷钼酸硫酸溶液（磷钼酸2 g，加水20 mL使溶解，缓缓加入硫酸30 mL混匀），在105 ℃加热至斑点显色清晰，见图3C。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2.4.5　茯苓取茯苓对照药材1.0 g，加甲醇25 mL超声提取40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺茯苓的茯苓阴性基准样品，同供试品溶液A的制备方法制成阴性样品溶液。吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液A 10 μL、阴性样品溶液10 μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，立即喷以磷钼酸硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，见图3D。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2.4.6　黄芪取黄芪对照药材1 g，加甲醇25 mL超声提取40 min，定性滤纸滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺黄芪的黄芪阴性基准样品，同供试品溶液A的制备方法制成阴性样品溶液。吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液A 5 μL，阴性样品溶液20 μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，见图3E。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2.4.7　人参取人参对照药材1.0 g，加水3 mL搅拌湿润，加水饱和正丁醇25 mL，超声处理30 min，定性滤纸滤过，向滤液中加入氨试液60 mL，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。制备缺人参的人参阴性基准样品，同供试品溶液B的制备方法制成阴性样品溶液。取人参皂苷 Rb1、人参皂苷Re及人参皂苷Rg1对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品及对照药材溶液各2 μL、供试品溶液B 3 μL、阴性样品溶液3 μL分别点于同一硅胶G薄层板上，参照2020年版《中国药典》（一部）“人参”项下TLC鉴别方法展开、显色［33］，见图3F。结果发现阴性对上述鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。3 讨论与总结3.1　特征图谱供试品溶液制备方法的确定采用单因素试验考察了提取溶剂（甲醇、含0.5%冰乙酸的甲醇）、供试品溶液质量浓度（2、4、10 g·L-1）、超声时间（20、40、60 min）及甲醇体积分数（50%、80%、100%）对特征成分峰面积的影响。结果显示，甲醇和含0.5%冰乙酸的甲醇对特征成分的提取率基本相同，由于苯乙醇苷类成分在酸性溶液中更加稳定，故选择含0.5%冰乙酸的甲醇；甲醇体积分数为50%和供试品溶液质量浓度为2 g·L-1时，提取更加充分；超声40 min和60 min的提取率基本相同，为节约时间，选择超声时间40 min。3.2　色谱条件的确定采用十八烷基键合硅胶色谱柱，考察了乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液等流动相系统，经过反复摸索，最终选择乙腈-0.2%甲酸水溶液。柱温对特征图谱影响不大。在基准样品特征图谱中能够明显发现毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、黄芩苷、甘草酸、黄芩素、汉黄芩素等成分，由于这些成分紫外吸收值相差较大，经过筛选发现252、280、360 nm波长下清心莲子饮基准样品的特征图谱较好，但同一检测波长下最多能够指认3味药材。通过综合考量，选定特征图谱检测波长360 nm。3.3　TLC供试品溶液制备方法的确定预试验发现麦冬、地骨皮、莲子、黄芪、茯苓按2020年版《中国药典》（一部）收载的方法制备成样品后分离效果不佳，故分别对清心莲子饮基准样品粉末进行甲醇超声、水溶解后有机溶剂萃取等处理，并对浓缩后的上述溶液进行预试。结果发现甲醇超声提取的溶液挥干后用水溶解，再经乙酸乙酯萃取后的乙酸乙酯层，能完成上述5味药材的TLC鉴别。为尽量节约样品、简化操作，笔者将乙酸乙酯萃取后的水层用水饱和正丁醇萃取，萃取后的正丁醇部分再经氨试液碱化后能够完成人参的TLC鉴别。3.4　总结本研究建立了清心莲子饮基准样品的特征图谱，并对其化学成分进行了指认及来源归属，还建立了清心莲子饮基准样品中部分药味的TLC鉴别方法，可为该复方的质量控制提供参考。然而，目前的研究还局限于小规模实验，尚需根据实际生产情况进行适当调整［34］。