结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，现仍高居全球癌症发病率第3位（10.0%）、死亡率第2位（9.4%）［1］。在发达国家结直肠癌的发病率和死亡率已出现下降趋势［1-2］，但在我国仍呈逐年上升趋势，多数确诊患者已至中晚期［3］。以奥沙利铂为代表的FOLFOX联合方案治疗中晚期结直肠癌的临床获益仍受限，这源于肿瘤微环境诱导了抗肿瘤治疗抵抗与不良反应［4］。因此，寻找更为有效的治疗结直肠癌的临床药物仍是时下研究重点。结直肠癌的发生、发展有赖于多种机制，其中肿瘤细胞与肿瘤基质构成的肿瘤微环境越来越受到学者的重视。越来越多地研究结果表明，M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在结直肠癌组织中聚集性表达，从而导致肿瘤微环境多呈免疫抑制性表型［5-6］，是导致结直肠癌治疗抵抗的关键因素，这也往往提示预后不良［7］。因此，调控肿瘤微环境中TAMs募集与活化，进而重塑肿瘤免疫微环境，是当前提升结直肠癌临床疗效的热点领域之一。中医学暂无结直肠癌病名，归属“肠积” “脏毒” “肠蕈”等范畴讨论，并认为其发病的核心病机是“诸脏皆虚，唯有邪实”，故常在脏腑亏虚基础上，湿热、瘀血、痰凝等毒聚日久而成有形积块，正如《黄帝内经·素问·评热病论》所言“邪之所凑，其气必虚”，故而治法上应时刻重视在正气培补基础上攻伐癌毒，而癌毒减弱更要扶正，以期达到“治癌治未病，邪去正自安”［8-10］。白头翁汤始记载于《伤寒杂病论》，由白头翁、黄柏、黄连、秦皮4味中药组成，原方以苦寒入阳明血分的白头翁为君，清热凉血以解毒，臣以黄连、黄柏而助君药清热解毒，又能燥湿止痢而厚肠，秦皮苦寒性涩为佐使，加强燥湿解毒之力，又能凉肝益肾而固下焦，四药合用常用于治疗肠道湿热毒邪停滞之疾，这与结直肠癌的病机吻合，且白头翁汤已在临床治疗中展现出对结直肠癌良好的治疗作用，具有广泛的抗炎、抗肿瘤免疫调节等作用［11-12］。然而，白头翁汤作为治疗肠道“湿热瘀毒”病证的攻伐驱邪之剂，恐有伤正之虞，故加入扶正治癌药对黄芪、女贞子、藤梨根及调和诸药的炙甘草而成加味白头翁汤，更加符合结直肠癌“正气已亏而邪气集聚为患”的病机特点，共奏解毒散结、扶正抗癌之功［13］。同时，前期临床应用中发现加味白头翁汤具有良好的抗肿瘤治疗活性。鉴于此，本研究在既有研究基础上对加味白头翁汤的治疗潜力展开深入探析，以期寻找到中医药平衡肿瘤微环境免疫正常化的治疗钥匙。据此，本研究拟进一步以结直肠癌荷瘤小鼠为研究对象，通过建立鼠源MC38细胞株C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，明确加味白头翁汤对荷瘤小鼠瘤体生长的治疗效应，并结合体外建立的MC38细胞株与白细胞介素（IL）-4诱导的鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞共培养模型，深入探讨加味白头翁汤对TAMs活化表型的影响，以期阐明其可能的抗肿瘤免疫调节效应及分子机制。1 材料1.1　动物选取50只健康雌性C57BL/6小鼠（6周龄，体质量16~18 g）和20只健康雌性SD大鼠［5~6周龄，体质量（135±15） g］，均购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号SCXK（沪）2022-004，所有动物均饲养在相对温度（25±2）℃、相对湿度40%~50%的SPF级屏障环境中，动物均自由摄食与饮水（项目伦理备案号2023-MWLLSC-20，备案单位上海市静安区中医医院）。1.2　细胞鼠源结直肠癌MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7，均购自上海圆创生物科技有限公司（货号分别为YCMO11、YCMOO8），均传至第3代。1.3　药物加味白头翁汤由白头翁15 g、黄连6 g、黄柏9 g、秦皮12 g、黄芪30 g、女贞子15 g、藤梨根15 g、炙甘草6 g组成，均采用我院临方定制颗粒剂，委托上海万仕诚国药制品有限公司生产加工（规格为每帖中药饮片108 g，依照流程每帖饮片出颗粒大约20.50 g，批号202202051008），采用煎煮、浓缩、喷雾干燥、制粒等方法制成，充分保持了原煎剂的特色，全方使用由蒸馏水制成含生药为2.343 g·mL-1的药液，在4 ℃环境保存备用；奥沙利铂（L-OHP）（江苏恒瑞医药股份有限公司，规格100 mL：0.1 g，批号190422AL，国药准字H20000337）；集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂（BPR1R024，美国MedChemExpress公司，规格10 mg/支，分子式C24H21F3N6O2，CAS号2503015-75-4）。1.4　试剂DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶消化液（美国Gbico公司，货号分别为C11995500BT、C2027050、25200056）；青霉素-链霉素溶液（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号PB180120）；磷酸盐缓冲液（PBS，美国HyClone公司，货号SH30256.01B）；细胞增殖与活性检测（CCK）-8试剂盒（日本同仁化学，货号ck04）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司，货号R0016）；0.1%吉姆萨染色液、脱脂奶粉、RIPA裂解液、Tris-HCl电泳缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为C0131、P0216、P0013B、ST466-500mL、P0010S、P0018M）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，货号CW0022S）；Matrigel基质胶（美国Corning公司，货号356234）；佛波酯（PMA）、蛋白预染Marker、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（爱必信上海生物科技有限公司，货号分别为abs9107、abs923、abs9217）；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）试剂盒（上海伯豪生物技术有限公司，货号DNF476）；SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒（日本TaKaRa公司，货号RR071A）；IL-4（北京同立海源生物，货号GMP-TL30）；IL-6、转化生长因子-β（TGF-β）、趋化因子配体2（CCL2）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（美国eBioscience公司，货号分别为EH449RB、BMS603-2、BMS6005），CD4 兔单抗 mAb、CD8 兔单抗 mAb、CD86-PE-Cy7 兔单抗 mAb、CD206 兔单抗 mAb、F4/80-FITC 兔单抗 mAb、CSF1R 兔单抗 mAb、干扰素基因刺激蛋白（STING） 兔单抗、TANK结合激酶1（TBK1） 兔单抗、β-actin 兔单抗、辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（美国CST公司，批号分别为93518S、85336S、76755SF、30325T、87887SF、67455S、13647S、38066S、93473SF、98164S）；DAPI（北京索莱宝科技有限公司，货号C0065）；小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参引物[生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B662304]。1.5　仪器Transwell小室（美国Corning公司）；Multiskan FC型酶标仪、Heracell 150i型CO2培养箱、恒定恒流蛋白电泳槽系统、Invitrogen iBright凝胶成像系统（美国Thermo公司）；Centrituge 5415R型高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；Primovert型倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）；FACS CantoTM型流式细胞仪（美国BD公司）；CFX96 CFX connect型Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司）；KZ-Ⅲ-F型高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；TB Green® Premix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）（日本Takara公司，货号RR420A ）。2 方法2.1　细胞培养参考文献［14］及说明书，MC38细胞和RAW264.7巨噬细胞均用完全培养基（10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液+89%DMEM）培养在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，待细胞融合度达80%时，常规消化分瓶传代，后续实验选取对数生长期细胞。2.2　体内皮下移植瘤模型复制及分组给药参考文献［15］使用MC38细胞株建立C57BL/6小鼠皮下结直肠癌移植瘤模型，取对数生长期的MC38细胞，常规消化3 500 r·min-1离心10 min，计数制备成浓度为1×107个/mL的单细胞悬液，以每只0.2 mL细胞悬液接种至小鼠前腿右侧腋窝皮下，接种后第5天于造模小鼠右腋下可触及较均一圆形肿块即为造模成功。将成瘤动物依体质量随机分为4组，每组10只，即模型组（予每只小鼠腹腔注射生理盐水0.4 mL，每2 d/次）；L-OHP组（予每只小鼠腹腔注射L-OHP溶液0.4 mL，含有L-OHP 0.211 2 mg，每2 d/次）；加味白头翁汤低剂量组［依临床成人（60 kg）的用药剂量，按照人与小鼠的换算比例计算出实验小鼠用药剂量为23.43 g·kg-1，据此设立低剂量组及加味白头翁汤高剂量组（临床成人日用量的2倍剂量即46.86 g·kg-1），两组动物依照给药浓度每只灌胃剂量为0.2 mL，早晚各1次。4组成瘤小鼠共连续给药10 d，另设立10只正常小鼠为空白组。2.3　一般观察指标、抑瘤率计算及标本处理参考文献［16］日常观察各组小鼠进食状况、活动状态、脱毛及生存情况等，每天监测各组小鼠体质量与瘤体生长大小，由专人用游标卡尺测量瘤体长短径各测3次，求得长径均值和短径均值，计算瘤体体积，即瘤体体积=1/2×长径×短径2。造模后第15天经麻醉、颈椎脱臼处死小鼠，无菌抽取外周血并在4 ℃、 3 500 r·min-1离心10 min吸取血清，无菌取脾脏、肿瘤组织，称重记录，冻存或4%多聚甲醛脱水保存。抑瘤率=（模型组瘤体均重-干预组瘤体均重）/模型组瘤体均重×100%。2.4　HE染色检测加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学的影响采用HE染色检测各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理情况。待体内干预实验结束后取各组荷瘤小鼠肿瘤组织，浸入多聚甲醛中进行固定，常规石蜡包埋、切片后，检测时脱蜡、水化后依次进行苏木素和伊红染色，各梯度乙醇脱水，透明切片滴上树胶封片，镜下观察各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学变化。2.5　CCK-8法检测加味白头翁汤含药血清对细胞增殖活力的影响参考文献［16］制备流程与标准，采用随机数字表法将20只SD大鼠随机分成空白血清组（空白组）与含药血清组（各10只），按照既定人与大鼠体表面积之比（1∶6）换算成临床等效剂量为0.004 3 mg·g-1，空白组给予同等剂量的生理盐水。给药频率，每日灌胃2次，早晚各1次，连续给药6 d，禁食12 h后于灌胃给药第7天上午灌胃1 h后，依照动物伦理麻醉后，经腹主动脉无菌采血，37 ℃静置2 h，3 000 r·min-1离心15 min（离心半径13.5 cm，下同），无菌分离血清，所有血清56 ℃水浴灭活后0.22 μm微孔过滤除菌，分装放置-20 ℃冰箱保存备用。参考文献［14］首先使用终质量浓度为150 μg·L-1的PMA激活RAW264.7细胞后（即M0型巨噬细胞），取其对数生长期的RAW264.7细胞和MC38细胞，分别以每孔100 μL（含细胞4×103个）接种至96孔板，每组3个复孔，待细胞贴壁后，依空白组（DMEM）、IL-4组（20 μg·L-1）及加味白头翁汤含药血清组（工作浓度分别为50、100、150、200、250、300、500、750 μmol·L-1）等进行干预，并再次使用加味白头翁汤含药血清与RAW264.7细胞共孵育24 h后的细胞上清液作为条件培养基加入MC38细胞中进行干预，分别经24、48 h孵育后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育2 h，450 nm处测定各孔吸光度A，检测计算细胞增殖活力。2.6　Transwell侵袭实验检测RAW264.7细胞经IL-4诱导前后巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力及加味白头翁汤含药血清干预的影响参考文献［14］首先使用终质量浓度为150 μg·L-1的PMA+激活RAW264.7细胞后（即M0型巨噬细胞），培养24 h后加入终质量浓度为20 μg·L-1的IL-4，诱导RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞分化，接着建立MC38细胞株与M2型巨噬细胞共培养模型，使用Matrigel基质胶预埋的Transwell小室6孔板，按比例数量于上下室分别接种MC38细胞（每孔含12×104个细胞）与M2型巨噬细胞（每孔含10×104个细胞），设立下室接种M0型巨噬细胞（每孔含10×104个细胞）进行空白对照与验证，待细胞贴壁后，并使用终浓度为100、250、500 μmol·L-1的加味白头翁汤含药血清进行给药干预，最后共培养24 h后，4%多聚甲醛脱固定15 min后，使用0.1%吉姆萨染色液进行染色，镜下随机选取5个视野拍照记录及计算细胞侵袭数量。2.7　流式细胞术检测加味白头翁汤含药血清对M2型巨噬细胞极化数量的影响M2型巨噬细胞诱导与分组依2.5项下方法进行，共同孵育24 h后，消化收集下室细胞，制成单细胞悬液，依参考文献［14］与说明书加入表面荧光抗体（CD86-PE-Cy7、F4/80-FITC），2~8 ℃避光孵育30 min或常温避光孵育15 min，随后加PBS 1 mL清洗细胞，4 ℃、3 500 r·min-1离心5 min，再加入PBS 400 µL重悬，然后上机检测，并利用Image J软件进行统计分析。2.8　Real-time PCR检测加味白头翁汤含药血清对巨噬细胞相关极化细胞因子mRNA表达水平的影响M2型巨噬细胞诱导依2.5项下方法进行，使用终浓度为3 μmol·L-1的CSF1R抑制剂与终浓度为250 μmol·L-1的加味白头翁汤含药血清进行给药干预，共同孵育24 h后，收集下室细胞，使用TRIzol试剂盒提取总RNA，SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒逆转录提取总cDNA，所用反应体系用Real-time PCR法进行检测。根据GenBank中基因序列设计PCR引物，检测CD86、iNOS、IL-12、CD206、CD163、IL-10，以GAPDH为内参照，所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，设置反应程序，目标基因的表达量用2-ΔΔCt比较法进行靶基因mRNA含量评估。反应条件，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共40个循环。各引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T001表1TAMs相关极化细胞因子引物序列Table 1Primer sequences for TAMs related polarized cytokines引物序列（5'-3'）长度/bpCD86上游TCTGCCGTGCCCATTTACAAAGG124下游TGTGCCCAAATAGTGCTCGTCAGiNOS上游CAGCTGGGCTGTACAAACCTT199下游CATTGGAAGTGAAGCGTTTCGIL-12上游AGTGACATGTGGAATGGCGT135下游CAGTTCAATGGGCAGGGTCTCD206上游GGGACTCTGGATTGGACTCA132下游CCAGGCTCTGATGATGGACTCD163上游AATCACATCATGGCACAGGTCACC130下游TCGTCGCTTCAGAGTCCACAGGIL-10上游TTGGGGCTTCCTAACTGCTAC141下游GAAGTGGTTGGGGAATGAGGGAPDH上游AGGTCGGTGTGAACGGATTTG123下游 GGGGTCGTTGATGGCAACA2.8　检测加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠外周血清中细胞因子TGF-β、IL-6、CCL2分泌水平待动物实验结束后，摘眼球取小鼠外周血，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min取上清，按试剂盒内说明进行操作，每孔加入标准液、对照液或样品50 µL，依据时间梯度37 ℃孵育结束后，洗板晾干，加入小鼠TGF-β、IL-6、CCL2结合物，37 ℃环境下行二次孵育后，加入底物溶液，最后避光孵育30 min后加入终止溶液，用酶标仪于450 nm处测量各孔A，根据数值与标准品浓度计算出TGF-β、IL-6、CCL2含量。2.9　检测加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD206+ TAMs细胞浸润数量待动物实验结束后，肿瘤组织常规固定切片，抗原修复缓冲液对切片进行抗原修复后，用含有10%山羊血清的PBS 37 ℃孵育30 min，封闭抗体的非特异性结合，再用稀释后兔抗小鼠抗体CD4、CD8、CD206于湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，用二抗37 ℃避光孵育细胞1 h，用PBS避光洗涤3次，最后滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，清洗晾干后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察随机采集5个图像并统计阳性细胞个数。2.10　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R/STING-TBK1信号通路关键蛋白表达水平的影响提取各组荷瘤小鼠肿瘤组织总蛋白，制胶、上样、SDS电泳，转蛋白至PVDF膜，依照浓度比例稀释一抗［（CSF1R单抗、STING单抗、TBK1单抗、β-actin单抗（1∶800）］，4 °C孵育过夜。TBST洗后，孵育二抗（羊抗兔IgG 1∶500），ECL化学发光法上机曝光检测。利用Image J软件进行光密度分析计算，以β-actin作为内参。2.11　数据整理与统计分析所有实验结果数据均采用SPSS 27.0进行分析，结果以x¯±s表示，数据先进行正态性检验和方差齐性检验，再行Student's t-检验和One-Way ANOVA分析，方差齐用最小显著性差异（LSD）法，方差不齐用Dunnett’T3法，对组内、组间进行两两比较，所有实验结果以P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　加味白头翁汤对结直肠癌MC38细胞C57BL/6小鼠皮下移植瘤瘤体生长及瘤重的影响体内使用MC38细胞株建立C57BL/6小鼠皮下结直肠癌移植瘤模型，小鼠于造模后第5天开始皮下成瘤，经L-OHP及高、低剂量加味白头翁汤灌胃给药10 d后，结果显示，与空白组比较，各组荷瘤小鼠体质量变化差异无统计学意义，仅模型组小鼠脾脏质量明显增加（P0.05），见表2。对比分析各组荷瘤小鼠给药治疗结束后的瘤体体积结果显示，模型组瘤体体积最大，余依次为加味白头翁汤低剂量组、L-OHP组，而加味白头翁汤高剂量组瘤体体积最小，瘤体质量最小（P0.05，P0.01），最终抑瘤率为32.52%，见表2，这表明加味白头翁汤能显著抑制MC38荷瘤小鼠瘤体的生长。上述实验结果证实了加味白头翁汤具有抗结直肠癌肿瘤生长活性。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T002表2加味白头翁汤干预结束后MC38荷瘤小鼠各参数变化（n=10）Table 2Dynamic effects of various parameters within MC38 xenograft tumors treated by modified Baitouwengtang （MBTWD） （n=10）组别剂量/g·kg-1体质量（x¯±s）/g瘤体体积（x¯±s）/mm3瘤重（x¯±s）/g抑瘤率/%脾脏（x¯±s）/g空白组20.78±0.49---0.08±0.04模型组21.52±0.55661.99±36.322.46±0.45-0.12±0.031）L-OHP组3×10-319.96±0.64537.85±37.163）1.71±0.543）30.490.10±0.03加味白头翁汤低剂量组23.4320.38±0.43580.05±26.682，4）1.82±0.532）26.024）0.11±0.02加味白头翁汤高剂量组46.8620.58±0.49513.56±36.573）1.66±0.463）32.520.11±0.04注：与空白组相比较1）P0.05；与模型组相比较2）P0.05，3）P0.01；与L-OHP组比较4）P0.053.2　加味白头翁汤对结直肠癌细胞MC38荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学的影响HE染色结果显示，模型组肿瘤组织中肿瘤细胞异型性显著，增生活跃，呈弥漫生长，且排列杂乱密集，细胞核大且深染，可见核分裂象；经L-OHP治疗后，肿瘤组织中可散见不同程度坏死区，坏死区细胞崩解，着色变淡，周围肿瘤细胞排列较为致密，正常肿瘤细胞与坏死区交界处肿瘤细胞排列松散，凋亡细胞略有增多，细胞间隙增大，并伴随着肿瘤间炎性细胞浸润，这表明L-OHP能有效诱导肿瘤细胞死亡。而加味白头翁汤高低剂量治疗后，肿瘤细胞排列密度相对模型组而言减小，着色变浅，亦出现不同程度坏死区，伴有肿瘤间炎性细胞浸润，尤以加味白头翁汤高剂量组更为明显。加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.F001图1加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学的影响 （HE，×200）Fig.1Effect of MBTWD on pathological morphology of tumor tissue after intervention of MBTWD （HE，×200）注：A.模型组；B.L-OHP组；C.加味白头翁汤低剂量组；D.加味白头翁汤高剂量组（图2、图3同）3.3　加味白头翁汤对结直肠癌细胞MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD206+ TAMs细胞浸润数量的影响在上述实验结果的基础上对其效应机制进一步分析发现，与模型组比较，加味白头翁汤干预组能显著增加肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润数量（P0.01），而CD4+ T细胞浸润数量差异无统计学意义，见图2和表3。进一步研究发现，模型组肿瘤组织中有大量CD206+ TAMs浸润，而加味白头翁汤干预后肿瘤组织中CD206+ TAMs浸润数量显著降低（P0.01），见图3和表3。这表明加味白头翁汤可能通过调节CD206+ TAMs浸润数量，上调MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润数量，进而改善其肿瘤免疫微环境抑制性表型有关，这也暗示加味白头翁汤可能对TAMs表型极化有调节作用。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.F002图2加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞浸润数量的影响 （免疫荧光，×200）Fig.2Phenotypic changes of T cells infiltrating tumor tissue during MBTWD treatment in groups of MC38 xenograft mice （IF，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T003表3加味白头翁汤干预后MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD206+ TAMs细胞浸润数量变化 （x¯±s，n=10）Table 3Quantity change of CD4+ T cells， CD8+ T cells， and CD206+ TAMs infiltrated into tumor tissue after intervention with MBTWD （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1CD4+ T细胞数CD8+ T细胞数CD206+ TAMs数模型组16.40±5.30452.70±68.40L-OHP组3×10-314.50±5.1034.60±7.101）347.20±55.041）加味白头翁汤低剂量组23.4313.50±4.2046.05±7.202，3）199.80±51.502，4）加味白头翁汤高剂量组46.8613.10±6.4078.56±6.502，4）105.60±48.802，4）注：与模型组比较1）P0.05，2）P0.01；与L-OHP组比较3）P0.05，4）P0.01个10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.F003图3加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD206+ TAMs细胞浸润数量的影响 （免疫荧光染色，×200）Fig.3Phenotypic changes of CD206+ TAMs infiltrating tumor tissue during MBTWD treatment in groups of MC38 xenograft mice （immunofluorescence，×200）3.4　加味白头翁汤对结直肠癌细胞MC38荷瘤小鼠外周血清中TAMs功能相关细胞因子分泌水平的影响对各组荷瘤小鼠外周血清中细胞因子检测发现，与正常组比较，模型组荷瘤小鼠外周血清中细胞因子TGF-β、IL-6、CCL2均明显上调（P0.05，P0.01），L-OHP组TGF-β、IL-6、CCL2分泌水平的影响差异无统计学意义。但对加味白头翁汤干预组的结果分析发现，与模型组比较，加味白头翁汤高剂量组干预后能明显下调IL-6、TGF-β和CCL2的分泌水平（P0.05，P0.01），而低剂量加味白头翁汤干预后外周血TGF-β的分泌水平差异无统计学意义，见表4。这佐证了加味白头翁汤能调控TAMs功能及相关细胞因子分泌以重塑肿瘤免疫微环境。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T004表4加味白头翁汤干预后MC38荷瘤小鼠外周血清中细胞因子TGF-β、IL-6、CCL2分泌水平变化 （x¯±s，n=10）Table 4Quantity change of TGF-β， IL-6 and CCL2 secreted in peripheral serum of MC38 xenograft mice after intervention with MBTWD （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1TGF-βIL-6CCL2空白组38.21±33.5934.13±35.1559.06±32.61模型组208.46±48.941）248.45±52.041）138.01±24.621）L-OHP组3×10-3195.68±45.73218.73±47.18115.78±28.53加味白头翁汤低剂量组23.43189.88±47.49169.96±50.072）89.99±31.462）加味白头翁汤高剂量组46.86161.92±46.812）151.87±48.133）72.13±38.243）注：与空白组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01ng·L-13.5　加味白头翁汤含药血清对MC38细胞、RAW264.7细胞及共培养后细胞活力的影响CCK-8法结果显示，MC38细胞、RAW264.7细胞分别经不同浓度加味白头翁汤含药血清干预24、48 h后，对二者细胞增殖活力无明显细胞增殖抑制作用，见表5和表6。但是，不同浓度加味白头翁汤含药血清与RAW264.7细胞共孵育24、48 h后的细胞上清液作为条件培养基加入MC38细胞中，分别孵育24、48 h后，结果显示，各条件培养基能明显抑制MC38细胞的增殖活力（P0.05），见表7。上述实验结果表明加味白头翁汤含药血清能介导巨噬细胞活化功能抑制MC38细胞增殖活性。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T005表5CCK-8检测加味白头翁汤含药血清对RAW264.7细胞的增殖抑制作用 （x¯±s，n=3）Table 5Cytotoxic effect of MBTWD containing serum on RAW264.7 cells was detected by CCK-8 kit in vitro （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1细胞增殖活力/%24 h48 h空白组92.12±1.0296.14±1.45IL-4组203）98.51±1.291）122.21±1.182）加味白头翁汤含药血清组5093.48±1.1495.47±1.1210092.74±1.5195.67±1.0515093.02±1.0194.81±1.1220091.86±1.0994.26±1.4325092.31±1.3495.78±1.2730091.46±1.1794.59±1.0450090.87±1.1894.38±1.6175090.59±1.0694.08±1.57注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01；3）表示质量浓度单位为μg·L-1（表7同）10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T006表6CCK-8检测加味白头翁汤含药血清对MC38细胞的细胞增殖抑制作用 （x¯±s，n=3）Table 6Cytotoxic effect of MBTWD containing serum on MC38 cells was detected by CCK-8 kit in vitro （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1细胞增殖活力/%24 h48 h空白组98.92±1.64100.34±1.42IL-4组202）98.47±1.50101.05±1.10加味白头翁汤含药血清组5097.55±1.2899.68±1.4610096.87±1.0899.16±1.2415096.72±1.3298.80±1.2620095.98±1.2597.56±1.2025096.01±1.0597.86±1.3130095.93±1.1296.28±1.4250095.80±1.4395.64±1.301）75095.39±1.171）95.03±1.211）注：与空白组比较1）P0.01；2）表示质量浓度单位为μg·L-110.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T007表7CCK-8检测加味白头翁汤含药血清与RAW264.7细胞共孵育24 h后的细胞上清液对MC38细胞的增殖抑制作用 （x¯±s，n=3）Table 7Cytotoxic effect of cell supernatant from co-incubation of MBTWD containing serum with RAW264.7 cells for 24 hours on MC38 cells was detected by CCK-8 kit in vitro （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1细胞增殖活力/%24 h48 h空白组99.62±1.54101.14±1.23IL-4组203）98.85±2.06102.25±1.09加味白头翁汤含药血清组5092.45±1.871）88.47±1.161）10090.68±1.261）85.61±1.312）15086.46±1.212）81.09±1.222）20080.73±1.292）76.36±1.052）25075.49±1.412）72.82±1.292）30069.52±1.342）66.06±1.352）50067.75±1.322）64.96±1.872）75065.98±1.482）63.12±1.082）3.6　IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响及加味白头翁汤含药血清干预作用Transwell侵袭实验结果显示，与空白组比较，IL-4诱导的M2型巨噬细胞能显著增强MC38细胞侵袭能力（P0.01），而使用终浓度为100、250、500 μmol·L-1的加味白头翁汤含药血清进行给药干预后，MC38细胞侵袭能力则明显降低，见图4和表8。这表明加味白头翁汤含药血清能调控M2型巨噬细胞介导的MC38细胞侵袭能力改变。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.F004图4IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响及加味白头翁汤含药血清干预后的抑制作用 （吉姆萨染色，×200）Fig.4Effect of IL-4 induced M2 type macrophages on invasive ability of MC38 cells， while inhibited by intervention of MBTWD containing serum in vitro （Giemsa staining，×200）注：A.空白组；B.IL-4组；C.100 μmol·L-1；D.200 μmol·L-1；E.500 μmol·L-110.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T008表8加味白头翁汤含药血清对M2型巨噬细胞与MC38细胞共孵育后肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用 （x¯±s，n=3）Table 8Inhibitory effect of MBTWD containing serum on tumor invasion ability after co-incubation of M2 macrophages and MC38 cells in vitro （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1肿瘤细胞侵袭数/个空白组55.24±8.26IL-4组242.59±8.061）加味白头翁汤含药血清低剂量组100216.74±6.842）加味白头翁汤含药血清中剂量组250176.82±7.493）加味白头翁汤含药血清高剂量组500144.19±6.963）注：与空白组比较1）P0.01；与IL-4组比较2）P0.05，3）P0.013.7　加味白头翁汤含药血清对IL-4诱导的M2型巨噬细胞表型极化的抑制作用流式细胞术实验结果显示，RAW264.7细胞经IL-4诱导后M1型巨噬细胞膜上标记分子CD86表达不明显，而经终浓度为100、250、500 μmol·L-1的加味白头翁汤含药血清给药干预24 h后，可显著增强M1型巨噬细胞膜上标记分子CD86的表达，见增强出版附加材料和表9。这表明加味白头翁汤含药血清能调控M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化，也佐证了巨噬细胞具有显著可塑性。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T009表9加味白头翁汤含药血清发挥对IL-4诱导的M2型巨噬细胞表型重塑后CD86的表达变化Table 9Changes of CD86 expression after intervention of MBTWD containing serum on phenotype remodeling of M2 macrophages in vitro组别浓度/μmol·L-1CD86+巨噬细胞数/总细胞数/%空白组0.45±0.19加味白头翁汤含药血清低剂量组1006.23±1.121）加味白头翁汤含药血清中剂量组2507.18±0.981）加味白头翁汤含药血清高剂量组50010.63±1.811）注：与IL-4组比较1）P0.013.8　加味白头翁汤含药血清对巨噬细胞相关极化因子mRNA表达水平的影响体外建立IL-4诱导的M2型巨噬细胞培养体系，进一步使用肿瘤相关巨噬细胞功能阻滞剂后研究发现，与空白组比较，经CSF1R抑制剂（3 μmol·L-1）干预后能挽救巨噬细胞M1型极化相关分子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平（P0.01），降低M2型极化相关分子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平（P0.01），而经加味白头翁汤含药血清（250 μmol·L-1）干预或联合CSF1R抑制剂均能明显上调M1型极化相关分子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平（P0.05，P0.01），明显下调M2型极化相关分子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平（P0.05，P0.01），且二者具有协同效应，见表10和表11。这进一步证实了加味白头翁汤含药血清能诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T010表10加味白头翁汤含药血清对M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、iNOS、IL-12 的mRNA表达水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 10mRNA Expression levels of M1 type macrophage of polarization-related molecules CD86， iNOS， and IL-12 after intervention with MBTWD containing serum in vitro （x¯±s，n=6）组别浓度/μmol·L-1CD86iNOSIL-12空白组2.13±0.712.04±0.431.24±0.49CSF1R抑制剂组356.45±2.121，2）16.46±2.051）7.86±1.851）加味白头翁汤含药血清组25049.62±1.591）14.75±1.831）5.96±1.721）二者联合干预组71.72±1.681，3）21.85±1.741，3）9.78±1.541，2）注：与空白组比较1）P0.01；与CSF1R抑制剂组比较2）P0.05，3）P0.0110.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T011表11加味白头翁汤含药血清对M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10的mRNA表达水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 11mRNA Expression levels of M2 type macrophage of polarization-related molecules CD206， CD163， and IL-10 after intervention with MBTWD containing serum in vitro （x¯±s，n=6）组别浓度/μmol·L-1CD206CD163IL-10空白组34.52±1.2629.85±1.1519.96±1.21CSF1R抑制剂组318.74±1.281，2）23.96±1.041）13.49±1.021）加味白头翁汤含药血清组25021.81±1.471）24.72±1.171）13.98±1.461）二者联合干预组15.49±1.341，2）19.57±1.231，3）9.76±1.141，3）注：与空白组比较1）P0.01；与CSF1R抑制剂组比较2）P0.05，3）P0.013.9　加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R/STING-TBK1信号通路关键蛋白表达水平的影响Western blot实验结果显示，与模型组比较，加味白头翁汤干预组中，肿瘤相关巨噬细胞膜上免疫抑制性受体CSF1R蛋白表达水平明显降低（P0.05，P0.01）；同时，对于天然免疫信号通路中关键蛋白STING与核心转录因子TBK1蛋白表达影响则相反，加味白头翁汤能显著上调肿瘤组织中STING、TBK1蛋白表达水平（P0.01），见表12和图5。这表明加味白头翁汤发挥对结直肠癌生长抑制的效应机制与其调节CSF1R信号，进而活化STING-TBK1信号有关。10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.T012表12加味白头翁汤对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R、STING和TBK1蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 12Effect of MBTWD on expression of CSF1R， STING， and TBK1 protein in tumor tissue of MC38 xenograft mice after intervention （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1CSF1R/β-actinSTING/β-actinTBK1/β-actin模型组2.04±0.180.94±0.281.01±0.24L-OHP组3×10-31.74±0.131）1.73±0.232）0.99±0.21加味白头翁汤低剂量组23.431.69±0.141）1.98±0.172）2.19±0.272）加味白头翁汤高剂量组46.861.59±0.122）2.39±0.212）2.43±0.222）注：与模型组比较1）P0.05，2）P0.0110.13422/j.cnki.syfjx.20230815.F005图5MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R、STING和TBK1的蛋白表达电泳Fig.5Electrophoresis of protein expression of CSF1R， STING， and TBK1 in neoplasm tissue of MC38 xenograft mice after intervention with MBTWD4 讨论结直肠癌作为消化道上皮源异质性肿瘤，与肠道固有黏膜免疫系统交联密切，并与间叶细胞及细胞外活性介质共同构成肿瘤局部免疫微环境［17］。随着肿瘤免疫治疗业已成为当前晚期结直肠癌治疗瓶颈的前沿突破口［14］，中医药也在抑制肿瘤生长、调节肿瘤免疫正常化方面取得确切临床疗效［18］。中医药基于系统重塑肿瘤微生态的整体性、平衡性、多靶效应等特点正逐渐成为当下研究者的关注焦点，并逐渐成为结直肠癌多学科综合诊疗的重要手段之一［19］。加味白头翁汤以《伤寒论》白头翁汤为基础，融合扶正治癌药对黄芪、女贞子、藤梨根而成，诸药合用，共奏解毒散结、扶正抗癌之功。白头翁汤作为治疗肠道疾病的常用方剂［20］，现代药理学研究表明，白头翁汤具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节效应等诸多药理作用［11］。而黄芪、女贞子与藤梨根及各有效成分具有多途径抗肿瘤免疫调节效应，能增加肿瘤微环境中T细胞富集并促进TAMs向M1型复极化以发挥抗肿瘤作用［21-24］。基于多项结直肠癌单细胞测序转录本研究发现，TAMs是肿瘤微环境中浸润数量最多的免疫细胞亚型，且处在各细胞互作网络的核心环节，也往往预示着极差预后［24-25］。多项研究也证实TAMs介导膜上高表达抗炎作用的甘露糖受体CD206和清道夫受体CD163，多趋向为促瘤M2型巨噬细胞，通过调节细胞因子IL-6、TGF-β和CCL2分泌动态调节肿瘤免疫微环境重编程［26-27］。同时，TAMs具有高度的可塑性，可因生理或者病理环境重构其功能表型，从而发挥促瘤或抑癌作用［28-29］。因而，调控TAMs重编程，诱导TAMs由M2型向M1型复极化，重塑肿瘤抑制性免疫微环境，是增强结直肠癌临床疗效的潜在有效途径之一。首先，本研究通过使用MC38细胞株建立C57BL/6小鼠皮下结直肠癌移植瘤模型，探讨了加味白头翁汤对结直肠癌皮下移植瘤模型小鼠瘤体的抑制作用。实验结果表明，与模型组比较，加味白头翁汤能显著抑制荷瘤小鼠瘤体生长，且荷瘤小鼠的生存期最优，显示出良好地抗结直肠癌肿瘤生长活性。而HE染色结果也证实了加味白头翁汤能显著诱导肿瘤死亡而发挥抑制肿瘤生长的作用。在上述实验结果的基础上对其效应机制进一步分析发现，相比于模型组，加味白头翁汤组能显著增加肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润数量。基于此，笔者检测发现模型组肿瘤组织中有大量CD206+ TAMs浸润，这是造成模型组CD8+ T细胞浸润数量降低的原因之一。而经加味白头翁汤干预后肿瘤组织中CD206+ TAMs浸润数量显著降低，这表明加味白头翁汤可能通过调节CD206+ TAMs浸润数量，上调MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润数量，进而改善其肿瘤免疫微环境抑制性表型有关，这也暗示加味白头翁汤可能对TAMs表型极化有调节作用。同时，笔者研究也发现加味白头翁汤能显著下调荷瘤小鼠外周血清中TGF-β、IL-6、CCL2分泌水平，这更证实了加味白头翁汤调控TAMs表型变化及相关功能细胞因子分泌，增加肿瘤免疫微环境中CD8+ T细胞浸润水平。据此，本研究通过使用MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7细胞，建立了体外IL-4诱导的M2型巨噬细胞与MC38细胞共培养模型。先系统地探讨了加味白头翁汤含药血清的细胞增殖抑制作用，实验结果表明，加味白头翁汤含药血清对MC38细胞、RAW264.7细胞增殖活力无明显细胞增殖抑制作用，但不同浓度加味白头翁汤含药血清与RAW264.7细胞共孵育后的细胞上清液则能明显抑制MC38细胞的增殖活力，这表明加味白头翁汤含药血清能介导巨噬细胞活化功能抑制MC38细胞增殖活性。其次，笔者验证了经IL-4诱导的M2型巨噬细胞能显著增强MC38细胞的侵袭能力，但这一效应能被加味白头翁汤含药所逆转。同时，也证实了加味白头翁汤含药血清能显著增强M1型巨噬细胞膜上标记分子CD86的表达，这表明加味白头翁汤含药血清能调控M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化，从而发挥对MC38细胞增殖抑制作用与侵袭抑制作用。最后，通过使用CSF1R抑制剂进行功能挽救实验，证实了加味白头翁汤含药血清干预后巨噬细胞M1型极化相关分子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达上调，并降低了M2型极化相关分子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平，且与CSF1R抑制剂具有协同效应，这进一步证实了加味白头翁汤是通过诱导巨噬细胞由M2型向M1型复极化来发挥抗肿瘤免疫调节效应。越来越多地研究证实结直肠癌中CSF1R信号异常活化，不仅募集大量TAMs浸润并促其向M2型极化，分泌大量IL-6、IL-10、TGF-β等细胞因子，增加调节性T细胞和髓源抑制性细胞聚集，降低CD8+ T细胞浸润，促进肿瘤抑制性免疫微环境形成，诱导结直肠癌恶性侵袭与转移［30-32］。然而，驱动TAMs在结直肠癌中累积和表型转换的重编程机制仍尚不完全清楚。研究表明该信号通路中关键蛋白STING活化后能催化下游系列信号转导，发挥抗肿瘤免疫放大效应［33］。当上游信号分子催化STING磷酸化后，激活TANK结合激酶1（TBK1），诱导Ⅰ型干扰素和其他免疫应答基因表达［34-35］。已有研究证实，在结直肠癌中，STING信号功能缺失与患者的不良预后相关，激活STING信号能增强程序性死亡受体-1（PD-1）单抗治疗结局［36］。还有研究证实转染ctDNA入THP-1或RAW264.7细胞中能激活STING，进而引发其向M1型活化［37］。本实验进一步使用蛋白免疫印迹法检测调控TAMs相关活化信号关键蛋白表达的情况，结果表明加味白头翁汤能明显下调免疫抑制性受体CSF1R蛋白表达水平，而能显著上调天然免疫信号通路中关键因子STING、TBK1蛋白表达水平。这表明加味白头翁汤发挥上述抗肿瘤免疫调节效应与其调节CSF1R信号，进而活化STING-TBK1信号有关。综上所述，本研究结果初步明确了加味白头翁汤能在结直肠癌中发挥抗肿瘤免疫调节效应，进一步研究其作用机制可能是与加味白头翁汤抑制CSF1R信号活化，进而调节STING/TBK1信号活化，诱导TAMs由M2型向M1型复极化，进而增加肿瘤免疫微环境CD8+ T细胞浸润有关。本研究结果机制探讨具有潜在创新性，进一步丰富了海派中医“扶正治癌”学术思想论治结直肠癌的临床依据与科学内涵，扩展了基于经方白头翁汤加减用药在结直肠癌中的作用探讨及机制研究，尤其是与CSF1R抑制剂可能的协同效应，这为未来的机制研究提供了思考与方向。