动物模型是医学基本研究平台之一，是再现人类疾病发生、发展和转归过程的主要载体。建立规范准确的动物模型，是中医药研究发展的重要前提条件。医学研究不仅要立足于临床实践，还需将西医之“疾病”与中医之“证候”有效结合［1］，在“病-证-治”结合思路指导下建立的动物模型［2-3］，才能使中医药科学研究更具针对性、严谨性、科学性。由于中医生殖医学领域中，病理生理的研究涉及到相关道德与伦理约束，人体妊娠实验屡受争议，中医药生殖领域相关研究若要突破瓶颈，尤其依赖动物、细胞、类器官等研究平台的进一步发展［4］。妇科病证结合自然流产模型由罗颂平教授团队率先创立，以羟基脲结合米非司酮（俗称Ru486）干预为例，提出了肾精亏损自然流产模型建立的经典方案［5］。随后，自然流产模型相关研究不断创新，建立了系列“病-证-治”结合的动物模型。遗憾的是，目前中医病证动物模型多为单证型，且分子生物学标记物（Marker）评价指标具有明显局限性、片面性，不利于深入研究。故如何控制证候与治法（方-证）的稳定性、可重复性和临床贴合性，寻找客观评价标记物，是目前亟待解决的问题。本研究以临床自然流产基本特征为准绳，以苗明三课题组提出的赋值法［6-7］评判现有的“病-证-治”结合自然流产动物模型特点，融入单细胞多模态组学概念，以多维度、高分辨率特点及多算法联合对细胞亚群实现全面精准划分，同时获取并整合单细胞基因、表观遗传、染色质及蛋白等多重组学信息，从而揭示病-证造模方法、方-证药物对不同细胞群的轨迹调控机制，寻找并鉴定诊治关键Marker，以期为自然流产病因病机及新型靶向药物的毒理、药理研究提供全新的研究载体。1 病证结合自然流产动物模型鉴定指标评价进展我国将妊娠不足28周，胎儿体质量1 000 g而妊娠终止者，称为自然流产［8-9］，连续出现2次或2次以上的自然流产成为复发性流产。自然流产为妇科常见的妊娠并发症之一，育龄期女性发生1次自然流产的风险为10%左右。目前常用鼠类模型进行自然流产相关体内基础研究，考虑其与人体中医证型本质一致，因此病证结合自然流产动物模型建模成功与否，应从西医疾病评价指标、中医症候评价指标方面双重考虑。笔者主要从致病机制、造模方法、“病-证-治”结合类型、研究瓶颈等多维度依次探讨。1.1　基于临床的病-证结合自然流产模型研究现状1.1.1　自然流产常见动物造模方法及相关机制目前动物造模评价标准主要依据《自然流产诊治中国专家共识》（2020年版）［9］结合动物实际能表现的而制定。根据共识与评价，目前公认的主要自然流产（可治疗逆转的）动物造模方式主要有4种，①米非司酮，模拟临床的黄体障碍因素自然流产（诱导机制见图1A）［5，10-11］；②细菌脂多糖（LPS），常用于模拟宫内感染因素所致自然流产（诱导机制详见图1B）［12-14］；③溴隐亭，常模拟临床内分泌因素所致自然流产（诱导机制详见图1C）［15-17］；④CBJ/A×DBA/2小鼠交配模型为自发性流产模型，常常模拟不明原因造成的反复自然流产问题（诱导机制详见图1D）［18-21］。10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.F001图1自然流产动物模型建立的主要方法与作用机制Fig.1Main methods and mechanisms of establishing SAB animal models注：A.米非司酮导致自然流产作用机制［5，11］；B.LPS导致自然流产作用机制［13-14］；C.溴隐亭导致自然流产作用机制［15］；D.CBA/J×DBA/2小鼠形成RSA可能机制［20-21］1.1.2　“病-证-治”结合自然流产模型研究现状中医妇科学将自然流产归属于“胎漏” “胎动不安” “堕胎” “小产” “滑胎”等范畴，主要病机为冲任损伤，胎元不固。中医认为自然流产证候主要包括肾虚证、脾虚证、血瘀证、血热证等（中医证型评价指标见表1）［22-23］。现有病证结合自然流产模型多采用西医病理造模法，如羟基脲+米非司酮、氢化可的松+米非司酮制备的肾虚黄体抑制自然流产模型，利血平+米非司酮制备的脾虚自然流产模型，羟基脲+盐酸肾上腺素+米非司酮制备的肾虚血瘀复合自然流产模型［23-30］。笔者依据病证结合自然流产模型中、西医评价指标，通过赋值法［6-7］判定相关动物模型的吻合度，见表2［31-39］。遗憾的是，各病证结合自然流产动物模型所采用的指标不一，且部分观测评判模式不完善［40］。10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.T001表1自然流产西医、中医证型模型评价指标Table 1Evaluation indicators of SAB TCM syndrome type model西医疾病评判指标中医证候评价指标辨证分型主要证素次要证素指标①指标②指标③指标①指标②指标③指标④指标⑤①阴道流血；②腹痛（蜷缩弓背）；③精神萎靡、体质量增长变缓或下降；④胚胎丢失数、吸收率上升；⑤胚胎直径指数降低；⑥孕酮下降；⑦基因缺陷、先天发育异常；⑧子宫等脏器或其他实验室指标异常肾虚证阴道流血，色淡黯腰酸痛腹坠痛（蜷缩弓背）畏寒怕冷反应迟钝活动减少体质量增长缓慢或下降体毛疏松晦暗进食量、饮水量下降脾虚证阴道流血，色淡红，质稀薄腰酸痛腹坠痛（蜷缩弓背）神疲肢倦饮食减少活动迟缓体毛疏松晦暗形体消瘦，体质量增长缓慢或下降便溏血瘀证阴道流血，色黯红固定性刺痛并拒按（蜷缩弓背）瘀斑精神萎靡易怒反应迟钝进食、饮水量下降体毛疏松晦暗血热证阴道流血，量多，色鲜红腰腹坠胀痛（蜷缩弓背）口干咽燥（饮水量增多）精神萎靡、反应迟钝易怒狂躁体温上升体毛疏松晦暗大便干结注：西医赋值符合①②其中一项，吻合度为20%；符合③④⑤⑥⑦⑧其中一项，吻合度为10%，总分值为100%。中医赋值符合主要证素一项，吻合度为15%；符合次要证素一项，吻合度为11%，总分值为100%10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.T002表2“病-证-治”体系下自然流产模型研究现状与相关特点Table 2Research status and evaluation of SAB model combining disease and syndrome证型动物种类病证自然流产模型制备干预措施方药干预、相关措施Marker检测模型评价指标吻合度（西医/中医）模型特点文献肾虚证CBA/J雌性小鼠+DBA/2雄性小鼠经典RSA模型妊娠第0~9天予减味寿胎丸2.72 g·kg-1·d-1灌胃FoxP3、PR等符合西医评价指标④⑤⑥⑦⑧；符合中医次要证素指标③50%/11%先病后证；以方测证；缺乏中医证型评价指标［31］无特定病原体级（SPF级）ICR小鼠妊娠第1~9天灌胃氢化可的松25 mg·kg-1+第10天灌胃米非司酮4 mg·kg-1妊娠第1~7天孕康口服液低、中、高剂量分别予以9、18、36 mL·kg-1·d-1灌胃TNF-α、IL-10等符合西医评价指标②③④⑥⑧；符合中医主要证素指标②，次要证素指标①②③④60%/59%先证后病；制备简单；评价标准丰富［32］SPF级SD大鼠妊娠第1~7天灌胃羟基脲450 g·kg-1+第8天灌胃米非司酮4 mg·kg-1妊娠第1~7天寿胎丸水提浓缩液予以4.9 g·kg-1·d-1灌胃IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10等符合西医评价指标②③④⑧；符合中医主要证素指标②，次要证素指标①②④⑤50%/59%先证后病，以方测证，评价指标丰富［33］脾肾两虚证SPF级ICR小鼠妊娠第7天尾静脉注射细菌LPS 0.2 mL妊娠第1~7天孕康口服液低、中、高剂量分别予以9、18、36 mL·kg-1·d-1灌胃IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、TLR4、MyD88、NF-κB等符合西医评价指标④⑤⑧；符合中医评价指标无30%/-以方测证，先证后病，缺乏中医证型造模评价指标［34］脾虚证SPF级ICR小鼠妊娠第1~10天灌胃0.4 mL的1 g·mL-1番泻叶水煎液+第10天灌胃米非司酮6 mg·kg-1妊娠第1~7天孕康口服液低、中、高剂量分别予以9、18、36 mL·kg-1·d-1灌胃IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10等符合西医评价指标①③④⑥⑧；符合中医主要证素指标①②③，次要证素指标②③④⑤60%/89%先证后病；制备简单，评价指标丰富［35］肾虚血瘀证CBA/J雌性小鼠+DBA/2雄性小鼠经典RSA模型，连续1周灌胃0.2 mL羟基脲+皮下注射肾上腺素12 μL·d-1妊娠第1~14天补肾活血汤低、高剂量组分别灌胃100、200 g·kg-1，连续14 dTNFR1、FADD、Caspase-8、Bcl-2等符合西医评价指标④⑦⑧；符合中医评价指标无30%/-先病后证；缺乏中医证型造模评价指标［36］CBA/J雌性小鼠+DBA/2雄性小鼠经典RSA模型，妊娠第1~3天灌胃羟基脲0.2 mL+第4~10天羟基脲0.2 mL并予皮下注射肾上腺素122 μL妊娠第4~10天养血安胎方低、中、高剂量组分别给予0.2、0.4、0.8 mL灌胃IGFBP-7、VEGF、PDGF-AA等符合西医评价指标⑧；符合中医评价指标无10%/-先病后证；中西医造模评价指标皆较少［37-38］虚热证SPF级CBA/J雌性小鼠+DBA/2雄性小鼠经典RSA模型，妊娠第1~11天灌胃附子、干姜、肉桂溶液0.024 mg·g-1妊娠第1~12天庞氏安胎止血汤低、中、高剂量组分别给与11、22、44 g·kg-1灌胃p-p38 MAPK、T-bet、IFN-γ、GATA3、IL-4等符合西医评价指标①③④；符合中医主要证素指标①③，次要证素指标①②③④⑤40%/89%先病后证；流产模型制备简单，采用中医病理造模，但中药质控可能存在隐患［39］注：叉头框蛋白3.FoxP3；孕激素受体.PR；白细胞介素-2/4/10.IL-2/4/10；γ干扰素.IFN-γ；肿瘤坏死因子-α.TNF-α；肿瘤坏死因子受体1.TNFR1；FAS相关死亡域蛋白.FADD；胰岛素样生长因子结合蛋白1/7.IGFBP-1/7；血小板衍生生长因子.PDGF-AA；磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38.p-p38 MAPK；Toll样受体4.TLR4；髓样分化因子88.MyD88；核转录因子-κB.NF-κB；T盒子转录因子.T-bet1.2　“病-证-治”结合自然流产模型研究特点分析与瓶颈“病-证-治”结合自然流产动物模型结合了现代医学技术和中医药理论知识，形式多种多样，虽相关报道呈现逐年增长的趋势，但始终存在“病证结合模型造模方法争议较大” “证候属性判断方法不确定” “国际认可度低”等问题亟待解决［40］。目前病证结合自然流产模型主要有“先病后证” “先证后病”及“方药反证”3种方法。1.2.1　“先病后证” “先证后病”及“方药反证”模式问题“先病后证”造模方式符合先辨病后辨证的临床诊断思路，其采用的RSA经典模型［41］方法简单，干扰少，后期建立的证型模型不容易发生改变，如周月希等［31］、韩永梅等［36］、武颖等［37］、马丽亚等［39］方法，但“疾病造模”后再添“证候造模”，可能使痼疾加重，可能无法全面反映疾病发展过程，见表2；体质也可影响疾病发展及证型转归，“先证后病”造模方式对证型的掌握更加准确，该模型反映疾病自身的发生、发展过程，先造稳定的证型再造疾病模型，可以规避后期疾病模型病情加重，如陈少奇等［32］、李莉等［33］、许万枫等［35］方法，见表2。但造模干扰因素多，现阶段多以西医为指导，因小鼠和人体的差异，症状评价标准尚未统一，在证型模型上用药建立疾病也可能使前期证型发生变化。“方药反证”造模方式又称“以方测证”模式，即采用某一证型的经典方药、变换不同剂量，判断用药后对实验动物的影响，反过来验证动物模型的证型，也是目前“病-证-治”结合模型主流研究趋势。但该模式同样存在如下设计缺陷，没有阴性及阳性对照，难以保证该组方药在推断动物模型证候时具有“排他性”或“特异性”。方药本身具有“多通路-多靶点-多表型”的网络作用特点，模型证候判定不能只依赖“方药反证”这一种方法，因此在此类模型建立的实验方案的选择和设计上，还需根据自身实验的特点，综合动物表征、相关精准分子生物学指标进行再评价，灵活选用，严谨评判［42］，如周月希等［31］、李莉等［33］等正是在“先病后证”或“先证后病”模式基础上进行“以方测证”研究，从而形成完成的“病-证-治”结合体系，见表2。1.2.2　自然流产病证模型研究瓶颈与突破趋势病-证结合模型起于20世纪90年代，逐步发展成“病-证-治”体系，但该思路在中医生殖医学应用中始终存在一定局限性。临床证候千变万化，除单证型外，复合证型，无证可辨等情况常常发生，且不同证候中同一症状交叉存在，且在当前病证结合及核心病机的研究中，存在病证异质及证治分离趋势［2］。目前，在大部分病证结合模型研究中，生物学Marker的寻找存在主观性与随机性。自然流产的生物学过程与免疫调节/耐受、细胞侵袭、程序性细胞死亡、血管重塑等多环节密切相关，然而，中医证候模型分子层面的探索报道多局限于辅助性T细胞1/辅助性T细胞2（Th1/Th2细胞）因子平衡，这并不能全面阐明证候变化的关键生物学基础，也使得模型评判缺乏置信度。因此，如何客观、真实还原病-证流产模型本质，理性评价或阐释病-证模型机制、寻找关键生物学Marker是病证结合自然流产动物模型研究的瓶颈。笔者认为应从以下两方面着手，其一，不断优化自身造模方法，如郜洁等［43］运用正交设计法研究羟基脲与米非司酮制作肾虚-黄体抑制自然流产大鼠模型的优选配比（以流产率和胚胎直径作为衡量标准），为筛选母、胎安全的药物研究提供优质的模型工具。其二，应考虑与生物信息学的结合，如胥文娟等［44］认为要明确疾病间不同证型的兼夹与差异，还需结合细胞分子生物学、多组学联合、时空组学等相关技术，从微观物质层面为不同证型的客观化研究提供理论指导，通过整合算法，寻找、鉴定关键差异靶细胞群、关键通路及关键分子Marker，才能助于明确“病-证-治”的科学内涵，促进新配伍、新型靶向药物的开发。2 单细胞组学在“病-证-治”结合自然流产模型研究的应用趋势“病-证-治”结合自然流产模型的研究突破关键在于生殖与免疫学基础，母胎界面是女性生殖系统维持妊娠的关键免疫屏障［45］，母胎界面由滋养细胞、蜕膜免疫细胞、蜕膜基质细胞组成，可在减轻母体对胎儿排异性的同时防御感染，是明确“病-证-治”结合模型核心分子机制的关键环节。近年来单细胞组学技术在早期妊娠的研究中，深入探究了母胎界面组织的异质性问题及母胎免疫耐受的潜在机制，为认识及治疗各种早期自然流产提供新的指导方向。2.1　母胎界面具有高度异质性及空间结构复杂性等特征自然流产与母胎界面微环境状态密切相关，母胎界面作为母体与胎儿直接交流对话的“接触面”，除了有胎儿来源的绒毛外滋养层细胞（EVT）外，还包括母体来源的蜕膜基质细胞（DSC）和蜕膜免疫细胞（DIC）。母胎界面细胞因子平衡的失调将会导致流产、子痫等不良妊娠结局事件的发生。EVT主要通过增殖、侵袭参与胎盘形成，DSC主要供给营养，DIC通过分泌细胞因子，维持免疫耐受、参与胚胎植入与妊娠维系相关生物学过程的同时防御感染［46］。这些细胞相互促进、抑制，形成以DSC为中心的网络调控稳态，既使胎盘发育和功能完善，又减少了对胎盘的免疫排斥。关于母胎界面不同结构亚细胞调控模式见表3［47-62］，然而母胎界面细胞亚群层面的研究尚不完善，在不同妊娠疾病组成比例及参与免疫耐受、侵袭、迁移、黏附炎症反应、血管重塑、胚胎发育的空间作用网络仍不明确［63-64］。因此，病证结合模型自然流产仅过度聚焦于Th1/Th2细胞因子平衡并不能完整阐释中医证候及相应治法的生物学变化，也不符合中医整体观。10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.T003表3早期妊娠及自然流产中母胎界面单细胞全景式分析Table 3Single cell panoramic analysis of SAB maternal fetal interface结构细胞亚型高表达基因主要生物学功能亚细胞及分泌因子在自然流产中的异常表现滋养层滋养层细胞［47-48］细胞滋养层（CTB）EGR1、TGFBI、PRDX2、SPINT2、MAP2K3、XBP1等CTB调节辐射诱导细胞活动、正调控外泌体分泌、胞外囊泡生物发生、胞外外泌体生物发生、外泌体分泌、炎症反应正向调节、内皮细胞迁移、调节血管发育自然流产中CTB分泌的MAP2K3↓、XBP1↓合胞滋养层（STB）THY1、VCAM1、PGF、FGF2、FGF10、CD151、CD99、IL6ST、PDGFRA等STB对胚胎植入、胚胎器官发育具有重要调节作用自然流产中参与STB增殖的THY1↓、CD151↓、CD99↓、IL6ST↓、PDGFRA↓绒毛外滋养层（EVT）HLA-G、PAPPA2等EVT重塑母体组织中的子宫内膜和螺旋动脉，以确保血液循环自然流产中参与EVT细胞增殖的MKI67↑、CDK1↑、HDAC1↑、THBS1↓、CXCL8↓、IL-6↓等蜕膜免疫层自然杀伤细胞（NK）［49-50］蜕膜NK细胞d-NK1Kir、LILRB1、CSF1、SPINK2等d-NK1表达滋养层HLA-C、HLA-E和HLA-G分子的受体，并可以通过增加糖酵解酶的表达来进行代谢启动、抗炎作用自然流产中dNK1细胞 KIR2DL↓、KIR2DL2↓、KIR2DL3↓、KIR2DS1↑、KIR2DS↑d-NK2XCL1、ANXA1等d-NK2和d-NK3高度富集细胞因子介导的信号通路基因，倾向于细胞因子分泌的功能，防止免疫过度激活自然流产中dNK2和dNK3的XCL1↑、CCL5↑；dNK3细胞中的KLRB1↑、TIGIT↑d-NK3XCL1、CCL5、KLRB1和TIGIT、ANXA1等外周血（p）NK细胞90%为CD56dim CD16+ 型JNK1/2、ERK等pNK细胞在正常女性妊娠早期会受到明显抑，如果pNK在体内无法被抑制，就有可能因细胞免疫产生细胞毒性攻击母胎界面从而产生病理妊娠目前认为自然流产、RSA中pNK 细胞数量的增多↑和细胞毒性的增强↑，但存在较大争议巨噬（DM）细胞［51-52］M1（mac1）CD80、CD86、iNOS、IL-23和IL-12等DM是早期妊娠母胎界面第二大免疫细胞群体，在妊娠初期偏向Ｍ1（mac1）型，与中性粒细胞介导的免疫作用有关，具促炎作用，可诱导Th1分化自然流产或RSA，DM 总量显著减少，且有T细胞趋化性。自然流产或RSA蜕膜组织M1（mac1）细胞亚群比例↑，同时伴随M1（mac2）细胞亚群数量比例↓，与M1/M2 两种分型作用表型一致M2（mac2）CD163、CD206、CD209和IL-10等随着妊娠的进行即胎盘建立后，DM在胎盘形成后主要向M2（mac2）型转变，主具抗炎作用，通过免疫调节清除凋亡细胞和螺旋动脉重构T细胞［53-56］CD4+ T细胞亚群Th1GM-CSF、IL-3、LT-α、LT-β、CXCR-3、CCL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ等Th1参与母体的免疫反应，调节适应性免疫；参与免疫监视，防止滋养层的过度侵袭；保护胎儿胎盘；参与血管重塑；诱导趋化因子分泌，激活DM，并增加吞噬作用自然流产、RSA或RIF患者中Th1细胞相对含量明显上升↑，Th1细胞分泌IL-12↑、TNF-α↑和IFN-γ↑、IL-18↓Th2IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等Th2可间接识别胎儿抗原并进行克隆缺失，促进同种异体移植物耐受，提高妊娠成功率自然流产、RSA或RIF患者中Th1细胞相对含量明显下降↓，Th2细胞分泌的IL-4↓、IL-13↓，IL-5↓、IL-10↓Th9IL-9、IL-21、IL-3等Th9是Th2分化的新亚群，可通过炎症调节参与宿主-病原体相互作用和免疫介导的疾病，包括自身免疫性炎症疾病自然流产中IL-9可能下降↓，但目前研究尚不明晰，更多地被研究于分娩环节。Th17RORγt、IL-17A、IL-17F、IL-9和IL-22等Th17与中性粒细胞浸润密切相关，诱导对子宫内细胞外微生物的保护性免疫；参与感染性免疫，增加了孕激素的分泌能力和组织的侵袭能力自然流产或RSA中Th17细胞分泌的IL17↑，RORγt↑，同时可能诱导蜕膜NK（dNK）细胞的激活↑Th22IL-22、IL-10、TNF-α和FGF等Th22细胞通常产生IL-22，从而一致IL-4，IFN-γ和IL-17，并且IL-22和其受体结合后可对滋养细胞发挥调控作用，即可促进滋养细胞的增殖、延长滋养细胞的生存时间并抑制滋养细胞的凋亡，且与Th17细胞存在相关性自然流产胎盘绒毛中IL-22/IL-22R1通路可能异常激活/抑制，目前报道矛盾之处较多；蜕膜组织中的IL-22R1表达与自然流产或RSA关联性尚不明晰CD3+CD4- CD9-T细胞（DNT）亚群αβDNTINF-γ、TNF-α等αβDNT包含NKT（CD3+CD56+CD16+），通过调控母胎界Th1与Th2有关细胞因子的生成、穿孔素介导细胞毒物质的作用和自身免疫反应问题RSA的 外周血NKT细胞水平↑，但关联性报道尚不深入γδDNT尚不明晰γδDN（int TCR/CD3）T淋巴细胞及γδDN调节性T细胞则定植在特定组织（如子宫）的上皮内淋巴细胞区，可能对维持妊娠有重要作用，但尚无定论多项研究显示，RSA患者的γδDNT细胞水平和健康组无显著差异，有待进一步验证调节性T细胞nTregFoxP3、IL-2、IL-10、TGF-β、IFN-γ等来源于胸腺的自然调节性 T 细胞，占母胎界面大多数，表达IL-33的DC细胞可促使Treg细胞转化为Th17细胞RSA蜕膜中Treg含量↓，IFN-γ↑、IL-4↓、IL-10↓；Treg能抑制Th1和Th17细胞促进同种异体移植物耐受。目前认为母胎界面中的Th1/Th2/Th17/Treg平衡失调则导致自然流产或者RSApTregIL-10、TGF-β等pTreg在小剂量抗原或免疫抑制性细胞因子诱导下由外周幼稚T细胞发育而成，占少数。包括Tr1，Th3等细胞，主要发挥免疫负调控作用树突状（DC）细胞［57-59］mDSs（DC1）GM-CSF、IL-4和TNF-α等早期蜕膜组织的 DC可分为成熟的CD83+DC、未成熟DC（iDC）-SIGN+、呈激活状态但仍表现为未成熟状态的DEC-205+DC；DC细胞可以通过介导促炎因子和抗炎因子的表达在诱导幼稚T细胞活化、分化为Th1、Th2、Th17和Treg中起关键作用。mDC/pDC在建立免疫耐受性平衡方面起着至关重要的作用RSA患者蜕膜中cDC的比例显著增加↑；pDC的比例和pDC/mDC的比值显著下降↓；RSA蜕膜DC分泌HLADR↑、CD80↑、MHC-Ⅱ↑、CD86↑、CD274↓、33D1↓；血清中DC细胞因子IL-6↑、IL-12↑、TGF-β↓、IL-10↓pDCs（DC2）IFN-γ、IL-33、TLR7/9等蜕膜基质层蜕膜（DS）基质细胞［60-62］DS1PLA2G2A、MME、SFRP4、SFRP1、DIO2等DS1细胞亚群缺乏蜕膜经典分子标志物IGFBP-1和PRL的表达，主要存在于蜕膜海绵中的腺体之间RSA蜕膜中DS1和DS2的细胞数量显著减少↓。DS3中IGFBP1↑和PRL↑，且相对表达量最高；DS3中IGFBP1↑、PRL↑和WNT5A↑、CD10↓DS2LINC00473等DS2、DS3主要位于位于致密蜕膜中，在蜕膜化进程中调节程序性蜕膜衰老和局部炎症，在妊娠止血过程中起关键作用DS3IL1B、MFAP4、RGCC、CXCL14等DS4PAEP、KRT18等DS4可能参与早期母胎界面中的细胞自噬和氧化磷酸化等生物学过程，但缺乏深入性探索自然流产、RSA蜕膜中上皮标志物PAEP↑、KRT18↑，间充质细胞标志物ZEB1↓、TWIST2↓DS5MMP10、LEFTY2等DS5在细胞凋亡和衰老途经中富集。LEFTY2是TGF-β家族的成员，是子宫内膜出血相关因子，在月经周期黄体晚期表达上调，与着床窗口关闭相吻合RSA患者蜕膜组织中特有的新蜕膜细胞群，目前在妊娠及自然流产、RSA中的表达及作用尚不明晰注：复发性流产.RSA；Early Growth Response 1，5（号染色体上的基因）.EGR1；由转化生长因子β诱导的分泌蛋白.TGFBI；重组人过氧化物还原酶-2.PRDX2；丝氨酸肽酶抑制剂2.SPINT2；丝裂原活化蛋白激酶激酶3.MAP2K3；X-框结合蛋白1.XBP1；孕激素相关子宫内膜蛋白.PAEP；Keratin 18（12号染色体上的基因）.KRT18；zeste同源物2的增强子.EZH2；Thy-1细胞表面抗原.THY1；血管细胞黏附分子1.VCAM1；胎盘生长因子.PGF；血小板衍生生长因子.PDGFRA；主要组织相容性复合体.MHC；胰岛素样生长因子结合蛋白1.IGFBP1；催乳素.PRL；基质金属蛋白酶-10.MMP-10；左-右决定因子2.LEFTY2；微原纤维相关蛋白4.MFAP4；一个细胞周期调节因子.RGCC；C-X-C基序趋化因子配体14.CXCL14；转化生长因子.TGF；磷脂酶A2组ⅡA.PLA2G2A；膜金属内肽酶.MME；卷曲相关蛋白4.SFRP4；卷曲相关蛋白1.SFRP1；碘甲状腺原氨酸脱碘酶2.DIO22.2　应用单细胞多模态组学探索“病-证-治”结合自然流产关键分子Marker2.2.1　单细胞多模态组学在母胎界面相关妊娠疾病的潜在研究价值传统组学研究是在多细胞基础上进行的，实际计算的是一群细胞中信号的均值，丢失了其异质性相关信息，单细胞组学能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息［65］。目前单次单细胞转录组测序（scRNA-seq）实验难以捕获所有细胞和基因的信息，单模胞数据无法详细阐释细胞状态和系统变化，而近年来兴起的单细胞多模态技术可在一次实验中测量同一个细胞的多个模态数据，表征细胞内不同层面的生物信息：DNA和RNA测序从底层获取基因序列和表达信息，检测“脱氧核糖核酸（DNA）-核糖核酸（RNA）-表观遗传-染色质可及性-蛋白修饰”不同层面调控机制和分子性状的变化规律。多模态研究为后续的整合分析提供了丰富的数据，目前适用于单细胞多模态数据整合的主要方法Seurat V4［66］（基于CCA、MNN等算法）、Conos［67］（基于MNN、联合聚类等算法）、LIGER［68］（基于iNMF等算法）、Coupled NMF［69］（基于非负矩阵分解、耦合聚类算法）等多达数十种，也有提出一种新的多模态深度学习方法scMDC［70］，用于单细胞多组学数据重聚类分析，其目的在于帮助从不同层面剖析细胞类型和状态，深入挖掘调控机制。目前多模态方法也开始逐步用于自然流产相关研究，如利用scRNA­seq在单细胞层面上研究RSA患者与健康对照组（人流）中蜕膜原代淋巴细胞的转录组，并整合染色质可及性测序技术（ATAC-seq）鉴定的不同DIC亚群的表观遗传指纹，研究表明RSA患者的免疫细胞与正常蜕膜微环境中的免疫细胞相比存在非常显著的差异［71］。目前单细胞多模态技术在妊娠疾病研究的主要潜力作用有（图2B）：细胞间的相互作用、亚细胞差异基因（DEG）特异性表达、鉴定新的细胞亚型、拟时序轨迹分析靶细胞命运分化［72］、从而构建“人体-器官-组织-细胞-分子”关联［73-76］。10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.F002图2单细胞组学在妊娠疾病的研究应用趋势Fig.2Research and application trend of monocytomics in SAB model evaluation注：A.母胎界面复杂调控网络；B.单细胞组的研究意义2.2.2　利用单细胞多模态组学解决中医证候/物种/造模差异的关键由于单细胞组学的独特研究特点，目前逐渐被应用于中医药病-证领域研究，①证候差异，如张钦畅等［77］通过研究结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠，结果发现模型结肠组织中B细胞、NKT细胞、DM细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等占比上升，肠上皮细胞占比显著下降等。此外，运用单细胞组方法可进行“体质可分” “体病相关” “体质可调”中医体质关键科学问题探索和“禀赋遗传”等中医体质、中医证候基本原理的研究，拓展中医体质研究思路和方法［78-79］。同样，通过表3母胎界面单细胞类型与生物学功能的归纳总结，将单细胞测序用于中医生殖辨证分型的研究，不仅能阐释其科学性，还能使其更加规范化与标准化［80］。②物种差异：由于人与动物妊娠生理病理机制并不一致，如何有效地整合和呈现从不同物种的多个组织产生的大量单细胞数据成为较大挑战。CHEN等［81］为单细胞泛物种图谱创建了一个名为SPEED的新数据库，该数据库从生态学和进化论的角度研究疾病发生与发展，有助于在多水平、多角度和多方向上深入挖掘和理解细胞、组织和物种之间的异质性，对自然流产实际发病的分子机制提供新见解。③造模差异：从单细胞组学研究技术入手，一方面分析流产母胎界面组织中各种细胞类型、细胞亚群及基因表达的差异性等因素，另一方面深入阐释不同物种模型之间、不同造模方式之间的单细胞生物学形态、数量、功能差异，更有助于揭示病证结合自然流产模型细胞间和细胞内交互对话的机制，从细胞异质性角度探讨不同证型自然流产模型致病的分子机制［82-83］。2.2.3　以肾虚证、脾虚证为例探究单细胞多模态组学在“病-证-治”结合自然流产模型评判策略应用由于自然流产病机主要责之脾、肾，笔者以其藏象生物学差异为例进行。脾在妊娠环节的藏象功能主要为“脾主卫” “脾主升清” “脾统血”［84］，涉及生物学炎症、免疫、代谢、血液流变学等环节；肾在妊娠环节的藏象功能主要为“肾藏精” “肾主生殖” “肾主水液”等［85］，涉及下丘脑-垂体-性腺轴功能、性激素功能、生殖关键基因/RNA层面甲基化改变、水通道蛋白等生物学环节。因此他们的关键靶细胞及生物学Marker大相径庭，病证结合自然流产模型验证方法不可能一致。笔者据此提出如下研究路径：①构建并展示肾虚证、脾虚证的生物细胞学差异：基于生物学表征模式构建脾虚证、肾虚证自然流产模型，通过单细胞多模态技术，挖掘模型疾病状态下蜕膜免疫细胞如自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞（DM）及T细胞的比例与特征差异，同时蜕膜免疫细胞、基质细胞及绒毛外滋养层细胞之间的细胞互作发生了明显病理性改变，需要挖掘脾虚证、肾虚证在母胎界面的关键差异细胞群；②采用Seurat V3、Conos、LIGER等多维度整合算法挖掘脾虚证候、肾虚证候母胎界面组织不同关键细胞群的DNA/RNA、表观遗传、染色质可及性、蛋白表达之间共同的变异模式，通过拟时序轨迹分析显示差异细胞从多能性到分化启动状态的变化，并通过基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析关键细胞群差异基因（DEG）主要的生物学表型、核心信号通路群、功能层次及相关生物学功能模块，得出候选关键分子Marker；③通过“方药反证”模式观察不同模型关键细胞群（经相应代表治法的不同方剂、不同剂量处理后）的数量及相关时空差异轨迹能否倾向恢复至正常水平，并结合传统分子生物学技术（如蛋白印记、聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞术等技术）验证潜在关键分子Marker，筛选关键的靶细胞、靶基因、DNA/RNA位点甲基化及相关执行蛋白作为“方-证”模型评判关键。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230519.F003图3以脾虚、肾虚证自然流产为例探索“病-证-治”结合思维在单细胞多模态组学的验证框架Fig.3Taking SAB of spleen deficiency and kidney deficiency as examples to explore research framework of "disease-syndrome-therapy" in single-cell multimodal genomics3 总结与展望综上所述，目前“病-证-治”结合自然流产的研究模式主要在经典疾病模型的基础上，利用传统中医学病因病机，结合疾病证候的动物模型，并通过“先病后证” “先证后病”或者结合“方药反证”方式，以动物行为、体征等宏观生物学表征结合生化Marker等现代医学表征，建立模型评判标准。但总体上仍缺乏全面、精准、动态、客观的证候分子生物标志物以评价模型动物证候属性［86］。“病-证-治”结合自然流产动物模型的建立始终要在中医药理论的指导下，完善最常见证型动物模型的建立标准、评价机制，才能有利于后期对疾病病因病机本质的探索。建立完善规范化的评价体系不仅需注重实验动物的信息采集及系统分析，用全面客观的指标去评价，还需不断运用更科学的实验设计建立统一的评价指标［87-88］。同时，“病-证-治”结合自然流产动物模型的深入研究需要先进的评估技术支撑，单细胞组学将整体动物实验精细到细胞水平、分子水平检测指标，将网络大数据、微生态技术、基因及蛋白组学等前沿热点与动物模型研究相结合，有利于提高实验质量，系统揭示“病-证-治”体系科学内涵［42，44］。