睡眠是人至关重要的生理现象，人有三分之一的时间都在睡眠。有研究表明，睡眠有助于大脑处理信息、贮存记忆，特别是快动眼睡眠期（REM），有助于神经损伤修复。失眠症是以入睡和（或）睡眠维持困难所致的睡眠质量或数量达不到正常正需求而影响日间社会功能的一种主观体验，是最常见的睡眠障碍性疾病［1-3］。失眠既可以是一种独立存在的疾病，也可以是多种疾病的某一症状。国内外流行病学调查结果显示，失眠诊断人数较前增长了11倍，其中老年人发病率高于年轻人，约50%的失眠患者会转变为慢性失眠［4］。女性、老年人、退役军人、精神疾病患者等是失眠的易感人群，每年因失眠耗损的经济成本大，极大增添社会医疗负担［5］。长期失眠不仅会损伤机体出现各种躯体性疾病（如高血压病、高脂血症等），也会危害人体精神出现抑郁、焦虑等，还会危害人体的认知功能，从而影响日间社会功能。如今，国内外均意识到失眠问题的严重性，美国“全国睡眠基金会”提出了各个年龄段最佳睡眠时间［6］，我国卫生健康委员会在《健康中国行动（2019-2030年）》中提出，成人每日平均睡眠时间从2022年起到2030年要达到7~8 h［7］。如何满足人们对睡眠的需求是当今社会亟待解决的健康问题，缓解失眠方式安全有效，提升患者睡眠质量是治疗的首要目标。失眠发病的神经生物学机制错综复杂，神经生理、免疫、神经内分泌、基因等多因素共同参与了睡眠-觉醒的调控［8］。研究发现，睡眠障碍与神经网络有密切的联系，长期失眠会导致认知功能受损、专注力和警觉性下降及情绪失调等［9-11］。近年来，越来越多的研究发现中医药通过对脑内神经递质的调控、对神经元的保护发挥镇静催眠的作用，其中，星形胶质细胞网络、鸢尾素（irisin）/脑源性神经营养因子（BDNF）通路在此发挥了重要的作用［12-15］。因此明确神经元网络在睡眠-觉醒调节中的协同作用，对中医药防治慢性失眠的基础和临床研究都具有重要意义。1 资料与方法1.1　试验设计采用多中心、随机、双盲、安慰剂平行对照临床试验设计，由湖北省中医院、广东省中医院、甘肃中医药大学附属医院、武汉市中医医院共同完成。1.1.1　样本量估算查阅文献资料，参考相关临床试验，采用临床试验两样本率的计算公式n=2pq¯(Zα+Zβ)2(p1-p2)2进行样本含量估计（优效性），取α=0.05，β=0.10，p1是观察组的有效率为60%，p2为对照组的有效率为44%，计算得出n≈205，考虑到约15%的病例脱落率，观察组和对照组各纳入240例成人慢性失眠患者，平均分配到4个研究中心，每个中心观察组和对照组各纳入60例成人慢性失眠患者。1.1.2　随机分配和盲法由统计人员使用SPSS 25.0软件生成随机数字表，利用随机数字表法，按照1∶1的比例分为A、B两组，并制成卡片形式，使用不透光信封密封，信封由专人统一保管和负责拆封。临床观察中所使用的药物分为1号药和2号药由专人管理，分别对应A、B两组，按照拆封指令发药。采取研究实施者和患者双盲的方法：一是入组患者对应的分组结果；二是对入组患者用药所对应的分组编号［16］。若患者发生严重不良反应需中止观察时，随机分配表须当面揭封。1.1.3　伦理审查本研究方案遵从赫尔辛基宣言，方案实施前已通过湖北省中医院伦理委员会审批（批件号HBZY2019-C40-01），并且，已在中国临床试验注册中心完成注册（注册号为Chi CTR1900027594）。1.1.4　知情同意在患者入组之前，研究者需向符合纳入标准的患者详细介绍本研究的相关情况，包括研究目的、干预措施、可能的受益、需履行的义务、可能的风险和不便，并告知受试者会被随机分配到研究的不同组别，受试者和研究人员都无法事先知道和选择。受试者有权决定是否参加本次研究，并在入组前签署知情同意书。1.1.5　随访治疗2周后、疗程结束1个月后各随访1次。观察期间通知患者定期到门诊复诊，通过门诊、电话、微信等方式进行随访。1.2　诊断标准1.2.1　西医诊断标准慢性失眠诊断标准参考国际睡眠疾病分类第三版（ICSD-3）诊断标准。满足ICSD-3标准中A-F所有症状条目均满足即可诊断为慢性失眠。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230291.T001表1ICSD-3慢性失眠的诊断标准Table 1ICSD-3 diagnostic criteria for chronic insomnia序号标准解释A患者自诉或患者家属或家庭护理员观察到满足下列1个或多个失眠表现①入睡困难；②维持睡眠困难；③比期望的时间早醒；④拒绝在适宜的时间段上床睡觉；⑤不在患者家属和家庭护理员的辅助下难以入睡B患者自诉或患者家属或家庭护理员观察到满足下列1个或多个与失眠相关的表现①疲劳、乏力；②注意力和记忆力减退；③社交、家庭、工作和学术表现能力减退；④急躁易怒，情鳍不稳定；⑤白天嗜睡；⑥行为功能异常（如：多动症，易冲动，具有攻击性）；⑦动机、能力、首创性明显减少；⑧容易犯错；⑨担心睡眠或对睡眠质量不满意C不能单纯用睡眠机会不足和睡眠环境差来解释的失眠-D发生睡眠障碍及失眠相关日间症状至少3次/周-E发生睡眠障碍及失眠相关日间症状至少持续3个月-F睡眠-苏醒困难不能被其他睡眠障碍解释-1.2.2　中医诊断及辨证分型标准失眠属中医学“不寐”的范畴，其辨证标准参考全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材《中医内科学》中“不寐”虚证的辨证标准，包括心脾两虚证、阴虚火旺证、心胆气虚证。心脾两虚型：主证为不易入睡，睡而不实，多眠易醒，醒后难以复寐、心悸健忘。次证为神疲乏力，四肢倦怠，纳谷不香，面色萎黄，口淡无味，腹胀便溏。舌脉为舌质淡苔白，脉细弱。阴虚火旺型：主证为夜难入寐，甚则彻夜不眠。次证为心中烦乱，头晕耳鸣，潮热盗汗，男子梦遗阳痿，女子月经不调，健忘，口舌生疮，大便干结。舌脉为舌尖红少苔，脉细。心胆气虚型：主证为心悸胆怯，不易入睡，寐后易惊。次证为遇事善惊，气短倦怠，自汗乏力。舌脉为舌质淡苔白，脉弦细。1.3　材料1.3.1　仪器ME203E/02型电子天平（中国梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KZ-Ⅱ型高速组织研磨仪、MX-F型涡旋混合器（中国武汉赛维尔生物科技有限公司），Epoch型酶标检测仪（美国伯腾仪器有限公司），D3024R型台式高速冷冻离心机（中国大龙兴创实验仪器北京股份公司），耗材所需移液器、离心管等均购于中国武汉赛维尔生物科技有限公司。1.3.2　试剂胶质纤维酸性蛋白（GFAP）试剂盒（批号N13016062）、BDNF试剂盒（批号N14016063）、irisin试剂盒（批号N15016064）均购于武汉华美生物工程有限公司，于2~8 ℃保存备用。1.4　研究方法1.4.1　研究对象以武汉、广州、兰州3个地区入组的480例成人慢性失眠患者为研究对象，观察组为安寐丹颗粒剂（重庆华森制药股份有限公司，批号202009001），11 g/次，3次/d，温开水冲服；对照组为安寐丹模拟剂（重庆华森制药股份有限公司，批号202009002），11 g/次，3次/d，温开水冲服。两组患者入组后均给予睡眠卫生宣教，用药疗程为4周。1.4.2　纳入标准①满足慢性失眠ICSD-3诊断的患者，病程≥3个月，符合中医学“不寐”虚证的证候表现；②性别不限，年龄18~80岁；③近1个月内未使用抗抑郁、抗焦虑类药物；④能理解失眠相关量表的内容并积极配合治疗；⑤签署知情同意书。1.4.3　排除标准①尚未得到有效控制或者严重的疾病（临床医生判断），如各种原因引起的持续疼痛、恶性肿瘤、心脑血管疾病、内分泌疾病、神经肌肉疾病和消化道疾病等导致的失眠患者；②精神病患者；③中、重度焦虑和抑郁的患者（汉密尔顿焦虑量表≥14分，汉密尔顿抑郁量表-24项评分≥20分）；④怀孕及哺乳期患者；⑤参与其他临床观察者；⑥其他原因研究者认为不适宜参加本次临床试验者。符合上述任意1项者，即予以排除。1.5　剔除、脱落病例标准1.5.1　剔除标准①入选后发现患者不符合纳入标准的病例；②使用了方案规定的禁用药物和方法；③纳入后未曾用药的病例；④服药后无任何可评价记录的病例。1.5.2　脱落病例标准①患者自行退出；②失访；③患者依从性太差或出现严重不良事件，研究者令其退出并详细记录原因。1.6　观察指标1.6.1　量表评估指标比较治疗前后患者阿森斯量表（AIS）和Spiegel量表评分［17-18］，评价两组治疗前后的睡眠变化情况。①阿森斯失眠量表（AIS），总分24分，得分越高表示睡眠质量越差，在治疗前后分别进行评定。②Spiegel量表，由6个自评条目组成，分为每晚上床入睡时间、一夜总睡眠时间、夜醒次数、睡眠深度、夜间做梦情况、醒后感觉，每个自评条目0、1、3、5、7计分，累积总分0~42分。总分越高表示睡眠质量越差，总分12~17分为轻度失眠症；18~23分为中度失眠症；≥24分为重度失眠症。1.6.2　血清指标本次研究拟从入组的480例患者中抽取240例患者完成血清学指标检测，由于部分患者因自身原因不愿配合完成治疗后的采血，以及血清标本需从外地长途运送至武汉统一处理，在运输途中有部分受损。最终共计215例患者的血清标本纳入检测、分析，其中，观察组113例，对照组102例。用促凝采血试管抽取2组失眠患者清晨肘静脉血3 mL，待血液凝固后离心（4 ℃，3 000 r·min-1离心15 min，下同）取上清，并置于-80 ℃保存备测，采用BioTek酶联免疫分析仪检测血清GFAP、BDNF和irisin水平。检测并比较治疗前后2组患者血清GFAP、BDNF和irisin水平。按试剂盒的说明书进行酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测具体操作（不同指标操作略有不同），样本应清澈透明，悬浮物应离心去除；避免使用溶血或高血脂样本；样本收集后需于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融。1.7　统计学方法统计分析采用SPSS 25.0软件，所有的统计学检验均采用双侧检验，符合正态分布计量资料以x¯±s表示，组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布计量资料以中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以频数（%）表示，组间比较采用卡方检验或Wilcoxon秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1　两组患者一般资料比较本次研究共纳入480例成人慢性失眠患者，脱落65例，脱落率为13.54%。最后纳入分析415例，分别是观察组213例（脱落27例），其中广东省中医院48例，湖北省中医院54例，武汉市中医医院54例，甘肃中医药大学57例；对照组202例（脱落38例），其中广东省中医院47例，湖北省中医院52例，武汉市中医院51例，甘肃中医药大学52例。两组患者的一般人口学资料。①年龄，观察组患者年龄在18~79岁，年龄中位数51（38，62）岁；对照组患者年龄18~79岁，年龄中位数52（35，63）岁，两组患者年龄比较差异无统计学意义（Z=0.364，P=0.716）。②性别，观察组男性90例（37.5%），女性150例（62.5%）；对照组男性94例（39.2%），女性146例（60.8%），两组患者性别分布比较，差异无统计学意义（χ2=0.141，P=0.707）。2.2　两组患者治疗前后AIS量表和Spiegel量表评分比较治疗前，两组组患者的AIS量表、Spiegel量表评分比较差异无统计学意义，资料具有可比性。与本组治疗前比较，治疗后两组患者的AIS量表、Spiegel量表评分均显著较低，差异有统计学意义（P0.01）。与对照组治疗后比较，观察组患者AIS量表、Spiegel量表评分改善情况显著优于对照组，差异有统计学意义（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230291.T002表2两组患者治疗前后AIS量表、Spiegel量表评分比较 （x¯±s）Table 2Comparison of AIS and Spiegel scale scores between two groups before and after treatment （x¯±s）组别例数时间AIS量表评分Spiegel量表评分观察组213治疗前12.19±3.1418.41±5.51治疗后7.19±1.871，2）10.55±3.101，2）对照组202治疗前12.02±3.4917.87±5.21治疗后9.17±2.221）13.35±3.431）注：与本组治疗前比较1）P0.01；与对照组治疗后比较2）P0.01分2.3　两组患者治疗前后血清BDNF、GFAP和irisin水平比较纳入血清检测的患者中，观察组平均年龄为（48.89±16.10）岁，对照组平均年龄为（66.97±16.49）岁，二者比较差异无统计学意义（t=0.865，P=0.388）。观察组患者中男性37例（32.7%），女性76例（67.3%）；对照组中男性41例（40.2%），女性61例（59.8%），两组患者性别比较差异无统计学意义（χ2=1.288，P=0.256）。治疗前，比较两组患者血清BDNF、GFAP、irisin的水平差异无统计学意义，资料具有可比性。与本组治疗前比较，治疗后，观察组患者血清BDNF的水平较治疗前降低，但差异无统计学意义（Z=-1.354，P=0.176），血清irisin的水平较治疗前升高，血清GFAP的水平较治疗前降低，差异有统计学意义（P0.05）。与对照组治疗后比较，观察组患者血清irisin水平明显升高，差异有统计学意义（P0.05），血清BDNF、GFAP水平有降低趋势，但差异均无统计学意义。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230291.T003表3治疗前后两组患者血清BDNF、GFAP和irisin水平比较 ［M（Q1，Q3）］Table 3Comparison of serum BDNF，GFAP，and irisin levels between two groups of patients before and after treatment ［M（Q1，Q3）］组别例数时间BDNFGFAPirisin观察组113治疗前0.97（0.70，1.60）2.92（2.06，4.35）21.35（7.89，51.52）治疗后0.75（0.45，1.19）2.04（1.35，3.61）1）21.85（8.61，53.72）1，2）对照组102治疗前1.03（0.62，1.86）2.82（2.00，4.11）15.32（8.36，36.43）治疗后0.75（0.49，1.13）2.09（1.36，3.88）21.10（7.98，42.25）注：与本组治疗前比较1） P0.05；与对照组治疗后比较2）P0.05ng·L-12.4　安全性评价两组患者均未发生严重不良反应。治疗前，两组患者的血常规、肝肾功能、尿常规以及心电图检测结果基本均在正常范围内，治疗后两组患者的上述相关指标检测未见明显异常改变，表明中药安寐丹治疗成人慢性失眠安全。3 讨论失眠属于中医学“不寐”“不得卧”范畴，其病机特点多为虚实夹杂。中医学对失眠的认识从营卫阴阳、五神、脏腑等立论，《黄帝内经》以营卫的昼夜节律变化来阐述了人体的睡眠节律周期变化，并指出卫气出入运行失常致阴阳失衡是不寐的病机表现，正如《黄帝内经·灵枢·大惑论》云：“卫气不得入于阴，常留于阳，留于阳则阳气满，阳气满则阳跷盛，不得入于阴则阴气虚，故目不得瞑矣”。中医学还认为，元气亏虚是百病之源，在中医古籍中，亦有关于元气亏虚导致“不寐”的记载。如《黄帝内经·灵枢·营卫生会》云：“老者之不夜寐者，何气使然……老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩……此昼不精，夜不瞑。”慢性失眠多由失眠反复发作，迁延不愈所导致，日久伤及人体正气，因此慢性失眠患者以“虚证”多见。本研究依托于国家重点研发计划项目课题，旨在探寻安全、不良反应小、疗效明显的慢性失眠治疗方案，故从虚证入手，面向广大慢性失眠人群，采用双盲、随机对照临床实验验证安寐丹对慢性失眠虚证患者的有效性与安全性，为慢性失眠的中医药防治提供科学依据。近年来中医药在失眠的防治中的应用和相关研究受到广泛关注，以酸枣仁汤、归脾汤、温胆汤等为主方的众多方剂单用或联合西药催眠药物使用，其临床疗效显著，同时被证实可以减轻催眠类西药使用后的药物依赖或停药后的戒断反应［19-20］。还有基础研究结果也显示酸枣仁汤、归脾汤等补虚方能够减轻神经炎症反应、保护海马神经元、调节脑内单胺类神经递质，从而改善睡眠剥夺大鼠的失眠症状和学习记忆能力［21-22］。正常的睡眠是脑组织修复损伤和处理信息的重要途径；学习、记忆等认知功能是大脑高级功能活动表现的具体形式。众多研究表明，长期反复失眠会损害人体神经元、改变神经突触结构继而损害认知功能；认知障碍的疾病（如阿尔茨海默病等）会出现碎片化睡眠、易醒等睡眠障碍的临床表现，故失眠与认知障碍高度相关［23-25］。酸枣仁汤是治疗虚证失眠的经典名方，尤其适用于“阴虚血热证”，其效应机制已逐渐明朗［26-28］，①可能是调控γ-氨基丁酸（GABA）/谷氨酸、5-羟色胺、去甲肾上腺素以及多巴胺等多种兴奋性或抑制性神经递质的水平，有效调节睡眠障碍患者神经内分泌功能；②可能通过影响白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子和BDNF、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的表达水平发挥神经元保护、修复认知功能的作用；③可能减少胶质细胞激活，改善神经细胞功能。本研究中安寐丹源自清·陈士铎所著《石室秘录》，是在酸枣仁汤的基础上加减化裁，以现代工艺制备成颗粒剂应用于临床试验，安寐丹全方由生熟枣仁、人参、麦冬、丹参、炙甘草等药物组成，以酸枣仁为君药，在酸枣仁汤原方基础上增添补益之力度，使酸甘化阴而柔肝阴，阴中求阳，增补人体之元气，使气血阴阳并补，与慢性失眠所致诸虚证方证对应。有现代药理学研究表明酸枣仁皂苷A能促进心肌线粒体环氧化酶（COX）表达介导的膜电位恢复ATP酶活性发挥改善失眠的功效［29］。还有学者通过差异代谢物分析酸枣仁入血代谢成分，确定了甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶1（GPCPD1）、含patatin样磷脂酶结构域蛋白7（PNPLA6）和受磷蛋白1（PLB1）等改善失眠的可能作用靶点［27］。课题组前期探索使用安寐丹防治失眠的效应机制有初步成果。从线粒体-能量代谢角度证实安寐丹能调控睡眠剥夺大鼠的能量代谢，修复线粒体分裂、融合失衡状态，调控AMPK信号通路介导的线粒体生物合成等机制来改善睡眠剥夺大鼠的睡眠和能量代谢，保护认知功能［30-32］；从昼夜节律角度证实安寐丹能调控睡眠剥夺模型斑马鱼昼夜节律及能量代谢，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶（MNK）/真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）通路和生物钟蛋白的调节可能是调节昼夜节律改善紊乱的关键环节［33-34］；从神经元保护角度发现安寐丹能调控线粒体介导的海马神经细胞凋亡和星形胶质细胞活性改善失眠大鼠学习记忆水平［35-36］。但安寐丹对失眠患者的效应机制还缺乏深入研究。本研究纳入的患者多为中老年，而中老年患病多为虚证，符合慢性失眠患者元气亏虚，以虚证为主的特点。治疗前两组患者的AIS量表、Spiegel量表评分比较，差异没有统计学意义。完成4周治疗后，两组患者AIS量表、Spiegel量表评分较治疗前均有所降低，且治疗后观察组患者的AIS量表、Spiegel量表评分较对照组降低，差异有统计学意义。安寐丹可降低慢性失眠患者的AIS量表、Spiegel量表评分，通过主观量表评估的方式证实该方能够有效减轻患者的失眠症状、改善患者的睡眠质量、提高睡眠效率。irisin在神经系统中的作用逐渐被阐明，其在应激状态下可以经内吞入胞，靶向线粒体，与线粒体解偶联蛋白2（UCP2）结合发挥线粒体保护作用。运动不仅可以引起外周鸢尾素水平的增加，还可以直接上调海马中纤连蛋白Ⅲ型结构域蛋白5（FNDC5）的表达，并调控海马内脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，发挥神经保护作用。而且，外周鸢尾素浓度的升高，可以通过血脑屏障进入脑内增加海马中BDNF的表达，同时还可以诱导其他神经保护基因的表达［37］。有研究显示结果显示，在慢性失眠患者外周血中，其血清鸢尾素、BDNF水平较健康人群偏低，提示鸢尾素缺乏可能导致BDNF表达减少，使神经元生长发育分化受到影响［38］。在本此研究中，结果显示通过安寐丹治疗4周后，观察组患者血清鸢尾素的水平较治疗前升高，提示安寐丹可以缓解患者的主观失眠感受、提高睡眠质量，其治疗作用的发挥可能在于上调了外周血清中鸢尾素的水平，但目前关于鸢尾素在睡眠障碍类疾病中的研究尚不足，有待进一步的研究证实。治疗后观察组患者血清BDNF的水平没有发生明显的变化，与治疗前相比差异无统计学意义，可能说明安寐丹对失眠患者外周血中BDNF的水平没有明显影响，这与前期文献研究中发现中药成分上调慢性失眠患者血清BDNF表达水平的结果有所出入，尚有待于进一步研究论证。星形胶质细胞在脑内能够支持神经元并为其提供能量，同时对脑内神经递质的释放及其功能的发挥起到调节作用［39］，例如星形胶质细胞可以通过调节细胞外谷氨酸的释放，使谷氨酸/GABA保持平衡，从而对睡眠-觉醒节律起到调节作用。兴奋性谷氨酸转运体-1（GLT-1）在中枢神经系统中主要分布于星形胶质细胞，GLT-1的失调可能造成谷氨酸兴奋性毒性作用，产生相关的神经病理表现，例如过度觉醒状态，本团队的前期研究结果表明，安寐丹可能通过抑制星形胶质细胞的活力和功能，调控GLT-1的表达水平，减轻谷氨酸在中枢神经系统的兴奋性毒性作用，从而发挥改善睡眠剥夺大鼠的睡眠质量、提高学习记忆能力的作用［40］。GFAP是成熟星形胶质细胞中主要的中间丝蛋白，其水平的变化反映了星形胶质细胞的活力和功能。外周血GFAP的水平与中枢GFAP的水平呈正相关，在本研究中，课题组发现经过安寐丹干预4周后，观察组患者外周血清GFAP的水平较治疗前有所降低，提示安寐丹可降低失眠患者外周血GFAP的水平，前期的基础研究结果也显示安寐丹能够降低睡眠剥夺大鼠海马中GFAP的表达［41］，这与此次研究结果相一致。综上所述，安寐丹能明显改善慢性失眠虚证患者睡眠质量，保护神经元，增加神经元营养因子的分泌，提高学习记忆能力的保护作用。但本研究还存在一定的缺陷：①研究主要停留在现象型指标的检测，缺乏深入机制的探讨；②中医证型过于笼统，不寐虚证所包含的证型颇多，虽体现了中医药异病同治，多靶点的治疗优势但缺乏明确证型的探索；③安寐丹出自古书，为治不寐良方，但缺乏更多现代药理学研究探究其入血成分，后续研究可进一步采用网络药理学、代谢组学等分子对接技术筛选出治疗慢性失眠、认知损伤的效应靶点，为中医药防治失眠提供更加坚实的科学依据。