慢性肾功能衰竭（CRF）指由于各种原因引起的慢性进行性肾实质损伤，出现肾脏萎缩、肾功能受损并出现全身各系统受累为主要表现的临床综合征［1］。关于CRF的发病机制，先后提出多种学说进行解释，包括“肾小球高滤过” “肾小管高代谢” “脂质代谢紊乱”等等，但是其中任何一种学说都不能解释疾病发生发展的全过程。随着基础研究不断深入，人们对CRF发病机制逐渐有了新的认识。其中肾脏缺氧对肾脏疾病进展的影响受到了关注，对于认识CRF进展与肾小球、肾小管、脉管系统相互作用的关系具有重要意义。因CRF发病机制复杂，西医治疗以治疗原发病、避免和纠正CRF进展的危险因素、防治并发症为治疗原则［2］。随着中医中药的发展，临床中应用中药复方延缓CRF进展和改善患者临床症状，减少和减缓并发症的出现取得了明显疗效［3-5］。真武汤出自《伤寒论》，由茯苓、芍药、白术、生姜、附子组成，其主要的功效是温阳利水，用于治疗证属脾肾阳虚、水湿内停者。大量的临床研究表明真武汤在治疗脾肾阳虚型CRF具有较好疗效，在治疗肾脏疾病及其并发症具有明显疗效。在临床中运用真武汤治疗慢性肾脏病时发现，在基础上加用大黄、黄芪、丹参以增强化瘀泄浊之功效可以明显延缓CRF进展和减少或减轻心血管损伤的出现。但加味真武汤中药物成分较多、各成分之间存在相互影响，故不清楚其延缓CRF进展的作用机制。本研究旨在通过网络药理学、分子对接和动物实验验证探讨加味真武汤延缓CRF进展的可能作用机制，为临床运用加味真武汤延缓CRF进展提供理论依据。1 资料与方法1.1　基于网络药理学探讨加味真武汤治疗CRF作用机制1.1.1　加味真武汤靶点预测通过本草组鉴（HERB，http：//herb.ac.cn/）数据库［6］，检索黄芪、丹参、大黄、茯苓、白芍、生姜、附子、白术的所有作用靶点。将作用靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物-靶点”图。1.1.2　CRF靶点基因预测通过GeneCards（https：//www.genecards.org/），搜索关键词“Chronic renal failure”，获得CRF的靶蛋白基因。通过Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图，获得交集基因。1.1.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选通过STRING数据库（https：//string-db.org/；Version 11.5）对交集靶点进行PPI分析；将通过STRING数据库获取的“tsv”文件导入Cytoscape 3.9.1软件中，计算度值，并逐步筛选出核心靶点基因。1.1.4　基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析通过Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）数据库［7］，将P0.01作为筛选条件，对交集靶点进行GO分析和KEGG富集分析。通过微生信在线平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）将GO和KEGG分析结果绘制成气泡图。1.2　部分药物活性成分与核心靶点分子对接验证在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载加味真武汤部分药物活性成分的2D结构（SDF格式），通过“Open Babel”软件对活性成分格式进行转换，将“SDF”格式转变为“PDB”格式。在RSCBPDB数据库（https：//www.rcsb.org/）中下载核心靶点蛋白“PDB”格式的3D结构。利用AutoDockTools1.5.6软件进行分子对接，对接分数值可用于结合活性评价。然后使用PyMOL软件对结果进行可视化展示。1.3　动物实验1.3.1　动物北京维通利华实验动物技术有限公司购进50只雄性SD大鼠，SPF级，8周龄，体质量（260±20）g，合格证号SCXK（京）2021-0011。饲养于河北以岭医药研究院有限公司标准化动物房（相对湿度50%~70%，温度23~25℃，昼夜各半），鼠维持饲料［北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号京饲证（2019）06076］。普通级玉米芯垫料（北京科澳协力饲料有限公司，批号22049811）动物饮用水。本实验由河北以岭医药研究院有限公司伦理委员会批准，动物实验伦理编号N2022070。1.3.2　药物加味真武汤免煎颗粒，组成为黄芪15 g、丹参15 g、生大黄6 g、茯苓9 g、白芍9 g、生姜9 g、黑顺片9 g、白术6 g（四川新绿色药业科技发展有限公司，批号分别为20080124、21080024、20120030、21100051、20070087、21040160、21040091、21090123）。盐酸贝那普利片由上海新亚药业闵行有限公司生产（国药准字H20044840，10 mg/片）1.3.3　仪器与试剂腺嘌呤（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号A108805-250g，HPLC≥99.5%）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市大茂化学试剂厂，批号20210601）；低氧诱导因子-1α（HIF-1α，北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-20399R）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、20×柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）、20×Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0）、20×Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0）、组化试剂盒DAB显色剂（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为GB11347、G1202、G1203、G1206、G1212）、脯氨酸羟化酶1（PHD1）抗体（美国Abcam公司，批号ab113077），脯氨酸羟化酶2（PHD2）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号19886-1-AP）；尿总蛋白（TP）试剂（石家庄长江生物实验科技开发有限公司，批号220526）；肌酐（Cr）试剂盒、尿素氮（BUN）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒（贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号分别为AUZ3562、AUZ3611、AUZ3592、AUZ3625）；血磷试剂盒、血钾试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，批号分别为B008、K060）。CLINITEK50型尿液分析仪（美国Siemens Healthineers公司）；HEMIX-180型全自动生化分析仪（日本Sysmex公司）；KZ-Ⅲ-FP型研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；D3024R型台式高速冷冻型微量离心机（DragonLab公司）；CFX型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；ECLIPSE C1型正置荧光显微镜、E100型显微镜（尼康仪器有限公司）；Pannoramic MIDI型扫描仪（3DHISTECH公司）；RT-6100型酶标仪（美国Rayto公司）；JY92-11N型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物）。1.3.4　动物分组、制备模型、给药与取材通过随机数字表法将所购SPF雄性SD大鼠分为正常组10只、造模组40只。适应性饲养1周，无不良反应，第1周末留取所有大鼠24 h尿液进行检测，各大鼠无蛋白尿。将腺嘌呤溶于0.5%CMC-Na中制备成混悬溶液，造模组大鼠予腺嘌呤150 mg·kg-1灌胃，正常组予等体积0.5%CMCNa溶液灌胃，均每日1次。灌胃12周末检测两组大鼠24 h尿液，随机选取正常组和造模组大鼠各3只进行取材检测。此时造模组大鼠尿量明显增多、伴有蛋白尿、血液中Cr、BUN、血磷、血钾、TG、TC明显升高，CRF大鼠模型制备成功；按照随机数字表法将造模组大鼠分为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组各6只。中药低剂量组大鼠予加味真武汤7.2 g·kg-1灌胃，中药中剂量组大鼠予加味真武汤14.4 g·kg-1灌胃，中药高剂量组大鼠予加味真武汤28.8 g·kg-1灌胃，盐酸贝那普利组大鼠予盐酸贝那普利10 mg·kg-1灌胃，正常组和模型组大鼠予等体积CMC-Na溶液灌胃，药物干预每日1次，共干预4周。实验大鼠每周检测体质量。于实验第17周末运用代谢笼留取每只大鼠的24 h尿液，留取尿液期间禁食不限水。尿液留取完成后取材，取材前禁食12 h，禁水4 h，2%浓度的戊巴比妥钠按照40 mg·kg-1体质量对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，腹主动脉取血，离心机分离上清用于生化指标检测；腹主动脉取血完成后，从肾门处游离出两侧肾脏并进行剥离并祛除被膜，在冰上迅速切取部分左肾组织用4%的多聚甲醛液进行固定，用于免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）检测；再将右肾分为两部分，一部分放入冻存管中后快速放置于液氮罐内，后转移至-80 ℃冰箱冻存用于蛋白质印迹（Western blot）检测，另一部分放入PCR保存液中保存，用于实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测。1.3.5　指标检测1.3.5.1　IHC法检测大鼠肾组织PHD1、PHD2、HIF-1α、α-SMA表达水平肾组织石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、滴加磷酸盐缓冲液（PBS）稀释好的PHD1（1∶50）、PHD2（1∶200）、HIF-1α（1∶200），α-SMA（1∶2 000）抗体孵育、加入生物素标记的二抗（1∶200）、室温孵育、自来水冲洗、苏木素复染、脱水封片；白光显微镜下观察阳性表达并拍照保存。1.3.5.2　IF观察肾脏α-SMA表达切片（3~5 μm）、PBS洗涤、加入兔抗鼠FITC标记的α-SMA抗体溶液、PBS冲洗、甘油封片、用荧光显微镜观察各组大鼠肾组织α-SMA的沉积部位和强度，拍片，结果以亮红色为阳性。1.3.5.3　Real-time PCR检测大鼠肾组织HIF-1α mRNA、PHD1 mRNA的表达反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火，延伸30 s，进行40个循环。引物为武汉赛维尔生物科技有限公司合成。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物名称引物序列（5'-3'）长度/bpGAPDH上游CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG138下游GGTGGAAGAATGGGAGTTGCTHIF-1α上游CTACAAGAAACCGCCTATGACG168下游GGCTCATAACCCATCAACTCAGPHD1上游TGAATCAGAACTGGGATGTTAAGGT247下游ACACCTTTCTGTCCCGATGCTA扩增完毕后，得到各样本的目的基因及内参基因的Ct值，目的基因Ct值-内参基因的Ct值=ΔCt，按照公式Q=2-ΔΔCt，得到PHD1 mRNA、HIF-1α mRNA相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。1.3.5.4　Western blot检测PHD1、PHD2、HIF-1α，α-SMA蛋白表达提取大鼠肾脏组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白溶液中加入蛋白上样缓冲液，在沸水浴中15 min进行变性，按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）说明书进行电泳，聚偏氟乙烯树脂（PDVF）300 mA恒流，转膜30 min，TBST缓冲液快速涮洗1次，然后加上5%的牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30 min，倒掉孵育槽中的封闭液，加入稀释好的一抗PHD1（1∶1 000），PHD2（1∶1 000），HIF-1α（1∶500），α-SMA（1∶1 000），β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育摇床过夜（摇床慢摇），然后加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，洗3次，每次5 min，加入二抗，稀释（1∶5 000），在室温条件下摇动30 min，TBST洗3遍二抗，每次5 min，化学发光后用AIWBwellTM分析软件进行数据分析。软件自动读取的指标灰度值与内参灰度值的比值，即样本的相对含量，表示蛋白质的相对表达水平。1.3.5.5　统计学方法相关数据统计采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量资料符合正态分布且方差齐，用x¯±s表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较用t检验法，方差不齐应用秩和检验，P0.05说明具有统计学差异。2 结果2.1　网络药理学研究结果2.1.1　加味真武汤靶点基因与CRF疾病相关靶点交集通过HERB数据库检索各药物成分，共检索出加味真武汤靶点基因426个。以“Chronic renal failure”为关键词，在GeneCards数据库检索到相关靶蛋白基因9 270个，通过选择“Relevance score”筛选CRF疾病靶点基因2 698个。通过Venny 2.1绘制韦恩图，获得加味真武汤与CRF的交集靶点基因154个。通过STRING数据库对交集靶点进行PPI分析，隐藏游离点基因后，平均局部聚类系数0.627，节点数153，边数2 777，平均节点度36.3，预期边数899，PPI富集P1.0×1016。见增强出版附加材料。2.1.2　建立“药物-靶点”网络通过Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-靶点”网络，并对其进行分析，得到节点数目为423个，边数为629，平均相邻节点数为2.899，网络直径6，网络半径3，特征路径长度为3.192，系数0.000，网络密度为0.007，网络异质性为4.751，网络集中度0.423，连通分量为1。见增强出版附加材料。2.1.3　加味真武汤治疗CRF核心靶点筛选将通过STRING数据库获取的“tsv”文件导入Cytoscape 3.9.1软件中，计算度值，并筛选出核心靶点。可预测白蛋白（ALB）、蛋白激酶B1（Akt1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素（INS）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤蛋白p53（TP53）、白细胞介素-1β（IL-1β）可能是加味真武汤治疗CRF的核心靶点。见增强出版附加材料。2.1.4　GO及KEGG分析结果通过Metascape数据库对154个加味真武汤与CRF交集靶点基因进行生物富集分析，得到GO分析条目2 324条，包括生物过程2 013条、细胞组成87条和分子功能184条。应用微生信平台对GO分析结果中P值排名前20的条目进行绘图。通过Metascape数据库富集分析得到203条KEGG通路，应用微生信平台对P值排名前20的KEGG结果绘制气泡图。可预测加味真武汤对CRF的治疗作用主要涉及脂质与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、细胞凋亡、NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。使用Cytoscape 3.9.1软件构建加味真武汤治疗CRF的KEGG信号通路关系网络图。见增强出版附加材料。2.2　加味真武汤部分活性成分与核心靶点进行分子对接将筛选出的加味真武汤治疗CRF的核心靶点与加味真武汤的部分活性成分做分子对接，对接结合力值见表2，对接结合力值越小说明配体和受体结合越稳定，越可能发生相互作用。其中12-oxoarundoin与IL-1β的结合力值最低，为-12.57 kcal·mol-1（1 cal≈4.186 J），其对接可视化模型见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.T002表2加味真武汤部分活性成分与关键靶点结合能预测Table 2Predicted binding energy of some active ingredients and key targets in modified ZhenwutangNo.来源中药化合物名称结合能量/kcal·mol-1ALBAkt1TNFIL-6INSVEGFATP53IL-1β1白芍10-methylnonadecane-2.92-2.38-2.65-2.14-3.52-2.91-3.48-5.972白术12-oxoarundoin-12.50-10.87-10.26-9.37-10.78-10.69-10.40-12.573大黄10beta-hydroxy-6beta-isobutyrylfuranoeremophilane-9.56-8.26-6.78-7.17-6.39-8.01-7.61-8.864丹参1，2，5，6-tetrahydrotanshinone-9.41-7.96-8.96-7.71-7.37-7.52-8.01-8.365茯苓1，2，3，4，6-pentagalloylglucose-1.33-1.20-2.13-1.39-1.58-3.11-1.43-2.506附子11，14-eicosadienoic acid-3.74-2.65-1.82-1.83-3.26-2.67-1.95-4.947黄芪13-hydroxy-9，11-octadecadienoic acid-2.19-3.80-1.57-2.05-3.00-3.27-2.37-4.198生姜10-dehydrogingerdione-6.64-4.54-6.40-5.07-6.69-6.84-6.60-7.982.3　动物实验2.3.1　加味真武汤对大鼠肾组织PHD1、PHD2、HIF-1α、α-SMA的表达与正常组比较，模型组大鼠PHD1、PHD2在肾小管的表达明显减弱；与模型组比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠PHD1、PHD2在肾小管的表达逐渐增强；与正常组比较，模型组大鼠HIF-1α、α-SMA在肾小管的表达明显增强；与模型组比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠HIF-1α、α-SMA在肾小管的表达逐渐减弱；中药组随剂量增加，效果逐渐增强。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.F001图1加味真武汤对大鼠肾组织PHD1、PHD2、HIF-1α、α-SMA表达的影响 （IHC， ×200）Fig.1Effect of modified Zhenwutang expression of PHD1， PHD2， HIF-1α， α-SMA in renal tissues of rats （IHC， ×200）注：A.正常组；B.模型组；C.加味真武汤低剂量组；D.加味真武汤中剂量组；E.加味真武汤高剂量组；F.盐酸贝那普利组（图2、图3同）2.3.2　加味真武汤对大鼠肾组织α-SMA表达的影响大鼠肾脏α-SMA免疫荧光结果正常组实验大鼠肾脏血管有少量α-SMA表达；与正常组比较，模型组大鼠肾脏血管、壁层肾小囊、肾小管周围有大量α-SMA表达；与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠α-SMA的表达明显减少，且中药组随剂量增加，效果逐渐增强。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.F002图2加味真武汤对大鼠肾组织α-SMA蛋白表达的影响 （IF×200）Fig.2Effect of modified Zhenwutang expression of α-SMA in renal tissues of rats （IF×200）2.3.3　加味真武汤对大鼠肾组织中PHD1、HIF-1α mRNA的影响与正常组大鼠比较，模型组大鼠PHD1 mRNA表达显著减弱（P0.01）；与模型组大鼠比较，中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠PHD1 mRNA表达显著增强（P0.01）。与正常组大鼠比较，模型组大鼠HIF-1α mRNA表达显著增强（P0.01）；与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠HIF-1α mRNA表达显著减少（P0.01），且中药组随剂量增加，效果逐渐增强。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.T003表3加味真武汤对大鼠肾组织中PHD1、HIF-1α mRNA的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of medified Zhenwutang on PHD1 mRNA and HIF-1α mRNA in rat kidney tissue （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1PHD1HIF-1α正常组1.00±0.010.92±0.17模型组0.49±0.082）2.91±0.342）中药低剂量组7.21.38±0.144）2.23±0.184）中药中剂量组14.42.03±0.154）1.20±0.394）中药高剂量组28.82.29±0.034）0.75±0.0104）盐酸贝那普利组0.011.50±0.334）1.56±0.444）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表4同）2.3.4　加味真武汤对大鼠肾组织中PHD1、PHD2、HIF-1α、α-SMA蛋白表达的影响与正常组大鼠比较，模型组大鼠HIF-1α、α-SMA蛋白表达显著上调（P0.01）；与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠HIF-1α、α-SMA蛋白表达显著减少，差异有统计学意义（P0.01）；与正常组大鼠比较，模型组大鼠PHD1、PHD2蛋白表达显著降低（P0.01）；与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、盐酸贝那普利组大鼠PHD1、PHD2蛋白表达显著增加（P0.01），且中药组随剂量增加，效果逐渐增强。见图3，表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.F003图3大鼠肾组织PHD1、PHD2、HIF-1α、α-SMA蛋白电泳表达Fig.3Electrophoretic expression of PHD1， PHD2， HIF-1α， α-SMA protein in kidney tissue of rats10.13422/j.cnki.syfjx.20230719.T004表4加味真武汤大鼠肾组织中PHD1、PHD2、HIF-1α蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of modify Zhenwutang on expression of PHD1， PHD2 and HIF-1α protein in kidney tissue of rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1PHD1/β-actinPHD2/GAPDHHIF-1α/β-actinα-SMA/GAPDH正常组0.523±0.0151.310±0.1420.213±0.0210.433±0.015模型组0.387±0.0152）0.290±0.0312）1.133±0.0512）1.513±0.0252）中药低剂量组7.20.427±0.0124）0.493±0.0424）0.867±0.0154）1.27±0.0264）中药中剂量组14.40.463±0.0154）1.010±0.0504）0.610±0.0204）0.963±0.0154）中药高剂量组28.80.477±0.0124）0.803±0.1274）0.463±0.0154）0.710±0.0204）盐酸贝那普利组0.010.467±0.0214）0.697±0.0504）0.697±0.0154）1.067±0.0254）3 讨论在传统中医文献中没有“慢性肾衰竭”的病名的记载，但根据其临床表现和发病特征，可归结于中医学“关格”。《证治汇补》云：“关格者……既关且格，必小便不通，旦夕之间，陡增呕恶，此因浊邪雍塞三焦，正气不得升降。《中医内科学》［8］将关格的病机归纳为肾气衰惫，致使气化失常，关门不利，浊毒内蕴，损脾伤胃，升降失司，胃气上逆。陈志强教授认为CRF的基本病机包括脾肾两虚、湿浊阻滞、瘀血阻络［9］。国医大师张琪认为CRF病位在脾、肾两脏，脾肾虚损贯穿疾病始终，也是湿浊产生的基础，瘀血为基本病理表现，治疗上采用化浊泄热、活血解毒、健脾补肾、温阳泄浊等治法取得了显著疗效［10］。由此看出CRF基本病机为脾肾阳气亏虚，瘀浊阻滞。在治疗中当以“标本兼治”为原则，以“健脾益肾，化瘀泄浊”为治法。加味真武汤中附子温补脾肾、温运水湿，黄芪健脾益气、利水消肿共为君药以温补脾肾、运化水湿；白术健脾益气、燥湿利尿，茯苓利水渗湿，大黄泻下逐瘀、降湿浊，丹参活血祛瘀，四者共为臣药以活血化瘀、利湿祛浊；生姜温中散寒，白芍养血敛阴、利小便二者共为佐药以增强温阳利水之功效并防治附子燥热伤阴。现代药理研究发现，附子抑制M1型巨噬细胞极化缓解肾纤维化；黄芪甲苷通过调控沉默信息调节因子1（SIRT1）/过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）信号通路发挥对阿霉素肾病的保护作用；白术多糖能改善肾脏滤过屏障泌尿功能和肾小管重吸收功能；茯苓水提物可改善肾阳虚下焦水肿大鼠肾功能；大黄酸可以通过降低炎症因子表达，改善肾纤维化，改善糖尿病肾病大鼠的肾功能；姜提取物通过抑制炎症因子表达减轻高果糖喂养SD大鼠的肾损伤；白芍总苷调节Toll样受体9（TLR9）/髓样分化因子88（MyD88）/NF-κB通路改善系统性红斑狼疮小鼠肾脏损伤［11-17］。可以看出加味真武汤方中各味中药通过不同机制发挥保护肾脏的作用。网络药理学结果显示，GO富集分析结果表明加味真武汤可能通过与细胞因子受体、蛋白激酶、泛素样蛋白连接酶、G蛋白偶联受体、Ⅲ型转化生长因子β受体、肿瘤坏死因子受体超家族的结合和对细胞死亡、氧气水平、生长因子、凋亡信号通路等的调控以及对细胞中蛋白激酶复合物、转录调控复合物、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白复合物、细胞器包膜腔、致死信号复合体的影响，从而发挥改善缺氧、减轻细胞损伤、减少细胞凋亡等作用延缓CRF进展。KEGG富集分析结果表明加味真武汤通过干预脂质与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、细胞凋亡、NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路改善组织缺氧、减轻血管损伤、减少细胞凋亡以及减轻过度炎症反应等过程延缓CRF进展。分子对接结果显示，加味真武汤中的活性成分与核心作用靶点中的ALB、Akt1、TNF、IL-6、INS、VEGFA、TP53、IL-1β具有较为稳定的结合活性。ALB在调节血浆胶体渗透压中起作用，还是多种内源性分子（激素、脂肪酸和代谢物、外源性药物）的载体蛋白。并且对许多底物表现出特异性的酯酶样活性［18-19］。Akt1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt1，Akt2和Akt3）之一，调节许多生物过程，包括代谢，增殖，细胞存活，生长和血管生成，Akt在调节NF-κB依赖性基因转录中具有重要作用［20-21］。Akt作为Akt/哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）信号通路的关键调节剂发挥作用，此外作为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）下游的信号分子介导对多种生长因子的影响［22］。Akt还通过丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5（MAP3K5）的磷酸化调节细胞存活［23］。TNF是多功能促炎细胞因子，主要由巨噬细胞分泌。这种细胞因子参与调节广泛的生物过程，包括细胞增殖、分化、细胞凋亡、脂质代谢和凝血［24］。TNF还可通过与IL-1β和IL-6协同诱导VEGF产生在血管生成中发挥作用［25］。IL-6是一种细胞因子，在炎症和B细胞成熟中起作用。此外，IL-6已被证明是一种内源性热原，能够诱导患有自身免疫性疾病或感染的人发烧。该蛋白主要在炎症部位产生，在分泌到血清后作用于其特异性受体诱导炎症反应［26］。还可通过诱导VEGF引起血管生成活性和血管通透性增加［27-28］。INS在调节碳水化合物和脂质代谢中有着重要的作用。去除前体信号肽后，胰岛素原在翻译后裂解成3种肽：B链和A链肽，他们通过2个二硫键共价连接形成胰岛素，以及C肽。胰岛素与胰岛素受体（INSR）结合刺激葡萄糖摄取［29］。VEGFA是血小板衍生生长因子（PDGF）/血管内皮生长因子（VEGF）生长因子家族的成员，可诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡，诱导血管透化［30］。TP53对不同的细胞应激作出反应以调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期停滞、细胞凋亡、衰老、脱氧核糖核酸（DNA）修复或新陈代谢变化［31］。TP53可以通过与Bcl-2家族蛋白的相互作用，引起线粒体途径细胞凋亡［32］。IL-1β属于白细胞介素-1细胞因子家族，参与细胞的增殖、分化和凋亡［33］。IL-1β不仅是有效的促炎细胞因子［34］，并且参与焦亡下游炎症的转导：其成熟形式通过成孔蛋白gasdermin-D（GSDMD）在细胞外环境中特异性释放［35］。而加味真武汤中的活性成分与以上核心作用靶点有稳定的结合活性，由此可见加味真武汤可能通过影响ALB、Akt1、TNF、IL-6、INS、VEGFA、TP53、IL-1β靶点蛋白抑制炎症反应、细胞凋亡/焦亡，改善肾组织缺氧，从而延缓CRF进展。动物模型验证结果显示，加味真武汤可以降低CRF大鼠肾组织中HIF-1α，α-SMA表达水平，提高PHD1、PHD2表达水平。在常氧条件下，缺氧诱导因子-α（HIF-α）可以通过脯氨酸羟化酶（PHD）羟基化，羟基化HIF-α可以与泛素结合，被蛋白酶体激活的肿瘤抑制因子抗体蛋白（pVHL）降解，pVHL作为泛素连接酶促进HIF-α蛋白水解。而在低氧或炎症等应激条件下，增加的活性氧（ROS）可以抑制PHD的活性，从而进一步抑制HIF-α的羟基化和水解［36-38］，稳定的HIF-α与HIF-β形成二聚体并易位到细胞核中，激活靶向基因。根据α-亚基的不同，将HIF分为HIF-1、HIF-2和HIF-3 3个亚型。HIF-1是一种基本的异二聚体螺旋-环-螺旋转录因子，由可调节的氧敏感α亚基HIF-α和组成型表达的β亚基HIF-β组成。HIF-1作为一种转录因子，活化后可以调控促红细胞生成素、血管内皮生长因子、内皮素-1、葡萄糖转运蛋白等靶基因的表达，影响红细胞生成、血管生成和能量代谢，在此过程中调控对缺氧的初始适应过程，改善组织氧合和细胞存活，并在一定程度上抵消一些有害影响。越来越多的证据表明HIF-1在肾损伤过程中不仅介导缺氧适应，还与炎症、上皮-间充质转化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积相关，参与纤维化前改变，在肾脏疾病的发生和发展中也起着重要作用［39-42］。最近的研究发现HIF-1的积累能显著增强转化生长因子-β（TGF-β）的表达促进肾小管间质纤维化［43］。此外微小RNA217（miR-217）升高通过上调ROS、激活HIF-1信号通路、介导细胞凋亡促进高糖培养大鼠肾小球系膜细胞炎症和纤维化［44］。LI等［45］认为HIF-1可以诱导外泌体微小RNA-23a（miR-23a）的表达，在小管间质炎症中介导小管上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用。间质纤维化最显著的病理表现之一是肌成纤维细胞的存在，其细胞质中含有α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）［46］。α-SMA作为肌成纤维细胞活化的生物标志物，在正常肾脏中比较少，而在纤维化肾中，肌成纤维细胞在纤维化区域内数量显著增加。实验研究表明HIF-1还可以通过上调肾小管上皮细胞碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子（Twist）表达，促进间充质转化［47］。通过加味真武汤干预，CRF大鼠肾组织中PHD1、PHD2表达水平升高，HIF-1α、α-SMA表达水平降低，减轻肾组织细胞缺氧损伤，减少肌成纤维细胞生成，从而减轻了肾脏病理损害，延缓了CRF进展。综上所述，加味真武汤可能通过影响ALB、Akt1、TNF、IL-6、INS、VEGFA、TP53、IL-1β等靶点蛋白的表达及调控HIF-1等信号通路进而改善肾组织缺氧，抑制细胞转分化、细胞凋亡/焦亡、炎症反应，从而延缓CRF进展。